張有辰，金正勇，許東元

(1延邊大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林延吉133000；2延邊大學(xué)形態(tài)實(shí)驗(yàn)中心)

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1,25-二羥基維生素D3對高氧環(huán)境中肺腺癌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制

張有辰1，金正勇1，許東元2

(1延邊大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林延吉133000；2延邊大學(xué)形態(tài)實(shí)驗(yàn)中心)

目的觀察1,25-二羥基維生素D3[1,25(OH)2VitD3]對高氧環(huán)境中人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的影響，并探討其機(jī)制。方法取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，隨機(jī)分為5組。A組于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，不處理；B組于高氧環(huán)境中培養(yǎng)，不處理；C、D、E組于高氧環(huán)境中培養(yǎng)，并分別加入終濃度為0.1、1、10 μmol/L的1,25(OH)2VitD3處理48 h。流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞數(shù)并計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)，Western blot法檢測細(xì)胞中的Bcl-2、Bax蛋白。結(jié)果A、B、C、D、E組細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為2.45±0.91、40.83±4.96、42.65±4.85、63.43±5.61、76.47±5.94，A組與其他四組比較P均<0.05，B、C組比較P>0.05,D、E組與B、C組比較P均<0.05，D、E組比較P<0.05。與A組比較，B、C、D、E組Bcl-2蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax值均下降，而Bax蛋白表達(dá)均增高，P均<0.05。B、C組Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax值比較，P均>0.05。與B、C組比較，D、E組Bcl-2蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax值下降，而Bax蛋白表達(dá)增高，P均<0.05。與D組比較，E組Bcl-2蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax值下降(P均<0.05)，而Bax蛋白表達(dá)變化不明顯(P>0.05)。結(jié)論1,25(OH)2VitD3可促進(jìn)高氧環(huán)境中肺腺癌A549細(xì)胞凋亡，可能與其調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax平衡有關(guān)。

肺腫瘤；A549細(xì)胞；1,25-二羥基維生素D3；高氧；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；Bcl-2蛋白；Bax蛋白

肺癌作為最常見的惡性腫瘤之一，居癌癥死亡首位[1]。氧氣吸入廣泛應(yīng)用于肺癌的治療，高氧可迅速提高血氧含量，改善或糾正組織缺氧，防止或減輕缺氧性損害的發(fā)生、發(fā)展。研究表明，高氧可誘導(dǎo)乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對放化療的敏感性[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，紫外線照射可促進(jìn)維生素D合成，減少肺癌的發(fā)生率[3]。1,25-二羥基維生素D3[1,25(OH)2VitD3]作為固醇類激素，可從食物及藥物中獲取并被人體吸收利用。研究報(bào)道，1,25(OH)2VitD3能抑制肺腺癌細(xì)胞增生,調(diào)控細(xì)胞周期,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4]。但1,25(OH)2VitD3對高氧環(huán)境中肺腺癌的細(xì)胞凋亡是否有影響，尚需進(jìn)一步研究。2015年3月～2016年1月，我們觀察了1,25(OH)2VitD3對高氧環(huán)境中肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的影響，并探討其可能的機(jī)制，為肺癌的綜合治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料1,25(OH)2VitD3購自美國Sigma公司，A549細(xì)胞由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供；Annexin V-FITC/PI試劑盒購自美國BD公司，流式細(xì)胞儀(BD FACSVerse公司)；凋亡調(diào)控相關(guān)抗體(Bcl-2，Bax)購自Santa Cruz公司，四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自GIBCO公司，DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)液購自Thermo scientific公司，胎牛血清購自Thermo Fisher scientific公司，胰蛋白酶-EDTA消化液購自Solarbio公司，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自Solarbio公司；紫外分光光度計(jì)(eppndorf BioPhotometer公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(STIK公司)，電泳儀(BIO-RAD公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理將A549細(xì)胞復(fù)蘇后，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，隨機(jī)分為5組，每組設(shè)9個(gè)平行復(fù)孔。A組仍于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，不處理；B組于高氧培養(yǎng)箱(即向封閉培養(yǎng)箱內(nèi)通入O2、CO2及N2混合氣30 min，流量5 L/min，當(dāng)測得氧濃度為80%～85%時(shí)封閉培養(yǎng)箱)中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)液同A組，不處理；C、D、E組于高氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至40%～50%，分別給予0.1、1、10 μmol/L的1,25(OH)2VitD3處理48 h。

1.2.2細(xì)胞凋亡檢測采用流式細(xì)胞術(shù)。取各組細(xì)胞，加入胰蛋白酶-EDTA消化液，PBS洗滌。取100 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻，后加入5 μL的Propidium Iodide混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100。以上步驟重復(fù)10次，取平均值。

1.2.3細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白檢測采用Western blot法。取各組細(xì)胞，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化，用PBS洗滌細(xì)胞2次。加入RIPA細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑，充分?jǐn)噭?離心抽提液；提取蛋白樣本以8%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行還原性SDS-PAGE電泳,半干式轉(zhuǎn)膜(PVDF膜),300 mA恒流40 min。封閉液封閉后，PVDF膜過夜；PBS-T緩沖液中充分振蕩清洗，分別滴加Bcl-2、Bax蛋白一、二抗(稀釋比例均為1∶2 000)；ECM顯色，X線膠片顯影、定影。將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用ImageJ2軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的灰度值，以此表示目的蛋白的表達(dá)量。以上步驟重復(fù)10次，取平均值。

2　結(jié)果

2.1各組細(xì)胞凋亡指數(shù)比較A、B、C、D、E組細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為2.45±0.91、40.83±4.96、42.65±4.85、63.43±5.61、76.47±5.94，A組與其他四組比較P均<0.05，B、C組比較P>0.05,D、E組與B、C組比較P均<0.05，D、E組比較P均<0.05。

2.2各組細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較見表1。

表1　各組細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax值比較

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05；與D組比較，▽P<0.05。

3　討論

VitD3可用于低鈣血癥、佝僂病、骨軟化癥及嬰兒手足搐搦癥等多種疾病的治療，其不僅能提高人體對鈣、磷的吸收，還能使血漿鈣、磷水平達(dá)到飽和程度[5]。近期研究發(fā)現(xiàn)，1,25(OH)2VitD3對乳腺癌、前列腺癌有強(qiáng)效抗癌活性[6]，補(bǔ)充高劑量VitD3可減少結(jié)直腸癌發(fā)病并延緩病情惡化[7]，提示VitD3可抑制多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，對腫瘤細(xì)胞有殺傷作用[8]；并且，紫外線照射強(qiáng)的地區(qū)與日光照射差的地區(qū)對比，癌癥發(fā)病率明顯降低[9,10]。研究表明，高氧可抑制A549細(xì)胞增殖[11,12]，1,25(OH)2VitD3對肺癌細(xì)胞的增殖、血管新生具有明顯抑制作用[13,14]。但是，1,25(OH)2VitD3對高氧環(huán)境肺癌細(xì)胞凋亡的影響尚不清楚。本研究結(jié)果表明，B、C、D、E組細(xì)胞凋亡指數(shù)高于A組細(xì)胞，D、E組細(xì)胞凋亡指數(shù)高于B、C組，E組高于D組，提示高氧可促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡，1,25(OH)2VitD3能夠增強(qiáng)高氧引起的A549細(xì)胞凋亡，高劑量1,25(OH)2VitD3作用更明顯。

Bax和Bcl-2與大部分細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系，在凋亡的線粒體通路中，Bax和Bcl-2蛋白起著主要作用。Bax為促凋亡因子，Bcl-2為抑制凋亡因子，兩者形成異聚體，改變線粒體膜的滲透性[15]。本研究結(jié)果顯示，各組細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)變化不大，但Bcl-2蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax值明顯降低，高劑量1, 25(OH)2VitD3作用后變化更明顯。這可能是由于大量的氧氣在細(xì)胞內(nèi)堆積，可產(chǎn)生對細(xì)胞有害的活性氧物質(zhì)，并抑制Bcl-2的形成，增加了線粒體對凋亡因素的敏感性，使細(xì)胞凋亡的速度變快[16，17]。胡萍萍等[18]實(shí)驗(yàn)表明，VitD可促使p38磷酸化水平上調(diào)?；罨膒38 MAPK信號途徑作用于Bcl-2，使Bcl-2/Bax二聚體解聚，促進(jìn)細(xì)胞色素 C釋放，使pro-Caspase3轉(zhuǎn)換為活性Caspase3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。由此我們推測，1,25(OH)2VitD3也可能通過p38途徑使Bcl-2蛋白失活，解除Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的作用，最終增強(qiáng)高氧誘導(dǎo)的A549肺癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，1,25(OH)2VitD3可促進(jìn)高氧環(huán)境中A549細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax平衡有關(guān)，為今后研究肺癌的防治提供了新的方向。

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Effects of 1,25(OH)2VitD3on hyperoxia-induced apoptosis of lung adenocarcinoma cells

ZHANGYouchen1,JINZhengyong,XUDongyuan

(1AffiliatedHospitalofYanbianUniversity,Yanji133000,China)

Objective To observe the effects of 1, 25-dihydroxyvitamin D3[1,25(OH)2VitD3]on the apoptosis of human lung adenocarcinoma A549 cells in the high oxygen environment and to explore its mechanism. MethodsA549 cells in the logarithmic phase were randomly divided into five groups: groups A, B, C, D and F. Cells in the group A were cultured at 37 ℃, 5% CO2humidified incubator, and were not processed; cells in the group B were cultured in high-oxygen environment, and were not processed; cells in the groups C, D and E were cultured in high oxygen environment, and then were treated with 0.1, 1 and 10 μmol/L of 1,25 (OH)2VitD3for 48 h. Apoptotic cells were detected by flow cytometry, and the Bcl-2, Bax protein was detected by Western blotting.ResultsThe apoptosis indexes of groups A, B, C, D and E group were 2.45±0.91, 40.83±4.96, 42.65±4.85, 63.43±5.61 and 76.47±5.94, respectively. Significant difference was found between group A and groups B, C, D and E, allP<0.05; no significant difference was found between group B and group C,P>0.05; significant difference was found between groups D, E and groups B, C, allP<0.05; and significant difference was found between group D and group,P<0.05. Compared with group A, the Bcl-2 protein expression and Bcl-2/Bax value were decreased, but the Bax protein expression was increased in the groups B, C, D and E (allP<0.05). No significant difference was found in the Bcl-2, Bax protein expression and Bcl-2/Bax value between group B and group C, allP>0.05. Compared with group B and group C, the Bcl-2 protein expression and Bcl-2/Bax value were decreased, but the Bax protein expression was increased in the groups D and E (allP<0.05). Compared with group D, the Bcl-2 protein expression and Bcl-2/Bax value were decreased (allP<0.05), and the Bax protein expression did not change in the group E (P>0.05).Conclusion1,25(OH)2VitD3may promote the apoptosis of lung adenocarcinoma A549 cells in a high oxygen environment by regulating Bcl-2/Bax balance.

lung neoplasms; A549 cells; 1, 25-dihydroxyvitamin D3; hyperoxia; cell proliferation; apoptosis; Bcl-2 protein; Bax protein

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160083)。

張有辰(1987-)，女，博士研究生，主要研究方向?yàn)楹粑到y(tǒng)疾病。E-mail: zangyoujin123@163.com

簡介：許東元(1974-)，男，副教授，主要研究方向?yàn)榻M織修復(fù)與再生。E-mail： dyxu@ybu.edu.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.22.004

R734.2

A

1002-266X(2016)22-0012-03

2016-01-12)