李業(yè)瓊，葉山東，翟麗敏，胡　聞（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院.內(nèi)分泌科、.病理科，安徽合肥　3000）

二甲雙胍對(duì)2型糖尿病模型大鼠腎組織AGEs表達(dá)的影響

李業(yè)瓊1，葉山東1，翟麗敏1，胡聞2
（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院1.內(nèi)分泌科、2.病理科，安徽合肥230001）

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-4-26 11：06網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.042.html

目的觀察二甲雙胍（MET）對(duì)2型糖尿?。═2DM）模型大鼠腎組織非酶糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）及其受體（RAGE）mRNA表達(dá)的影響，探討MET對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)機(jī)制。方法用高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（STZ）建立2型糖尿病大鼠模型。模型大鼠隨機(jī)分組，給予二甲雙胍干預(yù)治療（MET組，300 mg·kg-1·d-1）、格列本脲干預(yù)（GLY組，5 mg·kg-1· d-1），并設(shè)立糖尿病模型組（T2DM組）和正常對(duì)照組（NC組）。給藥8周后，觀察各組大鼠血糖（BG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、尿素氮（BUN）、尿白蛋白和尿AGEs排泄的情況；免疫組化測(cè)腎小球AGEs蛋白表達(dá)；Real-time PCR檢測(cè)腎組織RAGE mRNA表達(dá)。結(jié)果8周末，MET組及GLY組BG、HbA1c、FINS、尿白蛋白/尿肌酐（UACR）、基底膜厚度（GBMT）明顯低于T2DM組，高于NC組（P＜0.05），MET組與GLY組BG、HbA1c和FINS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；MET組尿AGEs/尿肌酐（UGCR）、腎組織AGEs蛋白和RAGE mRNA表達(dá)明顯低于糖尿病模型組（P＜0.05），但比NC組高（P＜0.05）；MET組UGCR、腎組織AGEs和RAGE mRNA表達(dá)低于GLY組（P＜0.05）。結(jié)論MET可減少AGEs在糖尿病大鼠腎組織的積累，并下調(diào)糖尿病大鼠腎組織RAGE mRNA的過度表達(dá)，該作用可能與其腎臟保護(hù)作用有關(guān)。

2型糖尿?。惶悄虿∧I?。欢纂p胍；AGEs；RAGE；格列本脲

在慢性高糖狀態(tài)非酶糖基化終末產(chǎn)物（advanced glyclation end-products，AGEs）形成增加，并且AGEs多肽在糖尿病患者的腎臟中清除受到影響，導(dǎo)致體內(nèi)AGEs水平的進(jìn)一步升高，AGEs在腎臟局部組織的積聚可通過多種直接和間接的機(jī)制導(dǎo)致腎臟損傷［1］，在糖尿病腎病的發(fā)生中發(fā)揮重要的作用。二甲雙胍（metformin，MET）作為治療2型糖尿病的一線首選藥物，除降糖作用，尚可預(yù)防和延緩糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展［2］。本研究通過觀察二甲雙胍對(duì)2型糖尿病大鼠腎組織AGEs的表達(dá)及經(jīng)尿排泄的影響，初步探討其對(duì)腎臟保護(hù)作用及其機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器設(shè)備DFM-96型10管放射免疫計(jì)數(shù)儀，購于安徽合肥眾成機(jī)電公司；DS-5型糖化血紅蛋白檢測(cè)儀，購于英國DREW公司；胰島素放射免疫試劑盒，購于北京原子高科公司；ABI 7500型擴(kuò)增儀，購于美國Bio-Rad公司；NDl000紫外/分光光度儀，購于美國Nano-Drop公司；DG-3022A型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，購于江蘇南京國營華東電子管廠。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康清潔級(jí)♂ SD大鼠42只，2月齡，體質(zhì)量180～200 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（scxk皖2011～002）。在飼養(yǎng)期間，12 h交替照明，室溫（19±1）℃，相對(duì)濕度48%，大鼠自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.1.3藥物與試劑白蛋白放射免疫試劑盒，購于天津市協(xié)和公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），美國Sigma公司；二甲雙胍，購于上海施貴寶公司；格列本脲（glyburide，GLY），天津太平洋公司；尿素氮、肌酐試劑盒，南京建成科技公司；AGEs免疫組化試劑盒，購于武漢博士德生物工程有限公司；胰島素放射免疫試劑盒，購于北京原子高科公司；尿AGEs ELISA試劑盒，購于上海艾來薩生物科技公司；PCR試劑盒及引物、TRIzol均購于大連TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.12型糖尿病模型大鼠的制備健康清潔級(jí)♂SD大鼠42只，隨機(jī)分成兩組：模型組（DM組，n =33），給予高脂飲食（常規(guī)飼料加10%豬油、2%膽固醇）；正常對(duì)照組（NC組，n=9），普通飼料喂養(yǎng)。高脂飲食1個(gè)月后，測(cè)血漿胰島素水平（fasting insulin，F(xiàn)INS）和空腹血糖（fasting peripheral blood glu-cose，F(xiàn)BG），并且計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-Ir）［HOMA-Ir=（FBG×FINS）/22.5］。給予STZ 30 mg· kg-1（溶解于現(xiàn)配制的0.1 mmol·L-1枸櫞酸緩沖液中，pH=4.4）腹腔內(nèi)一次性注射。正常對(duì)照組大鼠注射等量枸櫞酸緩沖液。1周后測(cè)隨機(jī)血糖，血糖≥16.7 mmol·L-1，且伴胰島素抵抗者為T2DM大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2動(dòng)物給藥及分組方法29只SD大鼠造模成功，將大鼠隨機(jī)分為3組：糖尿病組（T2DM組，n= 11，后期死亡1只）；二甲雙胍治療組（300 mg·kg-1·d-1，MET組，n=9）；格列本脲組（5 mg·kg-1· d-1，GLY組，n=9）。NC組及T2DM組給予等量的生理鹽水。于每日清晨灌胃給藥1次，高脂飼料，共8周。

1.2.3標(biāo)本收集干預(yù)治療后8周末，對(duì)代謝籠12 h尿液進(jìn)行收集，并準(zhǔn)確計(jì)量，留取5 mL混勻后的尿液，置于-40℃冰箱待測(cè)尿肌酐（urine creatinine，Ucr）、尿白蛋白（urinary albumin，UAlb）和尿AGEs。收集尿標(biāo)本后，用10%的水合氯醛對(duì)各組大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，麻醉后行腹主動(dòng)脈插管采血法收集血標(biāo)本，測(cè)FBG、FINS、糖化血紅蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）及血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）。最后取雙側(cè)腎組織用生理鹽水反復(fù)灌洗除去包膜，右側(cè)腎組織放于液氮保存，用于日后做Real-time PCR；左腎制成石蠟切片，留日后觀察大鼠腎組織的病理變化。

1.3檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1免疫組化測(cè)腎組織AGEs的表達(dá)載玻片防脫片處理，石蠟切片脫蠟水化，微波抗原修復(fù)，滅活內(nèi)源性酶，滴加封閉液，滴加經(jīng)稀釋的一抗（兔IgG 1∶200），4℃過夜，PBS洗，再滴加聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG（SV-0002）二抗，室溫孵育30 min。DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，觀察。于400倍鏡下進(jìn)行拍照，且每張切片取3個(gè)視野。用全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)（Image pro plus 6.0）對(duì)每張圖片中陽性反應(yīng)部位的累積光密度（integral optegral density，IOD）進(jìn)行測(cè)定，從而得到每張切片中AGEs陽性物質(zhì)的相對(duì)含量，用AGEsIOD表示。

1.3.2生化指標(biāo)的檢測(cè)尿AGEs采用ELISA法，尿白蛋白采用放射免疫分析法，血尿素氮采用尿酶法，尿肌酐采用苦味酸比色法。尿AGEs和尿白蛋白排泄分別用尿AGEs肌酐比［urinary AGEs/urine creatinine，UGCR（pg·g-1）］和尿白蛋白肌酐比［urinary albumin/urine creatinine，UACR（mg·g-1）］，以排除由尿液稀釋造成的影響。

1.3.3Real-time PCR測(cè)腎組織RAGE mRNA的表達(dá)腎組織的RNA采用TRIzol法提取；取2μg的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；cDNA產(chǎn)物進(jìn)行Realtime PCR。RAGE引物序列上游引物：5'-CAGGGTCACAGAAACCGG-3'，下游引物：5'-ATTCAGCTCTGCACGTTCCT-3'；β-actin引物序列上游引物：5'-GCCTTAGCCTGGACCCATAG-3'，下游引物：5'-GACCACCAATCCACACAGA-3'。使用ABI7500型擴(kuò)增儀，采用20 μL反應(yīng)體系熒光染料法：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s；60℃退火34 s；72℃延伸1 min的熱循環(huán)40次；95℃15 s、60℃1 min與95℃15 s循環(huán)1次。目的和內(nèi)參片段分別同批擴(kuò)增，每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，運(yùn)用ΔΔCt法分析Ct值，2-ΔΔCt表示目的基因mRNA表達(dá)拷貝數(shù)和β-actin拷貝數(shù)的比值。

1.3.4電鏡處理透射電鏡下，取1 mm3大小的腎皮質(zhì)；用2.5%戊二醛固定，制成超薄切片；將超薄切片置于高倍鏡下（×10 000）采集10個(gè)視野，并隨機(jī)觀察和測(cè)量8處腎小球基底膜的厚度（glomerular basement membrane thickness，GBMT）并取平均值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，用±s表示。多組間比較運(yùn)用方差分析，方差齊性者用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行兩兩比較，用SNK檢驗(yàn)；方差不齊者采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠一般生化指標(biāo)比較8周末，各組糖尿病大鼠的血BG、HbA1c、FINS及BUN水平均明顯比NC組高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與T2DM組相比，MET組和GLY組上述指標(biāo)明顯下降（P＜0.05），但MET組與GLY組之間BG、HbA1c值差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而兩組之間的BUN水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見Tab 1。

2.2各組大鼠UGCR、UACR的比較與NC組相比，各組糖尿病大鼠UGCR和UACR明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與T2DM組相比，MET組和GLY組UGCR及UACR值明顯降低（P＜0.05）；與GLY組相比，MET組UGCR和UACR明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見Tab 1。

2.3各組大鼠腎組織AGEs蛋白表達(dá)的變化與NC組比較，其余各組腎組織AGEsIOD水平均明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與T2DM組相比，MET組及GLY組腎組織AGEsIOD水平明顯降低，且MET較GLY組下降水平更明顯，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見Fig 1和Tab 2。

Tab 1　Biochemical characteristics of diabetic rats after eight weeks（±s）

Tab 1　Biochemical characteristics of diabetic rats after eight weeks（±s）

*P＜0.05 vs NC；△P＜0.05 vs T2DM；#P＜0.05 vs MET

Group　n　BG/mmol·L-1　HbA1c/%　BUN/mmol·L-1　FINS/mU·L-1　UACR/mg·g-1　UGCR/pg·g-1NC　9　4.45±1.07　4.13±0.89　6.91±2.52　17.53±3.42　0.25±0.66　44.16±7.44 T2DM　10　15.6±1.56*　12.41±0.61*　18.95±0.98*　28.16±4.98*　2.86±0.10*　188.63±13.89*MET　9　11.75±0.98*△　8.78±0.32*△　11.30±2.02*△　22.08±2.61*△　1.80±0.08*△　63.50±10.05*△GLY　9　11.78±1.43*△　8.85±1.07*△　14.03±2.55*△#　22.89±0.15*△　2.37±0.12*△#　83.16±9.13*△#

Fig 1　Immunohistochemical staining for AGEs（×400）

Fig 2　Histopathological changes of renal tissue under electron microscopy among four groups（×10 000）

2.4各組大鼠腎組織RAGE mRNA表達(dá)的變化

與NC組相比，T2DM組腎組織RAGE mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與T2DM組相比，MET及GLY干預(yù)組腎組織RAGE mRNA表達(dá)明顯降低，且MET組腎組織RAGE mRNA表達(dá)量明顯低于GLY組（P ＜0.05）。見Tab 2。

2.5各組大鼠GBMT的變化與NC組比較，T2DM 組GBMT明顯增厚，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MET組、GLY組GBMT較T2DM組明顯減低（P＜0.05）；GLY組與MET組比較，MET組GBMT改善更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見Fig 2和Tab 2。

Tab 2　Expressions of AGEs，RAGE mRNA and GBMT of diabetic rats after eight weeks（±s）

Tab 2　Expressions of AGEs，RAGE mRNA and GBMT of diabetic rats after eight weeks（±s）

*P＜0.05 vs NC；△P＜0.05 vs T2DM；#P＜0.05 vs MET

Group　n　GBMT/nm　AGEsIOD　RAGEmRNANC　9　106.00±10.23　11.90±2.37　1.00±0.18 T2DM　10　266.58±21.68*　116.26±19.99*　26.65±0.63*MET　9　150.98±17.25*△　37.14±14.03*△　1.67±0.66*△GLY　9　203.67±23.32*△#54.39±11.45*△#　1.96±0.03*△#

3　討論

AGEs是持續(xù)高血糖狀態(tài)下非酶糖基化反應(yīng)形成的終末產(chǎn)物，近年來研究認(rèn)為AGEs在腎臟局部堆積可通過多種直接和間接的途徑參與糖尿病腎?。―N）的發(fā)生和發(fā)展［2］。在糖尿病患者的腎臟中AGEs的大量聚集，刺激系膜細(xì)胞表面的 AGEs受體，使層黏連蛋白及其它腎小球系膜結(jié)構(gòu)蛋白明顯增加，最終致系膜區(qū)擴(kuò)張，腎小球基膜增厚，加速腎小球硬化［1］。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠腎組織AGEs蛋白和RAGE mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，尿AGEs排泄明顯增加，提示糖尿病大鼠腎組織AGEs聚集增加，并誘導(dǎo)RAGE的表達(dá)，參與DN的發(fā)生。

二甲雙胍作為治療2型糖尿病的首選抗糖尿病藥物［3］，喬進(jìn)等［4］的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二甲雙胍可使大鼠血清AGEs含量明顯下降。Ishibashi等［5］研究顯示，二甲雙胍可有效抑制腎小管細(xì)胞AGEs形成及其誘導(dǎo)的RAGE表達(dá)，進(jìn)而減輕其損傷。李友元等［6］報(bào)道二甲雙胍可降低腎臟組織RAGE mR-NA的過度表達(dá)，抑制AGEs的結(jié)合位點(diǎn)及腎組織蛋白的非酶糖基化作用，從而阻斷AGEs與其受體作用所介導(dǎo)的一系列信號(hào)通路［7］。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：經(jīng)二甲雙胍和格列本脲干預(yù)8周后，二甲雙胍干預(yù)組及格列本脲組GBMT及UACR均低于2型糖尿病模型組，MET組低于格列本脲組，但2組血糖和HbA1c水平無明顯差異，提示二甲雙胍在相似降血糖的情況下，其腎臟保護(hù)作用優(yōu)于格列本脲。進(jìn)一步觀察顯示二甲雙胍組糖尿病大鼠尿AGEs排泄明顯減少，腎組織AGEs蛋白表達(dá)和RAGE mRNA表達(dá)明顯降低，且其降低程度優(yōu)于格列本脲組，提示二甲雙胍具有降糖之外減少2型糖尿病大鼠腎臟AGEs的形成和抑制RAGE mRNA表達(dá)的作用，進(jìn)而減輕腎臟損害。二甲雙胍降低糖尿病腎組織AGEs表達(dá)的機(jī)制尚不明確，有研究者發(fā)現(xiàn)二甲雙胍抑制腎臟組織AGEs的形成可能與其減輕氧化應(yīng)激有關(guān)［8］，而氧化應(yīng)激是DN發(fā)病的中心環(huán)節(jié)［2］。近期龐若宇等［9］研究指出AGEs可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而二甲雙胍可以起到抗凋亡作用，其機(jī)制可能通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），抑制NF-κB的激活及活性氧族的生成有關(guān)。有研究報(bào)道二甲雙胍可以通過激活A(yù)MPK并抑制AGEs和NADPH氧化酶的生成，使體外培養(yǎng)的足細(xì)胞中活性氧自由基含量降低，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用［10-11］。

本實(shí)驗(yàn)初步研究結(jié)果顯示，二甲雙胍可抑制糖尿病大鼠腎臟組織蛋白非酶糖基化產(chǎn)物反應(yīng)，降低AGEs生成和腎組織RAGE mRNA表達(dá)，該作用可能與其腎臟保護(hù)部分有關(guān)，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Effects of metformin on expression of renal tissue AGEs in type 2 diabetic rats

LI Ye-qiong1，YE Shan-dong1，ZHAI Li-min1，HU Wen2
（1.Dept of Endocrinology，2.Dept of Pathology，Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University，Hefei230001，China）

AimsTo observe the influences of metformin（MET）on the expression of renal tissue advanced glyclation end-products（AGEs）protein and its receptor mRNA（RAGE mRNA）in type 2 diabetes mellitus（T2DM）model rats，and to discuss the mechanism of the MET in the treatment of diabetic nephrop-athy（DN）.MethodsThe rat model of T2DM was established by fed with high-fat diet and intraperitoneal injection of low-dose of streptozotocin（STZ）.All rats were randomly divided into metformin group（MET，300 mg·kg-1·d-1），glyburide group（GLY，5 mg·kg-1·d-1），T2DM model group（T2DM）and normal control group（NC）.After 8 weeks’observation，blood glucose（BG），glycated hemoglobin（HbA1c），blood urea nitrogen（BUN），urinary albumin，urinary AGEs and urine creatinine were detected.The expression of renal tissue AGEs was detected by immunohistochemistry assay，and the expression of RAGE mRNA was measured by real-time PCR.ResultsThe levels of BG，HbA1c， urinaryalbumin/urinecreatinine （UACR），glomerular basement membrane thickness （GBMT）in MET group and GLY group were signifi-cantly lower than those of T2DM group，while higher than those of NC group（P＜0.05），the levels of BG，F(xiàn)INS and HbA1c were not statistically significant between MET and GLY group（P＞0.05）.The urinary AGEs/urine creatinine（UGCR），the expressions of renal tissue AGEs and RAGE mRNA in MET group and GLY group were significantly decreased compared with those of T2DM group（P＜0.05），but higher than those of NC group（P＜0.05）.The UGCR，the expressions of AGEs and RAGE mRNA in MET group were lower than those of GLY group（P＜0.05）.ConclusionMET can reduce the accumulation of AGEs in the renal tissue，and down-regulate the over-expression of RAGE mRNA in T2DM rats.

type 2 diabetes；diabetic nephropathy；metformin；AGEs；RAGE；glyburide

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.021

A

1001-1978（2016）05-0703-05

R-332；R322.61；R587.1；R692.39；R977.15

2015-12-30，

2016-01-25

安徽省高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（No KJ2011A157）；安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 1508085SMH227）

李業(yè)瓊（1990-），女，碩士生，研究方向：糖尿病及代謝疾病，E-mail：lyq0564@163.com；葉山東（1964-），男，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向：糖尿病及代謝疾病，通訊作者，E-mail：ysd196406@163.com