周國慶，李華，張東升，杜艷萍，李強(qiáng)，葉仕根（大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023）

周國慶，李華，張東升，杜艷萍，李強(qiáng)，葉仕根
（大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023）

為修復(fù)刺參Apostichopus japonicus養(yǎng)殖池塘底質(zhì)環(huán)境，根據(jù)菌株對底泥中有機(jī)質(zhì) （COD）、氨氮（NH+4-N）和亞硝酸鹽 （NO-2-N）的去除率，從刺參養(yǎng)殖池塘底泥和商品益生菌中篩選高效降解刺參養(yǎng)殖池塘底質(zhì)有機(jī)污染物的潛在益生芽孢桿菌，并對篩選出的優(yōu)良菌株的產(chǎn)酶能力和降解特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：從分離的11株細(xì)菌中經(jīng)過篩選最終獲得3株優(yōu)良菌株 （N1、DL、R），它們能同時(shí)高效降解底泥中COD、NH+4-N和NO-2-N，5 d內(nèi)對COD的最大去除率分別為45.71%、23.98%、24.97%，對NH+4-N的最大去除率分別為60.54%、36.15%、36.74%，對NO-2-N的最大去除率分別為52.10%、14.41%、28.82%；根據(jù)菌株生理生化特性以及16S rDNA序列分析，N1、DL、R菌株分別為白翎芽孢桿菌Bacillus baekryungensis、地衣芽孢桿菌B.licheniformis和解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步開發(fā)高效的刺參養(yǎng)殖池塘底質(zhì)有機(jī)污染物降解益生菌及復(fù)方制劑提供參考。

刺參；池塘底泥；修復(fù)；芽孢桿菌；分離篩選

刺參Apostichopus japonicus具有極高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，自1953年以來，中國、日本、俄羅斯等國開始了刺參的人工養(yǎng)殖。近年來，刺參養(yǎng)殖規(guī)模迅速擴(kuò)大，2010年中國刺參總產(chǎn)量達(dá)10萬t，產(chǎn)值超過200億元［1-2］，池塘養(yǎng)殖已成為人工養(yǎng)殖刺參的主要方式之一。然而長期單一的刺參養(yǎng)殖模式導(dǎo)致池塘中殘餌、糞便等有機(jī)物不斷積累，造成高溫季節(jié)水中氨氮、亞硝酸鹽含量不斷升高，水質(zhì)惡化，并誘發(fā)各種疾病發(fā)生［3］。養(yǎng)殖戶為了控制海參疾病常使用化學(xué)藥劑，進(jìn)而導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境生態(tài)平衡被破壞以及藥物殘留等一系列問題產(chǎn)生［4］。

應(yīng)用益生菌可快速去除水中殘留有機(jī)物，降低氨氮、亞硝酸鹽含量，提高生物體免疫力，減少疾病頻發(fā)，是當(dāng)今健康綠色養(yǎng)殖的重要手段［3］。然而，現(xiàn)今在刺參養(yǎng)殖中使用的益生菌主要源于針對魚、蝦養(yǎng)殖所用的益生菌［5-6］，由于不同來源的微生物適應(yīng)性不同，在實(shí)際應(yīng)用中常受到環(huán)境條件、土著菌群和養(yǎng)殖品種等影響，造成有益微生物修復(fù)效果具有明顯的差異［7］，且針對刺參源益生菌的研究也較少［8-9］。為了增加刺參源益生菌種，從不同地區(qū)刺參養(yǎng)殖環(huán)境中篩選有益微生物具有重要意義。目前，用來降解有機(jī)污染物的有益菌主要是芽孢桿菌，該菌具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和生存能力［10］，有些菌株還具有降解磷、 氮等功能［11-12］，且在海水中分布廣泛，同時(shí)該菌也是刺參養(yǎng)殖池塘的優(yōu)勢菌之一［13］。本研究中，從刺參養(yǎng)殖池塘底泥中分離篩選出對環(huán)境修復(fù)效果較好的芽孢桿菌，旨在為刺參養(yǎng)殖池塘環(huán)境修復(fù)提供優(yōu)異菌株。

1 材料與方法

1.1材料

富集培養(yǎng)基：刺參養(yǎng)殖池塘底泥10 g，刺參餌料 （含粗蛋白質(zhì)20%，粗脂肪2%～4%，粗纖維7%，粗灰分22.5%，水分5%，鈣3%）10 g，陳海水1000 mL。

選擇培養(yǎng)基：在富集培養(yǎng)基基礎(chǔ)上每1000 mL加入瓊脂粉15 g。

PY-SW 純化培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏0.5 g，葡萄糖0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，F(xiàn)eSO4· 7H2O 0.01 g，Na2HPO40.01g，瓊脂15 g，陳海水1000 mL。

有機(jī)物降解培養(yǎng)基：刺參池塘底泥15 g，刺參餌料15 g，陳海水1000 mL，煮沸，靜置48 h后用紗布過濾，以5000 r/min離心10 min，取上清液。

上述培養(yǎng)基配制完成后，調(diào)節(jié) pH為7.0～7.5，121℃下滅菌20 min，備用。

1.2方法

1.2.1底泥的采集與處理 在遼寧省大連市皮口鎮(zhèn)隨機(jī)選擇兩個(gè)未發(fā)病且產(chǎn)量較高的刺參養(yǎng)殖池塘，每個(gè)池塘隨機(jī)選取3個(gè)地點(diǎn)采集底泥，去除大顆粒石塊并混勻后裝入滅菌的容器中，帶回實(shí)驗(yàn)室，于4℃下貯藏備用。

1.2.2細(xì)菌的富集與分離 分別取底泥樣品10 g置于無菌試管中，加入90 mL無菌生理鹽水，充分混勻；將各樣品液于80℃下水浴10 min（以殺滅大部分非芽孢細(xì)菌）［10］后，按10%的比例分別接種于90 mL富集培養(yǎng)基中，在20℃條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)1 d，按1%的接種量轉(zhuǎn)接富集培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)1 d，如此連續(xù)富集馴化3次。

取最后1次富集培養(yǎng)液1 mL，同時(shí)將目前市面上用于改善養(yǎng)殖池塘水質(zhì)、底質(zhì)評價(jià)效果較好的兩種商品益生菌，各取1 g；3個(gè)原樣按10倍稀釋法稀釋，取合適稀釋度的菌液0.1 mL，涂布于選擇培養(yǎng)基上，20℃下培養(yǎng)3 d，選擇生長有30～50個(gè)菌落的平板，挑取生長良好的優(yōu)勢菌落，經(jīng)純化培養(yǎng)基多次劃線純化獲得單菌株，分別編號保種。

1.2.3初篩 將細(xì)菌用純化培養(yǎng)基活化后采用平板涂布法接種于選擇培養(yǎng)基上，置于20℃下培養(yǎng)，記錄細(xì)菌的單菌落生長情況，經(jīng)多次試驗(yàn)后選取能在48～72 h內(nèi)生長良好的細(xì)菌，進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色，選取革蘭氏染色為陽性且有芽孢的菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.2.4復(fù)篩 通過對底泥有機(jī)物培養(yǎng)基中化學(xué)耗氧量（COD）、氨氮（NH+4-N）和亞硝酸鹽（NO-2-N）降解能力的測定，篩選合適的芽孢菌株。試驗(yàn)組為各初篩菌株，將每個(gè)菌株接種于150 mL的底泥和餌料液體培養(yǎng)基中，接菌濃度均為1.0×106cfu/mL（即時(shí)以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)）［14］，對照組（C）不加細(xì)菌，加等量的生理鹽水。試驗(yàn)組和對照組均設(shè)4個(gè)平行，在20℃條件下培養(yǎng)5 d后，取一部分培養(yǎng)液，以6000 g離心10 min，測定上清液中COD含量。再取一部分培養(yǎng)液，用0.45 μm的微孔濾膜抽濾后測定NH+4-N和NO-2-N含量。

1.2.5菌株產(chǎn)酶活力的測定 采用點(diǎn)種法［15］，以菌株在淀粉培養(yǎng)基、酪素瓊脂培養(yǎng)基、纖維素培養(yǎng)基和脂酶 （Tween80）培養(yǎng)基［16］上的水解圈直徑與菌落直徑之比來初步測定菌株的產(chǎn)酶能力。

1.2.6菌株對COD、NH+4-N、NO-2-N的去除規(guī)律

試驗(yàn)設(shè)計(jì)同 “1.2.4”節(jié)，每日測定復(fù)篩菌株對底泥、餌料中COD、NH+4-N、NO-2-N的去除率，測定方法同 “1.2.4”節(jié)，共測定5 d。

1.2.7菌株的鑒定 采用生理生化試驗(yàn)與16S rDNA序列測定相結(jié)合的方法進(jìn)行菌株的鑒定。

采用 《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》方法［16］進(jìn)行菌株生理生化鑒定，細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購自杭州天和微生物試劑有限公司。16S rDNA序列測定：采用水煮法［17］提取所選細(xì)菌的DNA，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的PCR產(chǎn)物送至北京華大基因科技有限公司進(jìn)行測序，所得序列用Blast軟件與GenBank中有關(guān)的16S rRNA進(jìn)行比對。

1.3數(shù)據(jù)處理

利用堿性高錳酸鉀法測定COD含量，用納氏試劑法測定NH+4-N含量，用重氮-偶氮光度法測定NO-2-N含量［18］。去除率計(jì)算公式為

去除率=（1-試驗(yàn)值/本底值）×100%。

利用SPSS 19.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1菌株的篩選

2.1.1芽孢桿菌的初步篩選 從刺參養(yǎng)殖池塘底泥和商品益生菌中共分離純化得到11株細(xì)菌，分別記為N1～N8（分離自底泥）和DL、L、R（分離自商品益生菌）。革蘭氏染色和芽孢染色結(jié)果表明，N1、N2、N4、N5、DL、R均為革蘭氏陽性且具有芽孢的桿菌。

2.1.2復(fù)篩 以養(yǎng)殖池塘底泥和刺參餌料為底物，測定了芽孢桿菌對底泥和餌料中有機(jī)物、NH+4-N 和NO-2-N的降解能力。從表1可見，與對照組（C）相比，各種細(xì)菌對培養(yǎng)基中有機(jī)物、NH+4-N 和NO-2-N均有較高的去除率，但不同菌株之間降解性能有顯著性差異 （P＜0.05）。多重比較分析發(fā)現(xiàn)：N1菌株對3種指標(biāo)的去除能力均為最佳，對COD、NO-2-N的去除率顯著高于其他菌株（P＜0.05），對NH+4-N的去除率顯著高于除DL、R菌株之外的其余各菌株（P＜0.05）；其次為R、DL、N5菌株，而N2、N4菌株對3種指標(biāo)的去除能力較差，且顯著低于其他菌株（P＜0.05）。根據(jù)上述分析，最終選取N1、N5、DL、R 4株芽孢桿菌作為潛在益生菌進(jìn)行后續(xù)研究。

表1　各菌株對刺參池塘底泥和餌料中COD、NH+4-N、NO-2-N的去除率Tab.1 Degradation rates of COD，NH+4-N，and NO-2-N in sediments and diet in sea cucumber Apostichopus japonicus ponds by different strains of Bacillus　%

2.2篩選菌株的產(chǎn)酶特性

從表2可見：4株芽孢桿菌的產(chǎn)酶特性各有不同，N1產(chǎn)蛋白酶、脂酶、淀粉酶，不產(chǎn)纖維素酶；N5產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂酶；而DL 和R均產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶，不產(chǎn)脂酶。在相同細(xì)胞濃度下，各菌株的產(chǎn)酶能力也不同。

表2　各菌株的產(chǎn)酶能力Tab.2 Enzyme production capacity of different strains

2.3篩選菌株對有機(jī)物的降解規(guī)律

從圖1～圖2可見：在試驗(yàn)的4～5 d內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，各菌株對COD、NH+4-N、NO-2-N的去除率較對照組均有顯著增加 （P＜0.05）；自第3天起，N1菌株對COD、NH+4-N、NO-2-N的去除效果均明顯高于其他菌株。

圖1　COD去除率隨時(shí)間的變化Fig.1 Variation in COD degradation rate with time

圖2　氨氮和亞硝酸鹽去除率隨時(shí)間的變化Fig.2 Variation in removal rates of ammonia nitrogen and nitrite nitrogen with time

從圖1可見：4株菌均在第2天時(shí)對COD的去除顯出效果；其中N1、DL、R菌株在第4天時(shí)，對COD的去除率最大，分別為45.71%、23.98%、24.97%，在第5天時(shí)均有所下降；而 N5菌株在第5天時(shí)去除率最大，為22.70%。

從圖2可見：4株菌均在第1天時(shí)對NH+4-N的去除顯出效果，均在第3天時(shí)對NH+4-N的去除率最大，第4天時(shí)去除率開始下降；其中N1菌株在第3天時(shí)的去除效果最好，去除率為60.54%，而N5、DL、R菌株在第3天時(shí)的去除率分別為26.02%、36.15%、36.74%。

從圖2還可見：4株菌均在第1天時(shí)對NO-2-N的去除顯出效果；N1、R、DL菌株均在第4天時(shí)對NO-2-N的去除率最大，其中N1菌株的降解效果最好，為52.10%，R、DL菌株的去除率分別為28.82%、14.41%；而N5菌株在第3天時(shí)去除率最大，為15.61%；自第2天起，N1菌株的去除率顯著高于其他菌株 （P＜0.05），表現(xiàn)出最好的NO-2-N去除能力。

2.4細(xì)菌鑒定

各菌株的生理生化反應(yīng)結(jié)果如表3所示。將各菌株的16S rDNA序列與GenBank中相關(guān)屬種的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對，其中N1菌株與B.baekryungensis strain（KF933693.1）的相似度達(dá)到100%，經(jīng)對比 《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》 （以下稱為 《手冊》），該菌與 《手冊》描述的生理生化反應(yīng)特征相比，除甘露糖外其他均一致，因此，可以鑒定 N1菌株為白翎芽孢桿菌；N5菌株與B.cereus（KJ528873.1）相似度達(dá)到100%，該菌與《手冊》描述的生理生化反應(yīng)特征相比，結(jié)果均一致，因此，可以鑒定N5菌株為蠟狀芽孢桿菌；DL菌株與B.licheniformis（KP119810.1）的相似度達(dá)到100%，該菌與 《手冊》描述的生理生化反應(yīng)特征相比，除甘露醇外其他均一致，因此，可以鑒定DL菌株為地衣芽孢桿菌；R菌株與B.amyloliquefaciens（HQ831421.1）的相似度達(dá)到99%，該菌與《手冊》描述的生理生化反應(yīng)特征均一致，因此，可以鑒定R菌株為解淀粉芽孢桿菌。

表3　菌株的生理生化特性Tab.3 Physiological and biochemical characters of the different strains

3 討論

本研究中共篩選獲得4株芽孢桿菌對底泥中COD、NH+4-N、NO-2-N有去除作用，且不同菌株對不同物質(zhì)的降解能力有所不同，其中白翎芽孢桿菌N1菌株顯示出對COD、NH+4-N、NO-2-N的綜合降解能力最強(qiáng)，對COD的去除率達(dá)到45.71%。這比假單胞菌對 COD的去除率 （50%）［9］略低，比常溫解淀粉芽孢桿菌 （42.33%）［8］略高，但明顯高于低溫白翎芽孢桿菌 （28.97%）［8］。由此可見，不同菌株對COD的降解能力存在較大差異，即使同一種白翎芽孢桿菌，不同分離株的降解能力差異也較大。另外，本試驗(yàn)中為了能反映菌株的實(shí)際使用效果，采用測試底物為50%的池塘底泥加上50%的餌料，而閆法軍等［8］的試驗(yàn)中測試底物為純刺參餌料，其有機(jī)質(zhì)較底泥中的有些物質(zhì)易降解，因此，本試驗(yàn)中分離的白翎芽孢桿菌可作為刺參池塘底泥有機(jī)質(zhì)修復(fù)的潛在益生菌。

有關(guān)地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌應(yīng)用到魚、蝦的報(bào)道較多［19-20］，但應(yīng)用地衣芽孢桿菌修復(fù)刺參水質(zhì)的研究尚未見報(bào)道，而應(yīng)用解淀粉芽孢桿菌的研究僅見閆法軍等［8］有過報(bào)道。本研究中分離的解淀粉芽孢桿菌與之相比，COD降解能力較低，但具有較高的NH+4-N降解能力，地衣芽孢桿菌也顯示出相同的特性。作者認(rèn)為，可以利用該菌株對NH+4-N降解能力強(qiáng)的特性與其他益生菌復(fù)配，以有效去除氨氮。蠟狀芽孢桿菌N5菌株表現(xiàn)出對刺參底泥NH+4-N較高的降解能力，但有報(bào)道認(rèn)為，蠟狀芽孢桿菌某些菌株可引起刺參腐皮綜合征［21］，因此，蠟狀芽孢桿菌作為益生菌應(yīng)用需進(jìn)行更廣泛深入地研究。

細(xì)菌產(chǎn)酶是細(xì)菌降解有機(jī)物的直接原因，細(xì)菌產(chǎn)酶種類和數(shù)量是否符合該底泥有機(jī)質(zhì)決定了該底泥有機(jī)物去除率的大?。?2］。理論上，細(xì)菌產(chǎn)酶數(shù)量越高，有機(jī)質(zhì)去除率越高，本研究中分離的N1菌株與其余3菌株相比，其蛋白酶和脂酶含量較高，淀粉酶含量較低，無纖維素酶，試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株對有機(jī)質(zhì)的去除率較高，說明該菌株的產(chǎn)酶能力與對有機(jī)質(zhì)的去除能力是相符的。

目前，益生菌對水質(zhì)改良效果的研究較多，但對益生菌作用規(guī)律的研究較少，益生菌對水化學(xué)因子的降解規(guī)律研究有助于確定益生菌的使用周期和使用效果。本試驗(yàn)表明，4株菌對COD、NH+4-N、NO-2-N的去除率變化趨勢基本一致，多數(shù)在試驗(yàn)的第3天去除率呈明顯上升趨勢，第4天達(dá)最大，然后呈下降趨勢。這種降解規(guī)律不僅為這4株菌的進(jìn)一步試驗(yàn)研究提供了合理的測定時(shí)間，也為益生菌在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用周期提供了試驗(yàn)依據(jù)。

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Identification and evaluation of degradation of organic material pollutants in sea cucumber Apostichopus japonicus culture ponds by three Bacillus strains

ZHOU Guo-qing，LI Hua，ZHANG Dong-sheng，DU Yan-ping，LI Qiang，YE Shi-gen
（Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea，Ministry of Agriculture，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

Potential beneficial Bacillus with high efficient degradation of organic pollutants was screened from sediments in sea cucumber Apostichopus japonicu culture ponds on the base of removal rate of COD，NH+4-N，and NO-2-N and enzyme production capacity from sea cucumber culture pond sediment to improve the pond environment and to prepare probiotics.The three strains（N1，DL and R）selected from 11 strains isolated as potential probiotics had efficient degradation of COD at revomal rate of 45.71%in N1，23.98%in DL，and 24.97%in R in 5 days.The revomal rates of NH+4-N were found to be 60.54%in N1，36.15%in DL，and 36.74%in R.The revomal rates of NO-2-N were found to be 52.10%in N1，14.41%in DL，and 28.82%in R.The physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis revealed that the strain N1 was B.baekryungensi，strain DL B.licheniformis and strain R B.amyloliquefaciens.The findings provide foundation with further development of the production or compound preparations with efficient degradation of organic pollutants in sea cucumber culture pond sediment.

Apostichopus japonicus；culture pond sediment；repairing；Bacillus；isolation and screening

S968.9

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.01.004

2095-1388（2016）01-0019-05

2015-05-10

國家 “十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目 （2011BAD13B03）；國家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng) （201405003）；遼寧省海洋與漁業(yè)廳重大項(xiàng)目 （201402）；科技部農(nóng)業(yè)科技轉(zhuǎn)化項(xiàng)目 （2014GB2B000366）

周國慶 （1988—），男，碩士研究生。E-mail：1021169673@qq.com

李華 （1958—），女，博士，教授。E-mail：lihua@dlou.edu.cn