李甫梧 王麗華 宋世平

（中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 嘉定園區(qū) 上海 201800）

綜述

基于電化學(xué)分析法定量檢測MicroRNA的生物傳感器

李甫梧 王麗華 宋世平

（中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 嘉定園區(qū) 上海 201800）

就miRNA電化學(xué)法檢測中探針材料選擇、信號放大方式、電極傳感界面調(diào)控以及電化學(xué)檢測方法在研究輻射對miRNA表達(dá)的影響方面的潛在應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述。

MicroRNA，癌癥，生物標(biāo)記物，電化學(xué)，生物傳感器

miRNA在基因的表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化和凋亡中都發(fā)揮著重大的作用。更有進(jìn)一步的研究表明，miRNA和癌癥也有著高度的相關(guān)性，miRNA在腫瘤和正常組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平具有顯著性差異。檢測體內(nèi)疾病特異性miRNA可以更加有效地診斷、監(jiān)控和評估疾病，并且可以幫助我們確定個體病人最佳的使用藥物。因此，miRNA檢測技術(shù)的發(fā)展可以加速個性化診斷和精準(zhǔn)醫(yī)療的進(jìn)程［7］。更值得一提的是，最近研究發(fā)現(xiàn)miRNA也穩(wěn)定存在于血清和其他體液中［8］。目前有研究表明，對血清中和疾病相關(guān)的miRNA檢測可用于疾病的早期診斷［9］。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)乳腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌、肝癌、甲狀腺乳頭狀癌、宮頸癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和卵巢癌的腫瘤細(xì)胞中miRNA表達(dá)量均有異常［10］。

由于miRNA的長度很短，并且通常miRNA的濃度很低，想要在臨床上準(zhǔn)確地檢測仍然具有很大的挑戰(zhàn)［11］。雖然Northern blotting是檢測miRNA的標(biāo)準(zhǔn)方法，常用來評價其它的檢測miRNA方法的可靠性，然而這個方法不僅需要很大的工作量和時間來完成，而且其靈敏度較低，還需要大量的RNA樣品［12-13］。Real-time PCR（RT-PCR）最大的缺點(diǎn)是價格昂貴，不僅購買整套的機(jī)器系統(tǒng)價格昂貴，其維持和運(yùn)行費(fèi)用也相當(dāng)可觀，普通實驗室難以開展此項目，使其使用受限，并且使用該門技術(shù)還需要經(jīng)過專門的訓(xùn)練［14］。因此，近幾年很多有別于RT-PCR和Northern blot新方法被提出來。新方法基于不同的檢測方式，包括比色法［15］、測序［16-17］、微陣列［18］、拉曼散射［19］、電化學(xué)發(fā)光［20］、熒光法［21］和電化學(xué)［22］等。這些方法不僅減少了步驟上的復(fù)雜性，并且降低了成本［23］，本文主要對電化學(xué)分析法進(jìn)行闡述。電化學(xué)分析方法具有高靈敏度、高特異性、操作簡單、低成本、快速和檢測儀器尺寸小等優(yōu)點(diǎn)［24-25］，因此，近些年來越來越多的研究團(tuán)隊將電化學(xué)分析方法用于miRNA的檢測。Gao等［26-27］最先利用電化學(xué)方法在檢測miRNA上進(jìn)行了嘗試，并以DNA作為捕獲探針（Capture probes， CPs），通過與miRNA雜交后將電信號放大達(dá)到了80 fmol/L的檢出限，檢測范圍80～200 pmol/L。

1 miRNA生物傳感器的靈敏度

由于細(xì)胞內(nèi)、血清和唾液中miRNA濃度很低，而且濃度范圍大（在人血清中從0～1 pmol/L［28］），因而更寬的檢測范圍和更低的檢出限是研究人員一直追求的。最常用的策略包括使用與miRNA親和力更高的PNA或LNA作為探針材料，或者使用更有效的信號放大系統(tǒng)提高傳感器的檢出限和檢測范圍。若要應(yīng)用于臨床，還應(yīng)注意方法的簡便性和成本的控制。

1.1miRNA生物傳感器的探針材料

寡聚核苷酸（大多為DNA）合成方便而且價格便宜，研究人員最常用的是利用寡聚核苷酸作為CPs，但由于其帶有磷酸基團(tuán)且空間結(jié)構(gòu)的不太穩(wěn)定性，給miRNA檢測的靈敏度帶來了一定的阻礙。后來肽核酸（Peptide nucleic acid， PNA）和鎖核酸（Locked nucleic acid， LNA）的發(fā)現(xiàn)為miRNA的檢測提供了很好的工具。DNA、PNA、LNA結(jié)構(gòu)單元見圖2。

1.1.1 以肽核酸作為探針

PNA是一種核酸類似物，最初由Nielsen等［30］合成。他們用非手性的聚酰胺骨架代替了磷酸和脫氧核糖構(gòu)成的PNA的基本骨架（圖2）。隨后Egholm等［31］證明了其與互補(bǔ)配對也遵循Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對原則，并且由于其不帶與miRNA相同的電荷，極大地增強(qiáng)了和miRNA的親和力。同時，由于其不會被細(xì)胞中的酶降解，因而可以為miRNA的胞內(nèi)定量分析提供更可靠的探針［32］。

Fan等［33］以PNA為CPs，使用導(dǎo)電聚合物納米線的方法用于對miRNA進(jìn)行檢測。他們將PNA固定到有100對相互連鎖的梳子狀的納米間隙的陣列（Nano-gapped array）上。在與 PNA 序列互補(bǔ)的miRNA雜交后，為CPs上帶去了凈負(fù)電荷后與苯胺/辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）/H2O2共同孵育，質(zhì)子化的苯胺分子附著到帶負(fù)電的miRNA-PNA雙鏈上，形成聚苯胺納米線。然后這些納米線被參雜著HCl的蒸汽擴(kuò)充，創(chuàng)建了一個導(dǎo)電網(wǎng)絡(luò)，橋接了這個生物傳感器陣列的間隙。檢測范圍10～20 pmol/L，檢出限可以達(dá)到5 fmol/L。Gao等［34］將生物素化的 PNA 作為探測探針（Detection probes， DPs），修飾有Avidin的葡萄糖氧化酶特異性吸附在一起形成復(fù)合物（GOx-DPs），當(dāng)環(huán)狀的CPs（5′端和3'端分別含有與miRNA和DPs的互補(bǔ)序列）和靶標(biāo)miRNA結(jié)合后環(huán)狀CPs，就露出DPs的結(jié)合部位，在GOx-DPs結(jié)合到CPs上后加入葡萄糖反應(yīng)即可產(chǎn)生氧化還原信號。最適條件下其檢出限達(dá)到4.0 fmol/L，范圍4.0～10 pmol/L。

1.1.2 以鎖核酸作為探針

LNA最早由Neely等［35］用于miRNA檢測分析。LNA是一種新型核酸，包含了RNA的核糖環(huán)的2′的氧原子和4′ 的碳原子連接起來的亞甲基（圖2），可以減少核糖構(gòu)象的多樣性并且增加磷酸骨架部分區(qū)域的穩(wěn)定度［36］?；谶@個結(jié)構(gòu)，LNA對與其互補(bǔ)的DNA或者RNA序列具有很高的親和力［37］。當(dāng)使用LNA作為探針時，與傳統(tǒng)的RNA或DNA寡聚核苷酸鏈作為探針相比，靈敏度提高大約10倍［38］。也有文獻(xiàn)報道，若使用頸環(huán) LNA作為捕獲探針可以提高其選擇性和靈敏度［39］。

Yin等［40］的研究中以LNA作為探針，功能化的金納米顆粒（Au nanopaticles， AuNPs）作為信號放大系統(tǒng)，AuNPs上包被了一段LNA和若干與Biotin修飾的DNA。實驗中所用電極為石墨烯和樹突狀的納米金修飾的玻璃碳復(fù)合物，探針上帶有與靶標(biāo)miRNA和AuNPs上的LNA互補(bǔ)的序列，是一個不帶熒光基團(tuán)和淬火基團(tuán)的分子信標(biāo)。當(dāng)靶標(biāo)miRNA與探針互補(bǔ)后，這個莖環(huán)結(jié)構(gòu)的分子信標(biāo)被打開與miRNA互補(bǔ)配對形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，露出和 AuNPs上 LNA互補(bǔ)序列，并將其固定在電極表面。再加入Streptavidin-HRP，在室溫下孵育后加入底物對苯二酚和 H2O2產(chǎn)生電化學(xué)信號，其檢出限可以達(dá)到0.06 pmol/L。后來Yin等［10］在原來的基礎(chǔ)上，使用了帶有兩種不同序列LNA（S4， S5）功能化的AuNPs可以被作者設(shè)計的“橋狀”雙鏈DNA所捕獲。組成這個“橋狀”的雙鏈DNA的兩條脫氧核苷酸鏈的中間一段序列是互補(bǔ)配對的，兩端以兩條相互獨(dú)立的單鏈的形式存在。一端用于與兩個帶有 S4序列LNA的相連，另一端的兩條單鏈其中一條與S5相連，而另外一條在CPs與miRNA雜交環(huán)形結(jié)構(gòu)打開后，露出的5′ 端有其互補(bǔ)序列（圖3）。

這樣的設(shè)計將其上一個研究工作的信號進(jìn)一步放大，其檢出限達(dá)到了6fmol/L［10］。這些技術(shù)利用酶聯(lián)反應(yīng)和一些納米材料對信號進(jìn)行放大，并加入對核酸親和力更高的PNA或者LNA作為CPs，得到了足夠高的靈敏度［41］。

1.2信號放大系統(tǒng)

由于 miRNA的長度很短，而且在細(xì)胞內(nèi)的濃度很低，僅依靠miRNA本身所帶的負(fù)電荷為電極表面帶去的電信號很難檢測到或準(zhǔn)確測量，因此我們必須借助于一定的信號放大系統(tǒng)來增強(qiáng)傳感器的靈敏度。最常用的是體系中加入一些電化學(xué)活性分子或是使用 HRP催化其底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)進(jìn)而給電極帶去電信號［12，40］，從而實現(xiàn)信號的放大。

Heeger等［42］利用二茂鐵作為信號輸出原件，將一段一端修飾巰基另一端連有一個二茂鐵分子的捕獲探針自組裝到金電極表面，這段探針具有類似于熒光分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在未發(fā)生雜交反應(yīng)時，探針處于莖環(huán)構(gòu)型，末端連接的二茂鐵分子處于電極的近端，而當(dāng)溶液中含有靶序列時，由于雜交反應(yīng)的發(fā)生使莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開，形成雙鏈DNA的剛性結(jié)構(gòu)，末端連接的二茂鐵分子就會從電極的近端移動到遠(yuǎn)端。這種距離的改變導(dǎo)致電子傳遞效率發(fā)生變化，通過檢測二茂鐵分子氧化還原電流的變化可以方便而快速地指示雜交反應(yīng)的發(fā)生，這個方法的檢出限大約為30 pmol/L。在這個設(shè)計中，當(dāng)有一個靶標(biāo)miRNA分子和探針結(jié)合時僅能帶給電極表面一個二茂鐵的氧化還原信號，因而限制了這個傳感器的靈敏度。在Wang等［26］2012年的研究中，同樣也以二茂鐵作為氧化還原信號介質(zhì)。他們以修飾有鏈霉親和素的AuNPs作為載體，將大量二茂鐵固定在AuNPs表面實現(xiàn)信號放大。將生物素標(biāo)記的和目標(biāo)miRNA序列相同的寡聚核苷酸和目標(biāo)miRNA共同競爭固定化在電極上的探針。伏安法定量分析miRNA的濃度將在生物素標(biāo)記的DNA鏈和二茂鐵包被的AuNPs發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)后完成。二茂鐵產(chǎn)生的氧化電流信號和目標(biāo)miRNA濃度成反比，檢測范圍10～2.0 pmol/L，檢出限達(dá)10 fmol/L。與此相似，Wang等［43］在金微電機(jī)上固定了一個修飾了甲基藍(lán)（Methylene blue， MB）的三個莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA探針，當(dāng)miRNA和探針結(jié)合后，帶有MB的一端會靠近電極表面，從而得到一個電子轉(zhuǎn)移的信號，檢測限達(dá)到了0.1 fmol/L，并且有一個較寬的檢測范圍（亞fmol/L到nmol/L）。MB在電化學(xué)生物傳感器中是一種非常常用的氧化還原指示劑［44］。Yang等［45］以PNA為探針，建立了一個依賴于Ru（III）積累在固定于電極表面的核酸上的氧化還原系統(tǒng)，其信號放大包括鐵氰化物和Ru（III）的再生，實現(xiàn)了10 amol/L的檢出限，在當(dāng)時是靈敏度最高的miRNA傳感器。Labib等［28］對比了向反應(yīng)液中同時加入K3［Fe（CN）6］和［Ru（NH3）6］Cl3相比不加入的這兩種物質(zhì)的反應(yīng)液可以引起電流強(qiáng)度的增強(qiáng)。Wu等［46］設(shè)計了一種利用可以使目標(biāo)miRNA不斷地打開固定在電極表面的莖環(huán)捕獲探針并再釋放回溶液中的策略，實現(xiàn)對信號的再一次放大，達(dá)到0.35 fmol/L的檢測限。

滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling-circle amplification， RCA）是一種等溫核酸放大系統(tǒng)［47］，RCA不僅可以被應(yīng)用在電極表面［48］，也可以被用在金納米顆粒等納米材料上［49］?，F(xiàn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用在生物傳感器中，它具有很好的信號增強(qiáng)作用。Tian等［50］設(shè)計了一種基于莖環(huán)探針引發(fā)的固相滾環(huán)擴(kuò)增，他們使用碳納米管（Carbon nanotube， CNT）作為一種固相基底，識別目標(biāo)miRNA的莖環(huán)探針結(jié)合在碳納米管上。當(dāng)靶標(biāo)出現(xiàn)時，莖環(huán)結(jié)構(gòu)會被打開，引發(fā) RCA過程，該工作得到了1.2 fmol/L的檢測限。M iao等［51］的工作更是創(chuàng)造性的把RCA嫁接到DNA四面體納米結(jié)構(gòu)上，得到了50 amol/L極低的檢測限。

2 信噪比控制

越來越多的研究喜歡利用自組裝的方式將CPs固定到電極上，在固定化過程中，由于探針之間可能存在連續(xù)的、較長的互補(bǔ)序列，因而在固定化之后隨著溫度的降低可能會引起探針之間形成局部的雙螺旋，從而導(dǎo)致測量上的誤差。不僅如此，還因為探針上某些特定的官能團(tuán)能與電極表面發(fā)生特異性吸附（堿基上的N與金電極表面），因此就有必要通過特定的手段來提高雜交捕獲效率，降低非特異性吸附，從而改善傳感檢測的信噪比。

2.1電極表面修飾

在先前報導(dǎo)的工作中，各式各樣的工作電極被應(yīng)用到 miRNA檢測中，包括銦錫氧化物［52］、Ag/AgCl、石墨［53-54］、鉑絲［54］、石墨烯復(fù)合材料［55］、玻璃碳［56］、滴汞電極［57］、碳納米管［58］和金［59-61］等。

2010年，Pohlmann等［62］將一種新的檢測模型應(yīng)用到電化學(xué)檢測miRNA方面。是一種通過“缺口”雜交的方法。當(dāng)miRNA不存在時，CPs和DPs之間無法被填滿，堿基堆積力無法固定雜交的復(fù)合物，會發(fā)生搖晃。當(dāng)miRNA和Gap序列雜交后，報告酶蛋白（Reporter enzyme）可以為電極界面帶去酶促反應(yīng)產(chǎn)生的電化學(xué)信號。在這個方法中，作者使用金作為工作電極，Au-S化學(xué)工藝無疑對寡聚核苷酸探針分子通過自組裝的方式固定化到金電極表面帶來了極大的便利［63］。在先前提到的Yin的工作中也將CPs或DPs通過該工藝固定于Au表面［10，40］。由于DNA在電極表面易發(fā)生倒伏等情況，后來的工作中對電極表面進(jìn)行了各式各樣的修飾。

由于金表面很容易修飾官能團(tuán)，尤其是帶硫基的化合物，因此越來越多的研究人員用金作為工作電極。通過在金電極表面修飾一些其他的化合物如硫基己醇（Mercaptohexanol， MCH）［64］、二硫蘇糖醇（Dithiothreitol， DTT）［65］、己二硫醇（Hexanedithiol，HDT）來保護(hù)電極表面，他們通常還被混合使用。這種通過HDT對寡聚核苷酸3'末端-OH集團(tuán)的修飾，可以減少探針單層自組裝的非特異性吸附，并且可以更好地保證固定好的探針處于一種直立的狀態(tài)以提高雜交的效率［23］。通常有圖4中這種二元、三元分子組成的單層界面（圖4）。Zhang等［24］就利用硫基己醇去阻斷金電極表面以減少表面的非特異性吸附方面進(jìn)行了嘗試。Wang等［26］利用1-乙硫醇去提高探針和miRNA雜交的效率。

利用硫基己醇等對金電極表面修飾可以一定程度上調(diào)整DNA探針密度，以及防止其倒伏與電極表面進(jìn)而影響進(jìn)一步的雜交，增加探針和靶序列結(jié)合的效率，使實驗結(jié)果可信度更高。

2.2探針密度控制

探針的組裝密度對雜交效率有著很大影響，并不是越多越好，主要體現(xiàn)在當(dāng)探針過密時，帶負(fù)電荷的探針與同樣帶負(fù)電荷的具有互補(bǔ)序列的靶標(biāo)核苷酸鏈的靜電排斥力就越強(qiáng)，進(jìn)而使雜交反應(yīng)難以進(jìn)行。另外，因為雜交反應(yīng)發(fā)生在固液界面上，過大的密度會增加靶序列與探針雜交時的空間位阻，位阻會降低靶序列與探針的接觸機(jī)會［66］。DNA的組裝也會被很多因素所影響，比如兩條鏈之間的靜電排斥，分子間的聚合，堿基上的氮原子會和金電極表面發(fā)生非特異性的相互作用和雙鏈之間較強(qiáng)的相互作用等（圖5）。實際情況并沒有文章中的示意圖那么完美。

為了解決以上問題，F(xiàn)an的研究組將DNA四面體納米結(jié)構(gòu)作為探針的支架，稱為四面體結(jié)構(gòu)探針（Tetrahedron-structured probe， TPS）。DNA四面體納米結(jié)構(gòu)由3條經(jīng)硫醇化的55 nt的DNA片段和一條帶有探針序列的DNA片段組成。將4條單鏈化學(xué)計量相等地混合在緩沖溶液中，加熱到 95 ℃變性后快速地降溫到 4 ℃，它們就能分層次地組裝起來。這個3D的納米結(jié)構(gòu)可以通過3個在四面體底部的硫醇與金表面共價相連可以容易且很穩(wěn)定地錨定在金的表面，將未雜交的探針留在頂部［68］（圖6）。

這個3D的DNA構(gòu)架在溶液中具有力學(xué)上的剛性，又具有結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。除了以上的優(yōu)點(diǎn)以外，四面體的結(jié)構(gòu)同樣為DNA探針提供了一個嚴(yán)格的構(gòu)架并且使得探針與探針之間保持一定的空間，為下一階段的雜交降低空間上的障礙［69］。

Fan的課題組在miRNA檢測中使用了辣根過氧化物酶（HRP）用于信號放大，同時采用了三明治夾心法（Sandwich-type）檢測方式。首先將TPS固定于金電極表面，四面體頂點(diǎn)的探針帶有部分和目標(biāo)miRNA互補(bǔ)的序列（Probe 1）。生物素標(biāo)記的DNA單鏈作為信號探針（Probe 2），帶有與miRNA互補(bǔ)的另外一部分序列。當(dāng)三者同時出現(xiàn)在溶液中時，由于堿基的互補(bǔ)配對和堿基堆積力的共同作用下形成一種Probe 1: miRNA: Probe 2的三明治結(jié)構(gòu)。Probe 2上的生物素可以特異性地和avidin-HRP或者多聚HRP（PolyHRP80）結(jié)合，加入底物3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（3，3′，5，5′ tetramethyl-benzidine， TMB）和H2O2就可以產(chǎn)生電量的電化學(xué)電流信號。當(dāng)使用Poly-HRP80時可以檢測濃度為10 amol/L的miRNA（100 μL內(nèi)含有600分子），靈敏度比使用Avidin-HRP降低了三個數(shù)量級。更值得一提的是基于PolyHRP80的電化學(xué)miRNA傳感器可以測量9個數(shù)量級內(nèi)的濃度［70］。后來他們再在基于DNA四面體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，將四面體結(jié)構(gòu)的頂部的探針換成莖環(huán)（Stem loop）形的探針（Probe 1）。Probe 1上帶有與待測miRNA和與生物素相連的DNA單鏈（Probe 2）的互補(bǔ)序列。這個模型的生物傳感器的檢出限達(dá)到了 1 fmol/L［12］。與上一個方法不同的是環(huán)形的DNA單鏈可以降低非特異性雜交，并且增加了CPs與miRNA和DPs互補(bǔ)序列的長度，增強(qiáng)了他們形成的雙螺旋的穩(wěn)定性，從而增加其特異性以提高檢測結(jié)果的可靠性。在這次研究中，他們依然使用HRP以TMB和H2O2作為底物，用于信號放大作用。Tang等［51，71］同樣也利用DNA四面體納米結(jié)構(gòu)上電極界面調(diào)控做了很多嘗試。利用 RCA和鏈置換反應(yīng)作為放大體系在對miRNA進(jìn)行檢測時也達(dá)到了很好的檢測效果。

文中所舉的例子可以很好地體現(xiàn)出DNA四面體納米探針應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感的優(yōu)勢，除了上文中提到DNA四面體納米探針在力學(xué)上和調(diào)節(jié)探針空間分布上的具有的一些優(yōu)勢之外，它還可以控制DNA探針的朝向，使探針不會倒伏在電極表面而影響進(jìn)一步的雜交，使DNA納米探針從一維進(jìn)化到了三維結(jié)構(gòu)。相較于硫基己醇、1-乙硫醇等對電極的修飾來說，DNA納米結(jié)構(gòu)可以更好的控制DNA探針的朝向，能使探針在電極表面分布更均一，能更好地去操控整個傳感界面。

2.3輻射與miRNA

研究表明，一些miRNA的表達(dá)水平和該細(xì)胞系對輻射敏感性有很大的相關(guān)性。王等［72］研究了不同輻射抗拒鼻咽癌miRNA表達(dá)水平差異的研究。發(fā)現(xiàn)不同輻射抗拒NPC細(xì)胞株CNE -1和CNE-2細(xì)胞的m icroRNA的表達(dá)有差異；差異表達(dá)的miRNA與放療敏感有關(guān)。孫等［73］研究了氚水內(nèi)照射和Co-60 γ射線外照射誘發(fā)小鼠肝組織miRNA表達(dá)改變，篩選電離輻射損傷的特異性 miRNA，探討miRNA在電離輻射損傷中的功能及 m iR-34a在輻射損傷時對細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)對小鼠肝組織miRNA改變進(jìn)行分析，Real-time PCR方法驗證篩選出的差異miRNA表達(dá)。p53依賴途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是輻射殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制之一，肖等［74］的研究表明，miR-34c對肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞系有輻射增敏效應(yīng)，可強(qiáng)化p53蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞在細(xì)胞周期的G1/G0期阻滯和凋亡。在這些研究中，對 miRNA的檢測大多數(shù)是利用miRNA芯片技術(shù)或 Real-time PCR技術(shù)對相應(yīng)miRNA進(jìn)行檢測，這些方法不但昂貴，且耗時。另外Real-time PCR容易由于反應(yīng)過程中的污染帶來假陽性的結(jié)果。因此，若上述電化學(xué)檢測技術(shù)能應(yīng)用到這些研究中去，可以得到更精確輻射和miRNA表達(dá)水平的定量關(guān)系。

2.4當(dāng)前癌癥檢測方法與miRNA電化學(xué)檢測法

輻射在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用以來，為患者制造了巨大利益，但也存在對健康不利的影響。目前對癌癥檢測最常用的影像學(xué)檢查手段包括超聲，計算機(jī)斷層顯像［75-76］，磁共振顯像和正電子發(fā)射斷層顯像等。但即使是其中最先進(jìn)、最準(zhǔn)確的方法腫瘤檢出直徑至少也要在2～3 mm，才可以確認(rèn)腫瘤的形成，小于該直徑則被認(rèn)為是正常的突起。另外利用影像學(xué)方法檢查過程中患者會被暴露在一定劑量的射線中，對身體造成傷害，一旦過量并具有導(dǎo)致癌癥的風(fēng)險［77］。但對血清中miRNA檢測是一種非侵入式的方法，為患者在診斷或是對預(yù)后進(jìn)行評估時極大限度減少了對患者的傷害，且更適用于普查。因此，利用檢測血清中的循環(huán)miRNA相比目前主流的幾種影像學(xué)方法要更溫和，對人體傷害降至最低。

3 總結(jié)與展望

miRNA的重要性已經(jīng)受到廣泛地認(rèn)可，并且miRNA可以在血清中穩(wěn)定存在，對人類疾?。ò┌Y）的診斷和預(yù)測提供了很好的思路。目前有越來越多的檢測方法應(yīng)用于miRNA的檢測中。PNA及LNA的引入也在一定程度上提高了探針和靶標(biāo) miRNA檢測的親和力，各種各樣極具特色的信號放大方式提高了miRNA檢測時的靈敏度，AuNPs由于其易和蛋白以及DNA等共價結(jié)合等性質(zhì)，也已應(yīng)用于各種傳感器中。目前就DNA傳感界面的研究來說，DNA四面體納米結(jié)構(gòu)使探針濃度、在界面的朝向都可以做到可控，且使探針在傳感界面的分布要更均一，因此傳感器能具有更高靈敏度和特異性，目前僅在金電極上有所應(yīng)用，研究者們可以在其他更廉價的電極（例如碳電極）上對DNA四面體進(jìn)行嘗試，以便拓寬DNA四面體在生物傳感中的應(yīng)用。電化學(xué)分析方法具有速度快、選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低且易于微型化等優(yōu)點(diǎn)，是一種非常適用于醫(yī)院的疾病預(yù)測及診斷的方法。相比目前醫(yī)院中所用到的影像學(xué)方法，不但極大限度地減小了診斷癌癥等疾病時對病人身體的損傷，并且有望用于癌癥的早期診斷。電化學(xué)產(chǎn)品可以產(chǎn)業(yè)化，有望做成廉價的小型POCT產(chǎn)品，服務(wù)于家庭用戶。利用電化學(xué)分析法用于miRNA的臨床檢測是一種非常有實際應(yīng)用前景的方法。

1Shen W， Deng H M， Ren Y Q， et al. A label-free microRNA biosensor based on DNAzyme- catalyzed and microRNA-guided formation of a thin insulating polymer film［J］. Biosensors & Bioelectronics， 2013， 44: 171-176. DOI: 10.1016/j.bios. 2013.01.028.

2Esquela K A， Slack F J. Oncomirs-microRNAs with a role in cancer［J］. Nature Reviews Cancer， 2006， 6（4）: 259-269. DOI: 10.1038/nrc1840.

3Bartel D P. MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions［J］. Cell， 2009， 136（2）: 215-233. DOI: 10.1016/j.cell.2009.01.002.

4Lee R C， Feinbaum R L， Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14［J］. Cell， 1993. 75（5）: 843-854. DOI: 10.1016/0092-8674（93）90529-Y.

5Lee Y， Ahn C， Han J. et al. The nuclear RNase III Drosha initiatesmicroRNAprocessing［J］. Nature，2003，425（6956）: 415-419. DOI: 10.1038/nature01957.

6Filipowicz W， Bhattacharyya S N， Sonenberg N. Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight？［J］. Nature Reviews Genetics， 2008， 9（2）: 102-114. DOI: 10.1038/nrg2290.

7Zhou X， Cao P， Zhu Y， et al. Phage-mediated counting by the naked eye of miRNA molecules at attomolar concentrations in a Petri dish［J］. Nature Materials， 2015，14（10）: 1058-1064. DOI: 10.1038/ nmat4377.

8Johnson B A， Su X， Giraldez M D， et al. Kinetic fingerprinting to identify and count single nucleic acids［J］. Nature Biotechnology， 2015， 33（7）: 730-732. DOI: 10. 1038/nbt.3246.

9Wwn YL， Pei H， Shen Y， et al. DNA nanostructure-based interfacial engineering for PCR-free ultrasensitive electrochemical analysis of microRNA［J］. Scientific reports， 2012， 2: 867. DOI: 10.1038/srep00867.

10 Yin H S， Zhou Y L， Chen C X， et al. An electrochemical signal 'off-on'sensing platform for m icroRNA detection［J］. The Analyst， 2012， 137（6）: 1389- 1395. DOI: 10.1039/c2an16098f.

11 Ge Z L， Lin M H， WANG Ping， et al. Hybridization chain reaction amplification of microrna detection w ith a tetrahedral DNA nanostructure-based electrochemical biosensor［J］. Analytical Chem istry， 2014， 86（4）: 2124-2130. DOI: 10.1021/ac4037262.

12 Lin M H， Wen Y L， Li L Y， et al. Target-responsive， DNA nanostructure-based e-DNA sensor for m icroRNA analysis［J］. Analytical Chem istry， 2014， 86（5）: 2285-2288. DOI: 10.1021/ac500251t.

13 Sempere L F， Freemantle S， Pitha R I， et al. Expression profiling of mammalian microRNAs uncovers a subset of brain-expressed microRNAs with possible roles inmurine and human neuronal differentiation［J］. Genome Biology，2004， 5（3）: R13. DOI: 10.1186/gb-2004-5-3-r13.

14 Ren Y Q， Deng H M， Shen W， et al. A highly sensitive and selective electrochemical biosensor for direct detection of microRNAs in serum［J］. Analytical Chemistry， 2013， 85（9）: 4784-4789. DOI: 10.1021/ ac400583e.

15 Wang Q， Li R D， Yin BC， et al. Colorimetric detection of sequence-specific microRNA based on duplex-specific nuclease-assisted nanoparticle amplification［J］. Analyst，2015， 140（18）: 6306-6312. DOI: 10.1039/c5an01350j.

16 Roberts B S， Hardigan A A， Kirby M K， et al. Blocking of targeted microRNAs from next-generation sequencing libraries［J］. Nucleic Acids Research， 2015， 43（21）: e145. DOI: 10.1093/nar/gkv724.

17 Huang S， Romero R M， Castell O K， et al. High-throughput optical sensing of nucleic acids in a nanopore array［J］. Nat Nanotechnol， 2015， 10（11）: 986-991. DOI: 10.1038/nnano.2015.189.

18 Roy S， Soh J H， Ying J Y. A microarray platform for detecting disease-specific circulating miRNA in human serum［J］. Biosens Bioelectron， 2016， 75: 238-246. DOI: 10.1016/j.bios.2015.08.039.

19 ZHANG Hao， LIU Yu， GAO Jian， et al. A sensitive SERS detection of miRNA using a label-free multifunctional probe［J］. Chemical Communications， 2015， 51（94）: 16836-16839. DOI: 10.1016/j.bios.2015.08.039.

20 Feng X， Gan N， Zhang H， et al. Ratiometric biosensor array for multiplexed detection of microRNAs based on electrochemilum inescencecoup ledwithcyclic voltammetry［J］. Biosens Bioelectron， 2016， 75: 308-314. DOI: 10.1016/j.bios.2015.08.048.

21 Wang W， Kong T， Zhang D， et al. Label-free m icroRNA detection based on fluorescence quenching of gold nanoparticles with a competitive hybridization［J］. Analytical Chem istry， 2015， 87（21）: 10822-10829. DOI: 10.1021/acs.analchem.5b01930.

22Gergely L， Róbert E G. Electrochemical detection of miRNAs［J］. Electroanalysis， 2014， 26（6）: 1224-1235. DOI: 10.1002/elan.201400055

23 Em il P， Martin B. Electrochemistry of nucleic acids［J］. Chem ical Reviews， 2012， 112（6）: 3427-3481. DOI: 10. 1002/elan.201400055.

24 Dong H F， Jin S， Ju HX， et al. Trace and label-free microRNA detection using oligonucleotide encapsulated silver nanoclusters as probes［J］. Analytical Chemistry，2012， 84（20）: 8670-8674. DOI: 10.1021/ ac301860v.

25 WenYL，PeiH，WanY，etal.DNA nanostructure-decorated surfaces for enhanced aptamertarget binding and electrochemical cocaine sensors［J］. Analytical Chemistry， 2011， 83（19）: 7418-7423. DOI: 10.1021/ac201491p.

26 Wang J X， Yi X Y， Tang H L， et al. Direct quantification of microRNA at low picomolar level in sera of glioma patients using a competitive hybridization followed by amplified voltammetric detection［J］. Analytical Chemistry，2012， 84（15）: 6400-6406. DOI: 10. 1021/ac203368h.

27 Gao Z Q， Yang Z. Detection of microRNAs using electrocatalytic nanoparticle tags［J］. Analytical Chem istry，2006， 78（5）: 1470-1477. DOI: 10.1021/ac051726m.

28 M ahmoud L， Nasrin K， Shahrokh M， et al. Three-mode electrochemical sensing of ultralow microrna levels［J］. Journal of the American Chemical Society， 2013， 135（8）: 3027-3038. DOI: 10.1021/ja308216z.

29 Rudolf A， Bernhard M F. Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridizationtechniques［J］.NatureReviews Microbiology， 2008， 6（5）: 339-348. DOI: 10.1038/ nrmicro1888.

30 Nielsen P E， Egholm M， Berg R H， et al. Sequence selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide［J］. Science， 1991，254（5037）: 1497-1500. DOI: 10.1126/ science.1962210.

31 Egholm M， Buchardt O， Christensen L， et al. PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the watson-crick hydrogen-bonding rules［J］. Nature， 1993，365（6446）: 566-568. DOI: 10.1038/365566a0.

32 Singh R P， Oh B K， Choi J W. Application of peptide nucleic acid towards development of nanobiosensor arrays［J］. Bioelectrochem istry， 2010， 79（2）: 153-161. DOI: 10.1016/j.bioelechem.2010.02.004.

33 Fan Y， Chen X T， Alastair D T， et al. Detection of microRNAs using target-guided formation of conducting polymer nanow ires in nanogaps［J］. Journal of the American Chem ical Society， 2007， 129（17）: 5437-5443. DOI: 10.1021/ja067477g.

34 Gao ZQ. A highly sensitive electrochemical assay for m icroRNA expression profiling［J］. The Analyst， 2012，137（7）: 1674-1679. DOI: 10.1039/c2an15974k.

35 Neely L A， Patel S， Garver J， et al. A single-molecule method for the quantitation of microRNA gene expression［J］. Nature Methods， 2006， 3（1）: 41-46. DOI: 10.1038/nmeth825.

36 Chen J， Zhang J， Wang K， et al. Electrochemical biosensor for detection of BCR/ABL fusion gene using lockednucleicacidson4-am inobenzenesulfonic acid-modified glassy carbon electrode［J］. Analytical Chem istry， 2008， 80（21）: 8028-8034. DOI: 10.1021/ ac801040e.

37 Wang L， Yang C J， Medley C D， et al. Locked nucleic acid molecular beacons［J］. Journal of the American Chem ical Society， 2005， 127（45）: 15664-15665. DOI: 10. 1021/ja052498g.

38 Válóczi A， Hornyik C， Varga N， et al. Sensitive and specific detection of microRNAs by northern blot analysis using LNA-modified oligonucleotide probes［J］. Nucleic Acids Research， 2004， 32（22）: e175. DOI: 10.1093/nar/ gnh171.

39 Liu L Z， Jiang ST， Wang L， et al. Direct detection of microRNA-126 at a femtomolar level using a glassy carbon electrode modified with chitosan， graphene sheets，and a poly （amidoamine） dendrimer composite w ith gold and silver nanoclusters［J］. Microchimica Acta， 2015，182（1-2）: 77-84. DOI: 10.1007/s00604-014-1273-y.

40 Yin H， Zhou Y， Zhang H， et al. Electrochemical determination of microRNA-21 based on graphene， LNA integrated molecular beacon， AuNPs and biotin multifunctional bio bar codes and enzymatic assay system［J］. Biosensors & Bioelectronics， 2012， 33（1）: 247-253. DOI: 10.1016/j.bios.2012.01.014.

41 Labib M， Berezovski M V B. Electrochem ical sensing of microRNAs: Avenues and paradigms［J］. Biosensors & Bioelectronics， 2015， 68: 83-94. DOI: 10.1016/j.bios. 2014.12.026.

42 Fan C H， Plaxco K W， Heeger A J. Electrochem ical interrogation of conformational changes as a reagentless method for the sequence-specific detection of DNA［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2003， 100（16）: 9134-9137. DOI: 10.1073/pnas.1633515100.

43 Wang T Y， Emilie V， Didier M， et al. Microelectrode miRNA sensors enabled by enzyme less electrochemical signal amplification［J］. Analytical Chemistry， 2015，87（16）: 8173-8180. DOI: 10.1021/acs.analchem.5b00780.

44 Rafiee P H A， Behpour M， Keshavarz M. A novel label-free electrochemical miRNA biosensor using methylene blue as redox indicator: application to breast cancerbiomarkermiRNA-21［J］.Biosensors& Bioelectronics， 2016， 77: 202-207. DOI: 10.1016/j.bios. 2015.09.025.

45 Yang H， Hui A， Pampalakis G， et al. Direct， electronic m icroRNA detection for the rapid determ ination of differential expression profiles［J］. Angewandte Chemie-International Edition， 2009， 48（45）: 8461-8464. DOI: 10.1002/anie.200902577.

46 Wu X Y， Chai Y Q， Zhang P， et al. An electrochemical biosensor for sensitive detection of microRNA-155: combining target recycling with cascade catalysis for signal am plification［J］. Acs Applied Materials & Interfaces， 2015， 7（1）: 713-720. DOI: 10. 1021/ am507059n.

47 Ouyang X Y， Li J， Liu H J， et al. Rolling circle am plification-based DNA origami nanostructrures for intracellular delivery of immunos- timulatory drugs［J］. Small， 2013， 9（18）: 3082-3087. DOI: 10.1002/sm ll. 201300458.

48 Shi K， Dou B T， Yang C Y， et al. DNA-fueled molecular machineenablesenzyme-freetargetrecycling amplification for electronic detection of microRNA from cancer cells with highly minimized background noise［J］. Analytical Chemistry， 2015， 87（16）: 8578-8583. DOI: 10.1021/acs.analchem.5b02418.

49 Yan J， Hu C， Wang P， et al. Grow th and origami folding of DNA on nanoparticles for high-efficiency molecular transport in cellular imaging and drug delivery［J］. Angewandte Chemie-International Edition， 2015， 54（8）: 2431-2435. DOI: 10.1002/anie.201408247.

50 Tian Q Q， Wang Y， Deng R J， et al. Carbon nanotube enhanced label-free detection of microRNAs based on hairpin probe triggered solid-phase rolling-circle amplification［J］. Nanoscale， 2015.7: 987-993. DOI: 10.1039/c4nr05243a

51 M iao P， Wang B D， Meng F Y， et al. Ultrasensitive detectionofm icroRNAthroughrollingcircle amplification on a DNA tetrahedron decorated electrode［J］. Bioconjugate Chemistry， 2015， 26（3）: 602-607. DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.5b00064.

52 Gao Z Q， Yang Z C. Detection of microRNAs using electrocatalytic nanoparticle tags［J］. Analytical Chem istry，2006， 78（5）: 1470-1477. DOI: 10.1021/ ac051726m.

53 Kilic T， Topkaya S N， Ozkan A D， et al. Electrochemical based detection of microRNA， mir21 in breast cancer cells［J］. Biosensors & Bioelectronics， 2012， 38（1）: 195-201. DOI: 10.1016/j.bios.2012.05.031.

54 Hong C Y， Chen X， Liu T， et al. Ultrasensitive electrochemical detection of cancer-associated circulating microRNA in serum samples based on DNA concatamers［J］. Biosensors & Bioelectronics， 2013， 50: 132-136. DOI: 10.1016/j.bios.2013.06.040.

55 Tran H V， Piro B， Reisberg S， et al. Antibodies directed to RNA/DNA hybrids: an electrochemical immunosensor for microRNAsdetectionusinggraphene-composite electrodes［J］. Analytical Chem istry， 2013， 85（17）: 8469-8474. DOI: 10.1021/ac402154z.

56Tran H V， Piro B， Reisberg S， et al. Label-free and reagentless electrochemical detection of microRNAs using a conducting polymer nanostructured by carbon nanotubes: application to prostate cancer biomarker m iR-141［J］. Biosensors & Bioelectronics， 2013， 49: 164-169. DOI: 10.1016/j.bios.2013.05.007.

57 Bartosik M， Hrstka R， Palecek E， et al. Magnetic bead-based hybridization assay for electrochemical detection of microRNA［J］. Analytica Chimica Acta， 2014，813: 35-40. DOI:10.1016/j.aca.2014.01.023.

58 Li F， Peng J， Wang J， et al. Carbon nanotube-based label-free electrochemical biosensor for sensitive detection of miRNA-24［J］. Biosensors & Bioelectronics，2014， 54: 158-164. DOI: 10.1016/j.bios.2013.10.061.

59 Xia N， Zhang L， Wang G， et al. Label-free and sensitive strategy for m icroRNAs detection based on the formation of boronate ester bonds and the dual-amplification of gold nanoparticles［J］. Biosensors & Bioelectronics， 2013， 47: 461-466. DOI: 10.1016/j.bios.2013.03.074.

60 Wang Z， Zhang J， Guo Y， et al. A novel electrically magnetic-controllable electrochemical biosensor for the ultra sensitive and specific detection of attomolar level oralcancer-relatedmicroRNA［J］.Biosensors& Bioelectronics， 2013， 45: 108-113. DOI: 10.1016/j.bios. 2013.02.007.

61 Peng Y F， Gao Z Q. Amplified detection of microRNA based on ruthenium oxide nanoparticle- initiated deposition of an insulating film［J］. Analytical Chemistry，2011， 83（3）: 820-827. DOI: 10.1021/ac102370s.

62 Christopher P， Mathias S S. Electrochemical detection of microRNAs via gap hybridization assay［J］. Analytical Chemistry， 2010， 82（11）: 4434-4440. DOI: 10.1021/ ac100186p.

63 Rastislav L， Tonya M H， Michael J T， et al. Using self-assembly to control the structure of DNA monolayers on gold: A neutron reflectivity study［J］. Journal of the American Chem ical Society， 1998， 120（38）: 9787-9792. DOI: 10.1021/ja981897r.

64 Azimzadeh M， Rahaie M， Nasirizadeh N. et al. An electrochemical nanobiosensor for plasma miRNA-155，based on graphene oxide and gold nanorod， for early detection of breast cancer［J］. Biosens Bioelectron， 2016，77: 99-106. DOI: 10.1016/j.bios.2015.09.020.

65 Zhang J， Wu D Z， Cai S X， et al. An immobilization-free electrochemical impedance biosensor based on duplexspecific nuclease assisted target recycling for amplified detection of microRNA［J］. Biosensors & Bioelectronics，2016， 75: 452-457. DOI: 10. 1016/j.bios.2015.09.006.

66 YANG Mengsu， Mcgovern M E， Thompson M. Genosensor technology and the detection of interfacial nucleic acid Chemistry［J］. Analytica Chimica Acta， 1997，346（3）: 259-275. DOI: 10.1016/S0003-2670（97）90055-6.

67 Pei H， Zuo X L， Zhu D， et al. Functional DNA nanostructures for theranostic applications［J］. Accounts ofChem ical Research， 2014， 47（2）: 550-559. DOI: 10.1021/ ar400195t.

68 Pei H， Lu Na， Wen Yanli， et al. A DNA nanostructure-based biomolecular probe carrier platform for electrochemical biosensing［J］. Advanced Materials，2010， 22（42）: 4754-4758. DOI: 10.1002/adma.201002767.

69 Ge Z L， Pei H， Wang LH， et al. Electrochemical single nucleotide polymorphisms genotyping on surface immobilizedthree-dimensionalbranchedDNA nanostructure［J］. Science China Chem istry （in China），2011， 54（8）: 1273-1276. DOI: 10.1007/s11426-011-4327-6.

70 Wen Y， Liu G， Pei H， et al. DNA nanostructure-based ultrasensitive electrochemical m icroRNA biosensor［J］. Methods， 2013， 64（3）: 276-282. DOI: 10.1016/iymeth. 2013.07.035.

71 Miao P， Wang B D， Chen X F， et al. Tetrahedral DNA nanostructure-based microRNA biosensor coupled with catalytic recycling of the analyte［J］. Acs Applied Materials & Interfaces， 2015， 7（11）: 6238-6243. DOI: 10.1021/acsam i.5b01508.

72 王旭丹， 楊惠玲， 郭禹標(biāo)， 等. 不同輻射抗拒鼻咽癌細(xì)胞微小RNA差異表達(dá)的研究［J］. 中國病理生理雜質(zhì)，2007， 23（6）: 1045-1048. WANG Xudan， YANG Huiling， GUO Yubiao， et al. Discrepancy of microRNA in different radioresistant nasopharyngeal carcinoma cells［J］. Chinese Journal of Pathophysiology， 2007， 23（6）: 1045-1048.

73 Cui F M， Sun XJ， Ding X， et al. Differential expression profiles of micrornas in m ice internally exposed to tritiated water［J］. Toxicological & Environmental Chem istry，2011，93（4）:738-751.DOI:10. 1016/j.toxlet.2010.03.250

74 肖海楠， 段廣新， 張燕娟， 等. miRNA對肺腺癌 A549細(xì)胞的輻射增敏效應(yīng)［J］. 蘇州大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）， 2012，32（2）: 157-160.XIAO Hainan， DUAN Guangxin， ZHANG Yanjuan， et al. The radiation sensitization effect of miRNA-34c on A549 cell［J］. Journal of Soochow University: M edical Science Edition， 2012， 32（2）: 157-160.

75 Tjensvoll K， Nordg?rd O， Smaaland R. Circulating tumor cells in pancreatic cancer patients: methods of detection and clinical implications［J］. International Journal of Cancer， 2014， 134（1）: 1-8. DOI: 10.1002/ijc.28134.

76 Halm U， Schumann T， Schiefke I， et al. Decrease of CA 19-9 during chemotherapy with gemcitabine predicts survival time in patients w ith advanced pancreatic cancer［J］. British Journal of Cancer， 2000， 82（5）: 1013-1016. DOI: 10.1054/bjoc.1999.1035.

77 Mark P L. Cancer after exposure to radiation in the course of treatment for benign and malignant disease［J］. The Lancet Oncology， 2001， 2（4）: 212-220. DOI: 10.1016/ S1470-2045（00）00291-6.

Electrochemical-based biosensors for quantification micro RNA

LI Fuwu WANG Lihua SONG Shiping
(Shanghai Institute of Applied Physics, Chinese Academy of Sciences, Jiading Campus, Shanghai 201800, China)

This review outlines the materials of recognition element， methods of signal amplification， interface regulation of electrode and the potential application of the research area in expression level of miRNA influence by radiation.

MicroRNA， Cancer， Biomarker， Electrochemical， Biosensor

CLC O653

MicroRNA（miRNA）是一種內(nèi)源性、非編碼的具有高度保守性的由大約 23個核糖核苷酸組成的RNA寡聚物，在動物和植物中通過和編碼蛋白的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA以堿基互補(bǔ)配對的方式結(jié)合，直接對他們的轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行抑制［1-3］。最早是Lee等［4］在C. elegans處于發(fā)育后期的胚胎中發(fā)現(xiàn)lin-4 RNA對lin-14蛋白的表達(dá)起著一種抑制的作用。在后來的研究中發(fā)現(xiàn)miRNA是從染色體中轉(zhuǎn)錄出來，為一個大約由 70個核苷酸組成的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物叫做Pri-miRNA［5］，一個Pri-miRNA分子通常包含有幾個miRNA的序列。Pri-miRNA通過折疊形成一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)（含有不能完全互補(bǔ)配對的莖，其長度從幾百到幾千個堿基不等），進(jìn)而被RNase III型內(nèi)切酶 Drosha和 Dicer切割成大約 70 bp的Pre-miRNA，而后被Exprotin5蛋白運(yùn)出細(xì)胞核之后被細(xì)胞質(zhì)中的Dicer切割產(chǎn)生大約20 bp的miRNA雙螺旋，解旋后其中一條就成為具有抑制基因表達(dá)功能的miRNA，另外一條則被降解，偶爾也會有變成兩條miRNA的情況［6］。miRNA的作用方式是通過與mRNA的3'末端非轉(zhuǎn)錄的區(qū)域結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［3］。如果一個miRNA和靶標(biāo)mRNA上的序列不能完全互補(bǔ)，則抑制該 mRNA的翻譯過程。若完全互補(bǔ)，則該條mRNA將會被降解（見圖1）。根據(jù)miRNA在細(xì)胞內(nèi)的通路，可以以不同階段的miRNA為靶向，設(shè)計不同的探針就可以對細(xì)胞內(nèi)各個階段的miRNA進(jìn)行定量檢測。

LI Fuwu （male） was born in March 1991 and received his master degree from Shanghai Institute of Applied Physics，

21 March 2016； accepted 21 April 2016

Ph.D. SONG Shiping， professor， E-mail: spsong@sinap.ac.cn

O653

10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.030101

國家重大科學(xué)研究計劃（2012CB932600、2013CB932800）資助

李甫梧，男，1991年3月出生，2016年6月于中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所獲理學(xué)碩士學(xué)位，生物物理專業(yè)，E-mail: fw lisinap@163.com

宋世平，博士，研究員，E-mail: spsong@sinap.ac.cn

初稿2016-03-21，修回2016-04-21

Supported by the National Basic Research Program of China （2012CB932600， 2013CB932800）

Chinese Academy of Sciences in June 2016， majoring in biophysics. E-mail: fw lisinap@163.com