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        在體大鼠腦部核團的微電極記錄偶聯(lián)行為學康復實驗模型方法的建立①

        2016-09-07 03:30:47張晟豪葛順楠武松燕王學廉劉朝暉
        中國康復理論與實踐 2016年4期
        關鍵詞:信號

        張晟豪,李 楠,葛順楠,李 洋,武松燕,王學廉,劉朝暉

        在體大鼠腦部核團的微電極記錄偶聯(lián)行為學康復實驗模型方法的建立①

        張晟豪1a,李楠1a,葛順楠1a,李洋1a,武松燕1b,王學廉1a,劉朝暉1b

        目的建立在體大鼠腦部核團的微電極記錄及行為學偶聯(lián)模型。方法將大鼠背部留置管連接固定裝置改進后置于大鼠背部皮下,為大鼠的相關腦部核團埋置陣列微絲電極,將神經(jīng)電生理采集系統(tǒng)與自身給藥行為學系統(tǒng)進行信號對接,通過自身給藥訓練使大鼠成癮,在大鼠成癮的不同狀態(tài)下進行相關腦部核團的電生理信號記錄。結果與結論經(jīng)過改進后的留置管連接固定裝置有較好的性能,脫管漏管的現(xiàn)象大幅度降低,自身給藥系統(tǒng)與電生理采集系統(tǒng)對接后信號傳輸穩(wěn)定,實現(xiàn)了大鼠腦部相關核團在自身給藥行為發(fā)生過程中的神經(jīng)電生理信號的同步采集。

        微電極記錄;自身給藥;腦功能;康復;神經(jīng)生理

        [本文著錄格式]張晟豪,李楠,葛順楠,等.在體大鼠腦部核團的微電極記錄偶聯(lián)行為學康復實驗模型方法的建立[J].中國康復理論與實踐,2016,22(4):399-403.

        CITED AS:Zhang SH,Li N,Ge SN,et al.Establishment of a model in rat brain nuclei microelectrode recording coupled behavioristics for rehabilitation experiment[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(4):399-403.

        目前自身給藥[1]模型主要應用于成癮[2]藥物特性研究,或被動給予抗成癮藥物,以觀察此種藥物對藥物依賴[3]行為的影響。腦部核團的電生理記錄可以研究腦區(qū)的功能變化,將自身給藥模型與電生理采集偶聯(lián)起來,在大鼠做出藥物依賴覓藥[4]行為的同時記錄其相關腦區(qū)的電生理活動特征,從而分析相關腦區(qū)電生理功能在覓藥行為前后的變化情況。目前神經(jīng)功能康復[5]是臨床和科研的研究熱點,本偶聯(lián)模型基于藥物成癮對神經(jīng)功能的影響,開拓了研究神經(jīng)功能康復的新手段。

        傳統(tǒng)動物行為學配合腦電生理的記錄時,動物行為[6]發(fā)生的標記點是通過回放視頻資料來確定行為產生的具體時間,這樣既需要耗費大量時間去觀察尋找標記點,又會因為記錄的視頻信號和實際行為的時間差等問題,以及肉眼觀察本身帶來的誤差問題造成標記行為學時間點不準確,從而對實驗結果產生影響以及造成實驗過程的繁瑣。本偶聯(lián)模型很好地解決了上述問題,動物行為學的標記點通過動物自身自行觸發(fā)而產生,在后期分析時就避免了需要回放行為學視頻和手工標記不準確的問題。此偶聯(lián)模型建立的難點是如何在電生理信號采集的過程中同步記錄到動物行為學的發(fā)生信號,由于自身給藥訓練籠實驗模塊(如鼻觸等)的輸出信號都是0/+3.3 V的TTL(transistor transistor logic)電平信號[7],這就為神經(jīng)電生理信號采集系統(tǒng)識別輸入標記信號提供了可能。本實驗通過這一點將動物行為學與電生理采集融合在一起。

        1 實驗動物

        清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠,體質量300~330 g,由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。

        埋置用陣列微電極(16通道,陣列微絲電極:4× 4,電極絲間距200 μm,參比電極間距400 μm,L1= 6 mm,L2=9 mm),由蘇州格羅貝爾公司提供。

        自身給藥相關材料和裝置:①輸液系統(tǒng),包括硅膠管SIL-1006、輸液管PE-1106和輸液滑環(huán);②大鼠靜脈自身給藥行為實驗籠,配備2個鼻觸,1個籠燈,1個靜脈輸液泵;大鼠在實驗過程中全部數(shù)據(jù)由配套軟件進行記錄分析;③頸靜脈留置管連接固定裝置。均購自寧波安來公司。

        電極埋置配套設備:①大鼠頭部立體定位儀;②牙科鉆。均購置于深圳瑞沃德公司。

        神經(jīng)電生理信號采集設備,購自美國NEURONEXUS公司。

        2 方法

        2.1頸外靜脈置管術

        2.1.1分離靜脈

        大鼠用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉成功后右側頸部備皮,取仰臥位,在右側鎖骨中線上緣剪一個2 cm長縱行切口,鈍性分離皮下組織,游離右側頸外靜脈,整個過程可適當?shù)紊倭葵}水,防止干燥。

        2.1.2插入留置管

        用2根0號線穿過頸外靜脈分別置于遠心端和近心端方向以備結扎和固定用,將2 ml注射器針帽墊于頸外靜脈下使血管處于弧形隆起位置,結扎遠心端,用50 ml注射器針頭從靜脈上部刺入靜脈,左手用鑷子略微提起破口上緣,右手用鑷子夾住之前做好的靜脈留置管,沿破口插入約3.5~4 cm至心房入口處,回抽有暗紅色血液,推注液體無阻力證明管道置入成功。結扎固定插管,將圈結縫在血管旁邊的肌肉上,線圈要稍寬松,能防止置管被大鼠拽出即可,過緊會使肌肉壞死。

        2.1.3打皮下隧道,植入留置管連接固定裝置及縫合

        將大鼠背部肩胛間的皮膚剪一個長2.5 cm的縱行切口,鈍性擴大皮下空間,用穿刺針從頸部切口到背部切口打一皮下隧道,將留置管從隧道穿出大鼠背部切口與固定裝置的不銹鋼導管彎折處相連,通過固定裝置注入青霉素20萬U,用堵頭套在固定裝置不銹鋼導管上端,將固定裝置尼龍網(wǎng)片部分埋置于大鼠皮下。消毒,縫合切口。將大鼠放入單籠飼養(yǎng),保溫至其蘇醒(圖1)。

        圖1 頸外靜脈留置管連接固定器植入成功后的大鼠

        2.1.4術后維護

        術后大鼠常規(guī)飼養(yǎng)3 d,每天從靜脈置管注入青霉素20萬U預防因感染和異物植入而引起的靜脈炎和全身感染,同時也可以起到?jīng)_刷置管的作用。當沖管發(fā)現(xiàn)壓力增高時,可用適量肝素沖管。

        2.2腦部核團電極植入術(以植入陣列微絲電極[8]至伏隔核為例)

        2.2.1暴露骨窗

        將大鼠用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉,消毒并進行頭部備皮,將大鼠頭部固定于立體定位儀,沿大鼠頭部中線剪一個長2 cm切口,去除骨膜,剪掉切口旁多余皮緣,暴露前囪和后囪。

        2.2.2定位并植入電極

        根據(jù)伏隔核在大鼠腦定位圖譜上的坐標位置(AP+ 2.0 mm,ML+/-1.2 mm),在顱骨上進行標記。以標記點為中心用牙科鉆打磨出2×2 mm的矩形骨瓣,摘除骨瓣后用1 ml注射器針頭挑去硬腦膜暴露大腦表面,在頭骨其他位置選取4個點(盡量分布均勻)以備固定顱釘之用,用牙科鉆(選取1.1 mm直徑的鉆頭)穿透后將顱釘垂直擰入洞口,深度以剛達到大腦表面為準。將電極的兩根地線分別繞在兩個顱釘上,通過立體定位儀將電極的中心調整至伏隔核的坐標位置,緩慢植入電極,根據(jù)坐標數(shù)字顯示器控制植入深度與速度,大約控制在平均10 μm/s的植入速度為宜,一邊深入電極尖端,一邊用生理鹽水溶解包繞在電極絲周圍的聚四氟乙烯(起到電極絲固定的作用),但不能溶解得過快,以包繞物底部距離大腦表面1 mm為宜。

        2.2.3包埋固定電極

        當電極植入到6.7 mm左右的深度后停止,吹干顱骨表面,將牙科水泥拌好后均勻覆蓋到顱骨表面以剛淹沒顱釘為宜;待其變硬后,將電極接口處調整至大鼠頭部中央位置,用牙科水泥[9]進行包埋,包埋高度以距離接口邊緣2 mm為宜;待其變硬后,剪取兩根3 cm左右的棉簽棒,用萬能膠粘于電極接口兩側以備在體訓練電極的連接固定用。消毒創(chuàng)口,將大鼠放入單籠飼養(yǎng),保溫至其蘇醒(圖2)。

        2.2.4術后處理

        術后大鼠常規(guī)飼養(yǎng)4 d,每天從靜脈留置管注入青霉素20萬U以預防感染,并起到維護留置管通暢的作用。

        2.3自身給藥籠與電生理采集設備的連接

        將并聯(lián)排線接于自身給藥籠各模塊的信號輸出端,通過并聯(lián)排線分線的方式分別接于各自的BNC插頭,將對應的BNC插頭[10]分別接于電生理采集設備的Input接口,打開電生理記錄軟件中相應的Input通道,觸碰鼻觸以及運行籠燈和輸液泵,觀察信號輸入。在觀察到信號能正常輸入后,將相應通道的原始名稱分別與各自對應輸入模塊的名稱進行重新命名。

        2.4大鼠自身給藥訓練與神經(jīng)電生理信號記錄的偶聯(lián)

        大鼠腦部核團電生理信號采集與頸外靜脈自身給藥相偶聯(lián)(圖3左)。行為學的給藥記錄與大鼠腦深部核團的電生理信號同步采集(圖3右)。

        圖2 腦部核團微電極埋置成功后的大鼠

        圖3 大鼠自身給藥訓練與神經(jīng)電生理信號記錄的偶聯(lián)

        2.4.1自身給藥籠的屏蔽處理

        將自身給藥籠底壁用導電布(抗腐蝕效果好)粘附完全,將內側壁和頂壁用導電布或銅箔等電導效果好的材料做相同粘附處理,必須使自身給藥籠內部6個面的電導材料連通成一體,且需將電生理采集設備與自身給藥籠底壁導電布用導線相接(使籠內物體與電生理采集設備共電勢)。將自身給藥籠的外部也做相同處理,使各面相連通,但內部與外部要保持絕緣。

        2.4.2空白電生理行為學記錄

        自電極埋置術后第5天起將大鼠放入自身給藥籠,連接上頭部電極后,通過電極上的棉簽棒用扎帶或橡皮筋將電極與電極連接器相固定,但不連接背部給藥裝置。加載FR1[11](Fixed Radio,1∶1)模式的自身給藥訓練程序;FR1模式即大鼠觸碰1次有效鼻觸,允許藥物注射1次。每次注射后20 s內為不應期,程序開始時籠燈亮起,輸液泵注射時以及后續(xù)的不應期內籠燈熄滅,不應期過后籠燈重新亮起進入下一個循環(huán),設定的訓練期內輸液泵的給藥上限為50次,在訓練時間內如果給藥達到50次后程序自動終止,如未達到則程序運行到時間終點為止;運行電生理記錄軟件,調整好參數(shù)后開始記錄大鼠腦電信號,開始記錄10 s后運行FR1程序,直到程序結束。觀察分析大鼠行為事件相關的腦電信號。由于此時大鼠未經(jīng)任何給藥訓練,所以觸碰有效鼻觸的次數(shù)極其不穩(wěn)定,一般給藥FR1的程序運行時間設定為2 h,為了能獲得更多事件行為相關數(shù)據(jù)可以延長程序運行時間但不要超過12 h(自身給藥籠中大鼠不能進食和飲水)。

        2.4.3藥物成癮訓練以及成癮相關行為事件的電生理記錄

        將大鼠背部的留置管固定裝置與輸液泵相連并運行FR1程序,運行時間2 h。由于大鼠還未建立觸碰有效鼻觸以獲得藥物的條件反射,所以需要減少大鼠的每日食物攝取量(減少至每日15 g左右)。訓練開始時放置食物至有效鼻觸位置,30 min內無有效鼻觸觸碰則自動給予藥物注射1次,以引導大鼠建立,引導訓練時間為3 d。

        第4天開始進入正式訓練階段,去除引導手段,此時正式記錄訓練數(shù)據(jù)以分析大鼠的成癮行為學建立情況。以大鼠連續(xù)3 d的給藥次數(shù)不超過此3 d給藥次數(shù)均值的10%為成癮訓練成功的標志[12]。以下為1只可卡因自身給藥大鼠訓練成功的鼻觸圖(圖4),此圖反映了大鼠已經(jīng)完全建立了觸碰有效鼻觸以獲取藥物的條件反射(給藥劑量為0.7 mg/kg/inf)。

        在其訓練成功后將大鼠頭部電極與電極連接器相接,用上述相同方法固定,將大鼠背部固定裝置與輸液泵相通,運行電生理采集系統(tǒng)軟件記錄電生理信號10 s之后(由于有效鼻觸的不應期為20 s[13])運行FR1程序2 h,結束運行后分析實驗相關數(shù)據(jù)。

        圖4 大鼠可卡因自身給藥建模成功后有效/無效鼻觸觸碰統(tǒng)計

        2.4.4條件線索引燃[14]的電生理行為學記錄

        大鼠完全戒斷成癮藥物14 d后再次將大鼠放入自身給藥籠中,只連接頭部電極,不連接給藥裝置,開始記錄電生理信號10 s后運行FR1程序2 h,運行結束后分析實驗相關數(shù)據(jù)。由于大鼠已經(jīng)形成了觸碰鼻觸以獲取藥物的條件反射,程序開始運行的標志是籠燈亮起,雖然經(jīng)過長時間的戒斷但當程序開始運行籠燈亮起時,大鼠依然會很快去觸碰有效鼻觸以求獲取藥物,但卻得不到藥物輸入,當大鼠無法得到藥物帶來的欣快感時會連續(xù)嘗試觸碰有效鼻觸以求獲取藥物,但在不應期內大鼠幾乎不會觸碰有效鼻觸,這就反映了輸液泵運行時發(fā)出的聲音也是重要的條件線索。

        3 討論

        本實驗通過行為學事件信號的引入將大鼠靜脈自身給藥系統(tǒng)與電生理采集系統(tǒng)進行對接,實現(xiàn)特定腦區(qū)的電生理記錄和動物給藥行為的相互偶聯(lián),通過藥物的正性強化[15]作用,使動物建立起行為與獎賞之間的聯(lián)系,從而使動物通過自身行為主動獲取藥物,在產生覓藥行為的同時記錄其相關腦區(qū)的電生理功能,因其較好地模擬了人類的用藥行為,故該模型是研究藥物依賴[16]行為學與腦功能[17]相互之間聯(lián)系的重要紐帶。國內有通過向大鼠腦部植入電極后施以恐懼電擊[18],經(jīng)過數(shù)日的恐懼建模[19]后記錄大鼠腦電生理的變化以研究大鼠在恐懼時相關腦區(qū)的電生理狀態(tài)。國外有通過大鼠自身給藥行為學與特定腦區(qū)微量透析相結合[20]研究相關腦區(qū)生化[21]成分的變化情況。雖然這些研究都有行為學與實驗干預因素相結合的情況,但都沒有實現(xiàn)真正意義上的大鼠行為學事件與電生理信號采集的自主同步記錄與研究。

        本偶聯(lián)模型的創(chuàng)新點是完全通過動物自身自主進行行為學與電生理采集的同步進行,無任何被動的人為因素,更能客觀地反映實驗結果。雖然本實驗只是通過大鼠靜脈自身給藥系統(tǒng)與電生理采集系統(tǒng)相偶聯(lián)做出說明,但由于此自身給藥訓練籠是開元化模塊,可以根據(jù)實驗設計的不同自行增加或減少相關行為學裝置以及干預設備以滿足不同的實驗需要,在康復模型應用方面可以加入紅外[22]、中頻電[23]、次聲[24]以及電磁場[25]等物理因子[26],以觀察這些物理因子在治療相關模型大鼠疾病過程中特定腦區(qū)的電生理功能是否發(fā)生改變,并且如何改變。因此偶聯(lián)模型可全程在大鼠清醒狀態(tài)下完成治療干預與實驗相關腦區(qū)的電生理同步記錄,可以更及時有效地反映治療干預因素在整個疾病過程中發(fā)揮的作用,尤其是在偏癱[27]、肌張力障礙[28]等康復相關模型大鼠的物理治療干預對其相關運動功能區(qū)[29]的影響變化,以及在康復過程中相關腦區(qū)電生理功能連續(xù)性變化的研究方面提供了有效途徑。

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        Establishment of A Model in Rat Brain Nuclei Microelectrode Recording Coupled Behavioristics for Rehabilitation Experiment

        ZHANG Sheng-hao1a,LI Nan1a,GE Shun-nan1a,LI Yang1a,WU Song-yan1b,WANG Xue-lian1a,LIU Chao-hui1b
        1.a.Department of Neurosurgery;b.Rehabilitation Department,Tangdu Hospital,the Forth Military Medical University,Xi'an,Shaanxi 710038,China
        Correspondence to WANG Xue-lian,LIU Chao-hui.E-mail:531069242@qq.com(WANG Xue-lian);623364237@qq.com(LIU Chao-hui)

        Objective To establish a coupled model combining the rat brain nuclei microelectrode recordings and the behavioristics for rehabilitation experiment.Methods The modified indwelling tube connection fixed device was put inside the rats'back,and the microprobes were implanted into related neural nucleus.A signal connection was made between self-administration system and electrophysiological data acquisition system.The rat was addicted after training by self-administration system.The related cerebral nucleus electrophysiological signals were recorded in different states of addiction.Results and Conclusion The modified indwelling tube connection fixed device has a better quality for reducing the phenomenon of leak.The signal was well in the combination of two different systems.The signals for the rat's action and neural electrical were recorded in the same time.

        microprobe recording;self-administration;cerebral function;rehabilitation;neurophysiology

        10.3969/j.issn.1006-9771.2016.04.006

        R749.6

        A

        1006-9771(2016)04-0399-05

        國家自然科學基金青年科學基金項目(No.81301179;No.81401104)。

        1.第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院,a.神經(jīng)外科;b.康復醫(yī)學科,陜西西安市710038。作者簡介:張晟豪(1990-),男,漢族,陜西西安市人,碩士研究生,主要研究方向:藥物依賴和神經(jīng)電生理。通訊作者:王學廉(1963-),男,漢族,陜西西安市人,博士,教授,主要研究方向:腦功能疾病。劉朝暉(1962-),女,漢族,山西運城市人,博士,副教授,主要研究方向:腦功能康復。E-mail:531069242@qq.com(王學廉)、623364237@qq.com(劉朝暉)。

        (2015-11-11

        2015-12-21)

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