向虹雨，李勝男，曾　茜，張　曉，梁　楠

脊髓損傷后水通道蛋白-4在脊髓白質(zhì)中的表達①

向虹雨，李勝男，曾茜，張曉，梁楠

目的探討脊髓挫傷（SCC）后水通道蛋白-4（AQP-4）在脊髓白質(zhì)中的表達變化。方法成年健康雌性Sprague-Dawley大鼠88只，隨機分為假手術(shù)組（Sham）和SCC組。Allen打擊法建立SCC模型，BBB評分評價大鼠運動功能變化情況；免疫組織化學(xué)染色檢測AQP-4在脊髓白質(zhì)中不同時間點的定位情況；Q-PCR檢測AQP-4 mRNA含量變化。結(jié)果SCC組BBB評分明顯降低，損傷后7 d和14 d明顯升高（t＞5.061，P＜0.01）。Q-PCR結(jié)果顯示，術(shù)后1 d和3 dAQP-4 mRNA表達顯著下降（t＞50.44，P＜0.001），損傷后5 d，AQP-4 mRNA表達水平較3 d明顯上升（t=-3.968，P=0.001），直至28 d仍明顯高于3 d（t=-4.227，P=0.001）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，AQP-4主要定位于脊髓白質(zhì)的血管內(nèi)皮細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的突起。結(jié)論SCC后，AQP-4可能在脊髓損傷后不同時期發(fā)揮不同的病理生理作用。

脊髓挫傷；水腫；水通道蛋白-4；大鼠

［本文著錄格式］向虹雨，李勝男，曾茜，等.脊髓損傷后水通道蛋白-4在脊髓白質(zhì)中的表達［J］.中國康復(fù)理論與實踐，2016，22（4）：428-432.

CITED AS：Xiang HY，Li SN，Zeng X，et al.Expression of aquaporin-4 in white matter of spinal cord in rats after spinal cord contusion［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（4）：428-432.

脊髓損傷（spinal cord injury）是一種可致殘性的創(chuàng)傷，分為原發(fā)性脊髓損傷和繼發(fā)性脊髓損傷。脊髓水腫為一種繼發(fā)性損傷，其形成和消除與水通道蛋白（aquaporin，AQP）的表達水平有關(guān)［1］。AQP是一族跨膜蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)13個亞型，其中AQP-4在腦和脊髓損傷后水腫中發(fā)揮重要的作用，它與腦脊液的重吸收、滲透壓的調(diào)節(jié)、腦水腫的形成等有密切的關(guān)系，也有加速星形膠質(zhì)細胞的移行、促進電興奮細胞的神經(jīng)信號傳導(dǎo)功能等作用［2-8］。

AQP-4分布較廣泛，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是星形膠質(zhì)細胞的終足和血管內(nèi)皮細胞［9］。許多研究表明，無論是腦還是脊髓損傷后AQP-4的表達都會發(fā)生明顯變化，從而影響組織中的血管源性水腫和細胞毒性水腫的發(fā)生和發(fā)展［10-15］。然而，目前對于脊髓挫傷（spinal cord contusion，SCC）后AQP-4在白質(zhì)中的定位與基因變化情況尚未闡明。本實驗通過建立大鼠SCC模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和定量-聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，Q-PCR）等技術(shù)觀察SCC后AQP-4在脊髓白質(zhì)中不同時間點的表達和變化，為進一步研究AQP-4的表達變化對脊髓組織的損傷及恢復(fù)的影響提供實驗依據(jù)。

1　材料和方法

1.1動物分組

健康成年Sprague-Dawley大鼠88只，雌性，體質(zhì)量200～220 g，購于四川大學(xué)實驗動物中心，合格證號SYXK2005-0004。采用隨機數(shù)字表法隨機分為假手術(shù)組（Sham）和脊髓頓挫損傷（SCC）術(shù)后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、28 d組，其中Sham組16只；SCC組術(shù)后6 h、12 h各3只，其他時間點各11只。

Sham組和SCC組術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d各5只動物分別進行神經(jīng)功能評分后，3只動物用于免疫組織化學(xué)染色，8只動物用于Q-PCR檢測；6 h、12 h組3只動物均用于免疫組織化學(xué)染色。

1.2試劑與儀器

PBS緩沖液，批號ZLI-9062：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。羊血清，批號10210-064：INVITROGEN公司。AQP-4抗體，批號ab46182：ABCAM公司。PV-9000試劑，批號PW140612：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。GZX-GF-MBS-3（9203A）電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進醫(yī)療器械有限公司。YC-2型層析實驗冷柜：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。Exceed-E-UP純水儀：艾柯公司。DNP-9022-1A電熱恒溫培養(yǎng)箱：常州首創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司。自制數(shù)字式脊髓損傷打擊器。

1.3模型制備

3.6%水合氯醛40 mg/kg腹腔注射麻醉，備皮，常規(guī)消毒。以T10為中心，縱行切開皮膚及皮下組織，分離椎旁肌肉并暴露棘突與椎板，咬除T9椎板，模仿Allen法用自行加工設(shè)計的打擊裝置制備動物模型，即10 g沖擊棒自30 mm高處自由墜落打擊脊髓，依次縫合傷口。術(shù)后腹腔注射青霉素8萬U，并協(xié)助大鼠排尿，每天早晚各1次，持續(xù)1～2周，至大鼠恢復(fù)反射性排尿。在此期間注意觀察皮膚有無壓瘡或感染、下肢有無潰爛。Sham組大鼠僅剝離相應(yīng)椎板，并不損傷脊髓即縫合傷口。所有動物飼養(yǎng)室溫維持在25～ 30℃，正常飲食飼養(yǎng)。實驗動物大鼠的模型操作和術(shù)后護理遵循中國實驗動物保護和倫理委員會的規(guī)定，并與美國國立衛(wèi)生與健康研究院的指南一致。

1.4神經(jīng)行為學(xué)評價

采用BBB評分（Basso-Beattie-Bresnahan）于手術(shù)當天及術(shù)后1 d、3 d、7 d及14 d對Sham組和SCC組大鼠進行后肢運動行為學(xué)評分，總分0～21分，完全功能缺失為0分，完全正常為21分。

1.5 Q-PCR

大鼠脊髓損傷后于相應(yīng)的時間點取材，即大鼠麻醉后以損傷段為中心，取出損傷段脊髓5 mm，將取得組織放入冰水中，棄其軟脊膜后，移入1.5 ml EP管中于-80℃冰箱保存。TRIzol試劑（每30～50 mg脊髓組織加1 ml TRIzol）提取總RNA，用兩步法逆轉(zhuǎn)錄合成DNA（引物序列如表1）。AQP-4 PCR反應(yīng)體系25 μl：95℃，3 min后，95℃變性15 s、53℃退火30 s、60℃延伸30 s，共45個循環(huán)PCR反應(yīng)，最后60℃總延伸30 s后采集熒光。以β-actin為內(nèi)參照，1 ml/L瓊脂糖凝膠電泳，10倍上樣緩沖液載樣，溴化乙錠（EB）顯色，電壓110 V，時間25 min。紫外光透射下掃描凝膠，并進行圖像分析。

表1　引物序列

1.6免疫組織化學(xué)染色

大鼠灌注取材后脫水、包埋，制備石蠟切片5 μm，采用PV-9000兩步法進行免疫組織化學(xué)染色。切片經(jīng)過梯度酒精水化后，3%H2O2預(yù)處理10 min，封閉內(nèi)源性過氧化酶，0.01 mol/L PBS漂洗10 min，共3次；正常山羊血清在37℃溫箱中封閉非特異性抗原10 min。加AQP-4一抗（rabbit，1∶100），4℃過夜，次日用PV-9000試劑A液和B液分別在37℃中孵育15 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分色，脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡400×下觀察免疫陽性反應(yīng)物表達分布情況。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。本實驗所有數(shù)據(jù)均采用（xˉ±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，使用Levene方法進行方差齊性檢驗。顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

2.1 BBB評分

Sham組各時間BBB評分為21分。大鼠SCC后1 d，BBB評分較Sham組明顯降低，隨后BBB評分隨時間延長呈上升趨勢。大鼠SCC后7 d、14 d BBB評分較1 d明顯升高（P＜0.01）。見表2。

表2　SCC后大鼠BBB評分

2.2AQP-4 mRNA

AQP-4 mRNA表達水平在損傷后顯著下降，損傷后1 d降至最低（P＜0.001）。損傷后5 d，AQP-4 mRNA表達水平相比于3 d明顯上升（P＜0.01），直至28 d仍明顯高于3 d（P＜0.01）。見表3。

2.3AQP-4在脊髓白質(zhì)的表達定位

在脊髓白質(zhì)區(qū)，AQP-4陽性反應(yīng)物主要分布于神經(jīng)膠質(zhì)細胞突起和血管內(nèi)皮細胞，尤其是星形膠質(zhì)細胞的突起染色較深，少突膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞也可見少量AQP-4的棕色陽性產(chǎn)物。SCC后6 h，AQP-4在脊髓白質(zhì)中血管內(nèi)皮細胞和星形膠質(zhì)細胞的棕色反應(yīng)物顏色變淺；SCC后12 h，血管內(nèi)皮細胞的棕色反應(yīng)物顏色明顯比星形膠質(zhì)細胞深；損傷后1～3 d，膠質(zhì)細胞中棕色反應(yīng)物明顯減少，血管周圍棕色反應(yīng)物增加。從損傷后7 d開始，血管內(nèi)皮細胞的AQP-4陽性反應(yīng)物明顯減少，而在膠質(zhì)細胞突起有所增加；直到第28 d，AQP-4在膠質(zhì)細胞和血管內(nèi)皮細胞的表達基本恢復(fù)到Sham組水平。見圖1。

3　討論

本實驗建立了大鼠SCC模型，BBB評分證明損傷模型制備成功，Q-PCR技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)分別觀察AQP-4的基因表達和定位改變；結(jié)果表明SCC早期AQP-4基因表達下降且蛋白主要表達于脊髓白質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)細胞的突起和血管內(nèi)皮細胞，而晚期AQP-4基因表達增加但蛋白在血管內(nèi)皮的表達明顯減少，提示了AQP-4在SCC后不同時期可能發(fā)揮不同的病理生理作用。

3.1 SCC后AQP-4在脊髓白質(zhì)的表達與定位變化

脊髓損傷后AQP-4在脊髓組織中的表達定量與定位均有明顯變化。Q-PCR結(jié)果顯示，SCC后AQP-4在大鼠脊髓組織中的表達早期下降而后有所升高。此外，本項目采用組織芯片技術(shù)制備組織切片，使我們能夠在同一張石蠟切片上觀察不同時間點的脊髓組織，以排除免疫組織化學(xué)染色實驗對研究結(jié)果的干擾，連續(xù)觀察SCC后AQP-4表達的時空變化。結(jié)果顯示，AQP-4在正常脊髓白質(zhì)的血管內(nèi)皮細胞和星形膠質(zhì)細胞的突起均有表達，表明AQP-4對維持脊髓正常生理功能起到一定作用；SCC后6 h，白質(zhì)中AQP-4在血管內(nèi)皮細胞和星形膠質(zhì)細胞的表達水平降低；損傷后12 h，AQP-4在血管內(nèi)皮細胞表達相較于星形膠質(zhì)細胞有所增加；損傷后1～3 d，AQP-4在星形膠質(zhì)細胞中的表達繼續(xù)下降，且在血管內(nèi)皮細胞表達進一步增加。然而，從第7天開始，AQP-4在血管內(nèi)皮細胞表達顯著減少，但在膠質(zhì)細胞突起表達增加，表明7 d后AQP-4主要表達在膠質(zhì)細胞的突起。

目前，已有大量實驗證明，脊髓損傷后AQP-4在脊髓組織中的表達有明顯變化。Nesic等建立了SCC模型，定量定位研究SCC前后AQP-4的表達情況，并對水含量進行測量，結(jié)果表明SCC前后隨著水含量的改變，AQP-4的表達在時間和空間上均發(fā)生變化［16］。Lan等研究發(fā)現(xiàn)，AQP-4在腦損傷中表達也會隨著腦含水量的改變而改變［17］。此外，Papadopoulos等也證明AQP-4在脊髓水腫的病理生理過程中起重要作用，小鼠脊髓壓迫性損傷后，脊髓水腫程度改變的同時，AQP-4的表達與定位均發(fā)生變化［12］。

表3　AQP-4 mRNA在脊髓組織中的相對表達量（n=8）

圖1　AQP-4在脊髓白質(zhì)的表達（免疫組織化學(xué)，400×）

3.2 AQP-4在脊髓損傷中的作用可能隨時間推移發(fā)生改變

在本研究中，我們觀察到在SCC后脊髓白質(zhì)中的AQP-4在血管內(nèi)皮細胞的表達逐漸增加后又逐漸減少的同時，膠質(zhì)細胞突起的AQP-4表達減少后明顯增加，這提示SCC后AQP-4在不同時期可能在不同的部位行使不同的功能。目前，有許多研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，存在兩種水腫形式即血管源性水腫和細胞毒性水腫，而AQP-4作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的AQP可能同時參與兩種水腫的發(fā)生或發(fā)展。Papadopoulos等建立小鼠腦水腫模型，證明AQP-4基因缺乏小鼠的腦血管源性水腫較野生型小鼠有明顯加重［18］。Bloch等也證明AQP-4對組織間隙中多余水分的消除起重要作用［19］。Zador等建立小鼠腦損傷模型，證明腦損傷導(dǎo)致腦組織間隙水含量顯著增加，且AQP-4基因敲除小鼠的腦組織間隙水含量顯著增加；由此推測脊髓損傷后AQP-4在血管內(nèi)皮的大量表達對脊髓組織血管源性水腫的消除可能有重要作用［20］。而Saadoun等發(fā)現(xiàn)在AQP-4基因缺乏型小鼠中腦損傷后腦細胞水腫加?。?1］。此外，還有大量研究證明AQP-4促進腦或脊髓損傷后細胞毒性水腫的發(fā)生［22-26］。值得注意的是，也有研究表明AQP-4在人腦損傷后，腦細胞內(nèi)外水含量的調(diào)節(jié)起重要作用［27］。因此我們認為AQP-4在星形膠質(zhì)細胞表達的增加可能直接導(dǎo)致細胞毒性水腫的發(fā)生。

綜上所述，AQP-4會在脊髓損傷后的不同時期不同部位表達，因此AQP-4可能對脊髓損傷的不同時期產(chǎn)生不同作用。

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Expression ofAquaporin-4 in White Matter of Spinal Cord in Rats after Spinal Cord Contusion

XIANG Hong-yu，LI Sheng-nan，ZENG Xi，ZHANG Xiao，LIANG Nan
Center for Experimental Technology for Preclinical Medicine，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，Sichuan，China
Correspondence to LIANG Nan.E-mail：liangnan_1999_0@163.com

Objective To explore the expression of aquaporin（AQP）-4 in white matter of spinal cord after spinal cord contusion（SCC）. Methods 88 adult Sprague-Dawley rats were assigned randomly to sham operation group and SCC group.The model was established by Allen's method.BBB sore was used to assess the motor function of rats.The relative expression of AQP-4 mRNA was determined by Q-PCR technique.The localization of AQP-4 was observed by immunohistochemistry.Results BBB score showed motor dysfunction in SCC group，and it increased 7 and 14 days after SCC（t＞5.061，P＜0.001）.The level of AQP-4 mRNA decreased on the 1st and 3rd days（t＞50.44，P＜0.001），and increased on the 5th day（t=-3.968，P=0.001），and lasted until the 28th day（t=-4.227，P=0.001）compared with that on the 3rd day.The immunohistochemistry showed AQP-4 was located on the process of glial cell and vascular endothelial cells in white matter of spinal cord.ConclusionAQP-4 may play various roles at different stages in SCC.

spinal cord contusion；edema；aquaporin-4；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.04.012

R651.2

A

1006-9771（2016）04-0428-05

四川省級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（No.201313705030）。

成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心，四川成都市610500。作者簡介：向虹雨（1993-），男，漢族，四川蒼溪縣人，本科生。通訊作者：梁楠，女，漢族，碩士，講師，主要研究方向：中樞神經(jīng)損傷相關(guān)機制與治療。E-mail：liangnan_1999_0@163.com。

（2015-11-02

2015-12-10）