胡兵榮，王娟，羅海華，姜勇

(南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東省蛋白質(zhì)組學(xué)重點實驗室，廣州510515)

?

MRP8/MRP14對宮頸癌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制

胡兵榮，王娟，羅海華，姜勇

(南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東省蛋白質(zhì)組學(xué)重點實驗室，廣州510515)

目的探討髓樣相關(guān)蛋白8/14異源二聚體(MRP8/MRP14)對宮頸癌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人宮頸癌Hela細(xì)胞，加入MRP8/MRP14(觀察組)，另設(shè)對照組加入等體積PBS，于培養(yǎng)12、24、48、72 h分別采用CCK8法檢測兩組細(xì)胞增殖能力。取Hela細(xì)胞進(jìn)行核質(zhì)分離，加入MRP8/MRP14共培養(yǎng)30 min，采用Western blot法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路蛋白p38 MAPK、JNK及細(xì)胞增殖相關(guān)信號通路蛋白ERK1/2、NF-κB表達(dá)。將Hela細(xì)胞分為MRP8/MRP14組和p38 MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB抑制劑組，RP8/MRP14組加入MRP8/MRP14；抑制劑組先分別加入p38 MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB抑制劑預(yù)處理2 h，再加入MRP8/MRP14；采用CCK8法觀察各組細(xì)胞增殖能力。結(jié)果觀察組加入MRP8/MRP14培養(yǎng)12、24、48、72 h后，細(xì)胞增殖能力均高于對照組，且隨時間延長，細(xì)胞增殖能力逐漸增強(qiáng)(P均<0.05)。觀察組加入MRP8/MRP14培養(yǎng)30 min后，與對照組比較，p38 MAPK、JNK、ERK1/2活性明顯升高，NF-κB在細(xì)胞核中的表達(dá)升高(P均<0.05)。p38 MAPK、JNK抑制劑組細(xì)胞增殖能力較MRP8/MRP14組增強(qiáng)；ERK、NF-κB抑制劑組細(xì)胞增殖能力較MRP8/MRP14組減弱(P均<0.05)。結(jié)論 MRP8/MRP14能夠促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖，其機(jī)制與p38 MAPK、JNK、ERK1/2及NF-κB等多條相關(guān)信號通路被激活有關(guān)。

宮頸癌；髓樣相關(guān)蛋白8/14異源二聚體；細(xì)胞增殖

髓樣相關(guān)蛋白8(MRP8)和髓樣相關(guān)蛋白14(MRP14)均屬于鈣結(jié)合蛋白S100家族成員，是重要的內(nèi)源性損傷相關(guān)模式分子[1]，在體內(nèi)主要以異源二聚體MRP8/MRP14的形式發(fā)揮其生物學(xué)活性。MRP8/MRP14的生物學(xué)功能極其豐富，參與蛋白質(zhì)磷酸化、細(xì)胞骨架重塑、細(xì)胞遷移、調(diào)節(jié)鈣離子穩(wěn)態(tài)、花生四烯酸代謝、對中性粒細(xì)胞中的NADPH氧化酶的調(diào)控等過程[2]。研究表明，MRP8/MRP14與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[3]。p38 MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB在多種腫瘤中廣泛表達(dá)并參與介導(dǎo)細(xì)胞的分化、增殖及凋亡[4～6]。目前,關(guān)于MRP8/MRP14在宮頸癌中的作用少見報道。2015年2～12月，我們觀察了MRP8/MRP14對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的影響，并觀察細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白p38 MAPK、JNK及細(xì)胞增殖通路相關(guān)蛋白ERK1/2、NF-κB的表達(dá)情況，探討MRP8/MRP14在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料子宮頸癌Hela細(xì)胞株由本實驗室凍存。MRP8與MRP14蛋白分別使用大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞從構(gòu)建完成的原核表達(dá)載體中純化得到，參照文獻(xiàn)[4]方法按等摩爾比混勻，使其形成MRP8/MRP14。核質(zhì)分離勻漿緩沖液和核質(zhì)分離核提取緩沖液參照文獻(xiàn)[5]方法配置。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將Hela細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞生長至85%融合時進(jìn)行傳代。

1.3MRP8/MRP14對細(xì)胞增殖能力影響觀察取對數(shù)生長期細(xì)胞，以3×103/孔接種于96孔板，觀察組加入1.5 μg/mL的MRP8/MRP14，另設(shè)對照組加入等體積PBS。培養(yǎng)12、24、48、72 h后加入10 μL CCK8，繼續(xù)孵育2 h。使用酶標(biāo)儀于450 nm處檢測各孔吸光度A值，以此表示細(xì)胞增殖能力。

1.4MRP8/MRP14對p38 MAPK、JNK、ERK1/2活性及NF-κB表達(dá)影響觀察采用Western blot法。取對數(shù)生長期細(xì)胞，以3×105/皿接種于培養(yǎng)皿，觀察組加入1.5 μg/mL的MRP8/MRP14，另設(shè)對照組加入等體積PBS。培養(yǎng)30 min后加入相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜，與1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的抗鼠IgG室溫孵育1 h。經(jīng)化學(xué)發(fā)光底物顯色，利用Kodak IS4000R圖像工作站檢測p38 MAPK、JNK、ERK1/2活性。另取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行核質(zhì)分離，按上述方法檢測細(xì)胞核中NF-κB表達(dá)，以Lamin B1單克隆抗體作為內(nèi)參，以目的蛋白與內(nèi)參的灰度比值表示目的蛋白的活性或表達(dá)量。

1.5p38 MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB抑制劑對MRP8/MRP14作用影響觀察取對數(shù)生長期細(xì)胞，以3×103/孔接種于96孔板，分為MRP8/MRP14組和p38 MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB抑制劑組，每組設(shè)5個復(fù)孔。MRP8/MRP14組加入1.5 μg/mL MRP8/MRP14；抑制劑組先分別加入SB203580、SP600125、PD98095、Bay117082預(yù)處理2 h，再加入1.5 μg/mL MRP8/MRP14。培養(yǎng)12、24、48、72 h后加入10 μL CCK8孵育2 h，使用酶標(biāo)儀于450 nm處檢測各孔吸光度A值,以此表示細(xì)胞增殖能力。

2　結(jié)果

2.1MRP8/MRP14對細(xì)胞增殖能力的影響培養(yǎng)24 h后，觀察組較對照組細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng)(P均<0.05)，隨作用時間延長，細(xì)胞增殖更加明顯(P均<0.01)。

表1　MRP8/MRP14對細(xì)胞增殖的影響

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2MRP8/MRP14對p38 MAPK、JNK、ERK1/2活性及NF-κB表達(dá)的影響加入MRP8/MRP14后，p38 MAPK、JNK、ERK1/2活性及細(xì)胞核內(nèi)NF-κB 表達(dá)均明顯增加。見表2。

表2　MRP8/MRP14對p38 MAPK、JNK、ERK1/2活性及NF-κB表達(dá)的影響

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3p38 MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB抑制劑對MRP8/MRP14的細(xì)胞增殖作用的影響與MRP8/MRP14組比較，p38 MAPK、JNK抑制劑組細(xì)胞增殖能力隨時間延長逐漸增強(qiáng)，ERK1/2、NF-κB抑制劑組細(xì)胞增殖能力隨時間延長逐漸下降(P<0.05或<0.01)。見表3。

表3　p38 MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB抑制劑對MRP8/MRP14細(xì)胞增殖作用的影響

注：與MRP8/MRP14組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3　討論

MRP8/MRP14屬鈣結(jié)合蛋白S100家族成員，目前其研究主要集中在炎癥及自身免疫性疾病發(fā)展過程中的作用。S100蛋白家族與腫瘤也有密切關(guān)系，廣泛參與胃癌、前列腺癌、皮膚癌、食管癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移及免疫耐受過程[7]。探討MRP8/MRP14在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制具有重要意義。

本研究顯示，MRP8/MRP14可顯著促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖。進(jìn)一步觀察顯示，MRP8/MRP14可促進(jìn)腫瘤增殖、凋亡相關(guān)信號通路中的重要激酶p38 MAPK、JNK、ERK1/2活性明顯升高，細(xì)胞核中的NF-κB表達(dá)也顯著增多，表明它們相對應(yīng)的信號通路被激活。使用ERK1/2及NF-κB磷酸化激酶抑制劑后，Hela細(xì)胞增殖能力明顯減弱；使用p38 MAPK、JNK磷酸化激酶抑制劑后，由于促凋亡通路被抑制，MRP8/MRP14的促細(xì)胞增殖能力反而稍有增強(qiáng)。

早期研究發(fā)現(xiàn)，多種致炎因子可以激活Hela細(xì)胞中的p38 MAPK信號通路，促進(jìn)抑癌基因c-myc翻譯增加，從而啟動Hela細(xì)胞凋亡程序[8]；JNK通路活化使c-Jun磷酸化水平增加并增強(qiáng)Caspase-3活性，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[9]；ERK1/2通過調(diào)節(jié)可易位基因c-myc的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[10]；腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中NF-κB激酶活性增加與腫瘤生長轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11]。因此，細(xì)胞增殖多數(shù)是由于促進(jìn)細(xì)胞增殖的通路如ERK1/2和NF-κB被活化或促進(jìn)細(xì)胞凋亡的通路如p38 MAPK、JNK被抑制所產(chǎn)生的表觀效應(yīng)。本研究顯示，在宮頸癌Hela細(xì)胞中，以上多種作用明確的信號通路均在MRP8/MRP14作用后活化。已有報道顯示，MRP8/MRP14在前列腺癌增殖凋亡過程中能同時激活p38 MAPK通路和NF-κB通路，從而發(fā)揮細(xì)胞因子樣雙向作用[4]。提示MRP8/MRP14對宮頸癌細(xì)胞的增殖效應(yīng)的表現(xiàn)可能不僅僅是由于細(xì)胞增殖相關(guān)通路的活化或者細(xì)胞凋亡通路被抑制，這個過程與p38 MAPK、JNK、ERK1/2及NF-κB等多條增殖凋亡信號通路均密切相關(guān)。宮頸癌細(xì)胞受到MRP8/MRP14刺激后，細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)增殖的信號通路與促進(jìn)凋亡的信號通路同時被激活，而最終MRP8/MRP14對宮頸癌細(xì)胞作用的總效應(yīng)表現(xiàn)為促增殖作用。這可能是由于促增殖效應(yīng)通路活化更強(qiáng)，而促細(xì)胞凋亡效應(yīng)通路的作用相對較弱，于是細(xì)胞產(chǎn)生的促增殖效應(yīng)更明顯，從而掩蓋了MRP8/MRP14導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生的促凋亡效應(yīng)。因此推測，MRP8/MRP14可能是快速進(jìn)展型宮頸癌的生物學(xué)指標(biāo)之一，如果宮頸癌局部組織中浸潤有MRP8/MRP14，很可能會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖加快。通過抑制相應(yīng)促增殖信號通路(如ERK1/2和NF-κB)或活化相應(yīng)促凋亡信號通路(如p38 MAPK和JNK)可能有助于控制腫瘤的進(jìn)展。

[1] Ibrahim ZA, Armour CL, Phipps S, et al. RAGE and TLRs: relatives, friends or neighbours[J]. Mol Immunol, 2013,56(4):739-744.

[2] Gebhardt C, Nemeth J, Nagel P, et al. S100A8 and S100A9 in inflammation and cancer[J]. Biochem Pharmacol, 2006,72(11):1622-1631.

[3] Ehrchen JM, Sunderk?tter C, Foell D, et al. The endogenous Toll-like receptor 4 agonist S100A8/S100A9 (calprotectin) as innate amplifier of infection, autoimmunity, and cancer[J]. J Leukoc Biol, 2009,86(3):557-566.

[4] Hermani A, De Servi B, Medunjanin S, et al. S100 A8 and S100A9 activate MAP kinase and NF-kappaB signaling pathways and trigger translocation of RAGE in human prostate cancer cells[J]. Exp Cell Res, 2006,312(2):184-197.

[5] 王琳,李國文,顧浩,等.JNK信號通路在熱化療抑制人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長中的作用[J].山東醫(yī)藥,2009,49(33):20-22.

[6] Hermani A, De Servi B, Medunjanin S, et al. S100A8 and S100A9 activate MAP kinase and NF-κB signaling pathways and trigger translocation of RAGE in human prostate cancer cells[J]. Exp Cell Res, 2006,312(2):184-197.

[7] Hiratsuka S, Watanabe A, Sakurai Y, et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase[J]. Cell Biol, 2008,10(11):1349-1355.

[8] Yu M, Blomstrand E, Chibalin AV, et al. Marathon running increases ERK1/2 and p38 MAP kinase signalling to downstream targets in human skeletal muscle[J]. J Physiol， 2001,536(1):273-282.

[9] Lai B, Pu H, Cao Q, et al. Activation of caspase-3 and c-Jun NH2-terminal kinase signaling pathways involving heroin-induced neuronal apoptosis[J]. Neurosci Lett, 2011,502(3):209-213.

[10] Chakraborti S, Mandal M, Das S, et al. Regulation of matrix metalloproteinases: an overview[J]. Mol Cell Biochem, 2003,253(1):269-285.

[11] Ismail HA, Lessard L, Mes-Masson AM, et al. Expression of NF-kappaB in prostate cancer lymph node metastases[J]. Prostate, 2004,58(3):308-313.

Effects of MRP8/MRP14 on proliferation of cervical cancer cells and the mechanism

HUBingrong,WANGJuan,LUOHaihua,JIANGYong

(SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

ObjectiveTo investigate the effect of myeloid-related protein-8/14 heterodimer (MRP8/MRP14) on the proliferation of cervical cancer Hela cells and the possible mechanism. MethodsCervical cancer cell line Hela was cultured in vitro and treated with MRP8/MRP14 (observation group) or PBS(control group), then we measured the proliferation ability at 12, 24, 48 and 72 h with CCK8. The nuclear of Hela cells was separated and then Hela cells were cultured with MRP8/MRP14 for 30 min. The expression of apoptosis-related signaling pathway protein p38 MAPK, JNK and proliferation-related signaling pathway protein ERK1/2 and NF-κB was measured by Western blotting. Hela cells were divided into MRP8/MRP14 group, p38 MAPK, JNK, ERK1/2 and NF-κB inhibitor group. Hela cells in the MRP8/MRP14 group were only treated with MRP8/MRP14, and the inhibitor groups were pretreated with p38 MAPK, JNK, ERK1/2 or NF-κB inhibitor for 2 h then were incubated with MRP8/MRP14. The proliferation ability of Hela cells were detected by CCK8. ResultsCompared with the control group, MRP8/MRP14 enhanced the Hela cell proliferation ability at 12, 24, 48 and 72 h, and the proliferation ability increased gradually as time passed in the observation group (allP<0.05). After the treatment of MRP8/MRP14 for 30 min, p38 MAPK, JNK and ERK1/2 were activated and the expression of NF-κB in the nucleus was increased (allP<0.05). In the p38 MAPK and JNK inhibitor groups, the proliferation ability of Hela cells were increased, while the proliferation ability of Hela cells were decreased in the ERK and NF-κB inhibitor groups as compared with that of the MRP8/MRP14 group (allP<0.05). ConclusionMRP8/MRP14 can promote the proliferation of Hela cells and this mechanism may be related with the activation of p38, JNK, ERK1/2 and NF-κB signaling pathways.

cervical carcinoma; myeloid-related protein-8/14 heterodimer; cell proliferation

國家自然科學(xué)基金資助項目(81030055，81372030)。

胡兵榮(1990-)，女，碩士研究生，主要研究方向為炎癥與腫瘤細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。E-mail： 1053556694@qq.com

簡介：姜勇(1964-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向為炎癥及細(xì)胞信號傳導(dǎo)。E-mail: jiang48231@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.22.008

R737.33

A

1002-266X(2016)22-0024-03

2016-01-22)