魯夢倩，尼瑪次仁，于天源△，冼思彤，多杰仁青，潘　璠，巴桑德吉，張林峰，陳國勇，吳劍聰北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 0009；西藏藏醫(yī)學(xué)院；西藏自治區(qū)藏醫(yī)藥研究院；北京按摩醫(yī)院

藏藥佐木阿湯對高原紅細胞增多癥模型大鼠心肌細胞線粒體DNA的影響*

魯夢倩1，尼瑪次仁2，于天源1△，冼思彤1，多杰仁青2，潘璠1，巴桑德吉3，張林峰1，陳國勇1，吳劍聰4
1北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2西藏藏醫(yī)學(xué)院；3西藏自治區(qū)藏醫(yī)藥研究院；4北京按摩醫(yī)院

目的：觀察藏藥佐木阿湯對高原紅細胞增多癥（HAPC）模型大鼠心肌細胞線粒體DNA（mtDNA）及DNA聚合酶γ等指標表達的影響，探究佐木阿湯對心肌線粒體的保護作用。方法：選用雄性Wistar大鼠32只，隨機分為平原對照組、高原模型組、陽性藥物組、佐木阿湯組，每組各8只。除平原對照組外，余組均飼養(yǎng)于拉薩以建立HAPC模型，飼養(yǎng)1個月后分別進行生理鹽水、紅景天和佐木阿湯灌胃干預(yù)，干預(yù)3個月后取材，采用Real time PCR、ELISA、Western blot方法分別檢測大鼠心肌mtDNA、8-OHdG、DNA聚合酶γ含量。結(jié)果：mtDNA含量高原對照組與平原對照組相比，顯著降低差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；陽性藥物組和佐木阿湯組與高原對照組相比，明顯升高（P＜0.05）；但與平原對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。8-OHdG高原對照組與平原對照組相比，顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；陽性藥物組和佐木阿湯組與高原對照組相比，顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；陽性藥物組和佐木阿湯組與平原對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。DNA聚合酶γ含量高原對照組與平原對照組相比，顯著降低差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；陽性藥物組和佐木阿湯組與高原對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；陽性藥物組和佐木阿湯組與平原對照組相比，無明顯增加差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：佐木阿湯干預(yù)HAPC模型大鼠后，心肌mtDNA與DNA聚合酶γ均顯著增多，損傷產(chǎn)物8-OHdG顯著降低，佐木阿湯可促進線粒體DNA損傷的修復(fù)，從而使心肌線粒體的結(jié)構(gòu)和功能逐漸恢復(fù)正常，改善HAPC模型大鼠心肌的缺血缺氧狀態(tài)。

高原紅細胞增多癥；動物實驗；大鼠；佐木阿湯；線粒體DNA；心肌

高原紅細胞增多癥（H i g h A l t i t u de p o l ycyt h e m i a，H APC），是長期在高原低壓低氧環(huán)境中生活而引起的一種慢性高原病。其主要癥狀和體征有頭痛、頭暈、乏力、睡眠困難、紫紺、結(jié)膜充血等［1］，并伴有突出的心血管病變，可造成心肌損傷甚至心肌壞死，對機體多個組織器官造成損害，甚至導(dǎo)致患者喪失生活與勞動能力，嚴重影響高原地區(qū)人民的健康［2］。轉(zhuǎn)入低海拔地區(qū)治療可使紅細胞含量迅速下降，是最有效的治療方法，但目前國內(nèi)外仍缺乏有效的就地根治此病的方法［3］。佐木阿湯是藏醫(yī)治療H APC的經(jīng)典方，它能預(yù)防H APC引發(fā)的多種疾病，并有積極的輔助治療作用。課題組前期研究表明佐木阿湯對H APC有明顯的治療作用，可降低H APC模型大鼠紅細胞數(shù)、血液黏稠度，保護心肌的超微結(jié)構(gòu)，促進氧化損傷的恢復(fù)［4-5］。為了探究佐木阿湯對心肌線粒體的保護作用，本次研究主要觀測H APC模型大鼠心肌線粒體D N A（m t D N A）的氧化損傷及D N A聚合酶γ表達的變化，從而進一步探究佐木阿湯防治H APC的作用機理。

1　材料與方法

1.1動物選用清潔級6周齡（180±10g）W i star大鼠，雄性，共32只。購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號：S C X K（京）2014-0001。

1.2藥物佐木阿湯：藏錦雞兒11 g，巴夏嘎14 g，兔耳草11 g，兒茶7 g，矮紫堇7 g（購自西藏甘露藏藥股份有限公司），共50 g佐木阿湯生藥加500mL水，煮30分鐘，縮汁至350 mL，過濾藥渣后使用，此時生藥濃度為0.143 g/mL。陽性對照藥：紅景天10 g（購自拉薩康珠藥店），加100mL水煮沸，收汁至50mL，過濾藥渣后使用，此時生藥濃度為0.2 g/mL。

1.3主要試劑及儀器兔單克隆聚合酶γ抗體（abca m公司，美國），8-O H d G的E L I S A試劑盒（武漢華美生物工程有限公司提供），5804R多功能臺式離心機（E pp e n dor公司，德國），熒光定量PC R儀（7700，A B I P R I S M公司，美國），紫外分光光度計（T U-1901，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司提供）。

1.4方法根據(jù)隨機數(shù)字表法制定分組方案，將動物隨機分為平原對照組、高原模型組、陽性藥物組、佐木阿湯組各8只，共32只。

1.4.1造模高原模型組、陽性藥物組、佐木阿湯組大鼠空運至拉薩“西藏自治區(qū)藏醫(yī)藥與高原生物省部共建實驗室”（海拔3740米）飼養(yǎng)，通過高原低壓低氧環(huán)境進行實地H APC造模。運至高原適應(yīng)性飼養(yǎng)1w，并造模1個月后，開始干預(yù)。平原對照組同期在北京中醫(yī)藥大學(xué)（海拔43米）飼養(yǎng)。

1.4.2干預(yù)平原對照組和高原模型組：每天以生理鹽水5mL灌胃；陽性藥物組：以紅景天水提溶液灌胃，劑量為20 mL/（k g·d）；佐木阿湯組：以7.5 mL/（k g·d）的劑量灌胃。每組均1次/d，6次/周，每周休息1天，共干預(yù)3個月。

1.4.3取材及指標檢測

1.4.3.1心肌m t D N A測定處死后取各組大鼠心肌組織，采用R ea l t i m e PC R方法，對心肌的m t D N A進行擴增，引物序列為上游5′-GG CAACCAAACA G AAC G C TT-3′下游5′-GG A G C TT C T AC GTGGG C TTT-3′（由鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成），擴增片段長度263 b p，內(nèi)參β-act i n（引物由上海生工提供），擴增片段長度256 b p。通過檢測熒光值，比對m t D N A的相對擴增情況，由此檢測各組大鼠心肌組織m t D N A的含量及損傷情況。

1.4.3.2心肌8-O H d G的測定處死后取各組大鼠心肌組織，提取m t D N A后，采用E L I S A法檢測m t D N A內(nèi)8-O H d G的含量，檢測步驟按試劑盒的說明書進行，取兩次結(jié)果的平均值。

1.4.3.3心肌D N A聚合酶蛋白表達測定處死后取各組大鼠心肌組織，采用W ester n b l ot法進行檢測并照相，用G e l-P ro軟件分析信號A值，計算各組大鼠的目的蛋白相對于內(nèi)參t u b u l i n的相對A值（即相對含量），以此對比各組大鼠的D N A修復(fù)能力。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)采用S P SS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以（±s）表示，組間比較采用方差分析，不滿足方差分析條件時采用秩和檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1心肌mtDNA擴增結(jié)果采用R ea l t i m e PC R方法檢測各組大鼠心肌組織m t D N A的相對拷貝數(shù)，觀測m t D N A的損傷情況。結(jié)果顯示，m t D N A含量高原對照組與平原對照組相比，明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；陽性藥物組和佐木阿湯組與高原對照組相比，明顯升高差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；陽性藥物組和佐木阿湯組與平原對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2心肌8-OHdG含量結(jié)果采用E L I S A方法檢測心肌組織8-O H d G的含量，判斷心肌m t D N A的損傷程度。結(jié)果顯示，8-O H d G含量高原對照組與平原對照組相比，顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；陽性藥物組和佐木阿湯組與高原對照組相比，顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；陽性藥物組和佐木阿湯組與平原對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.3心肌DNA聚合酶γ表達結(jié)果采用W ester n b l ot方法檢測心肌組織D N A聚合酶γ含量，觀察m t D N A的損傷修復(fù)情況。結(jié)果顯示，D N A聚合酶γ的含量高原對照組與平原對照組相比，顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；陽性藥物組和佐木阿湯組與高原對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；D N A聚合酶γ的含量與平原對照組相比，有一定程度增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、圖1。

表1　心肌線粒體各指標表達結(jié)果（±s）

表1　心肌線粒體各指標表達結(jié)果（±s）

注：與平原對照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與高原對照組比較，△表示P＜0.05。

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圖1　DNA聚合酶γ蛋白表達結(jié)果

3　討論

藏醫(yī)學(xué)認為當人體的血液容量超過正常范圍時會發(fā)生“多血癥”“壞血病”，病位主要在肝，兼“木布”病證，相當于西醫(yī)學(xué)之高原紅細胞增多癥［6］。2004年的國際高原病會議上通過了H APC的國際診斷指南，其診斷標準包括：紅細胞≥6.5× 1012/L，血紅蛋白≥200 g/L，紅細胞壓積≥65%，并且長期生活在海拔2 500m以上［7］。在高原地區(qū)（海拔3 000～4 700m），H APC的發(fā)病率為2.43%～37.5%，并且隨著海拔的升高逐漸增多［8］，從平原移居至高原的人群的發(fā)病率高于常住居民，男性發(fā)病率高于女性［9-11］。

高原紅細胞增多癥臨床上以血液學(xué)變化為特征，紅細胞的過量增多會引起血液黏稠度增加，血流速度降低，進而加重血液缺氧情況［12］。同時心血管方面的改變也很突出，心肌損傷是其主要病理表現(xiàn)。心臟是機體代謝最旺盛的器官之一，對缺血缺氧十分敏感，較長時間嚴重缺血缺氧將導(dǎo)致心肌的損傷甚至壞死。安靜時心肌攝氧率最高，應(yīng)激時只有增加心肌血流量以滿足心肌供氧量，急進高原時冠狀血管血流量明顯增加［13］，加之心肌泵血功能下降，心臟收縮間期延長，且患者的血液具有濃、黏、聚的特點［14］，導(dǎo)致患者機體微循環(huán)阻力增大，全身各器官血氧供給下降，加重低氧血癥，形成惡性循環(huán)，加重心肌損傷。

線粒體是心肌缺血缺氧最敏感的細胞器，是細胞缺血缺氧損害的核心部位，其結(jié)構(gòu)和功能的異常是心肌能量代謝障礙的主要表現(xiàn)［15-16］。線粒體的功能實現(xiàn)與m t D N A的結(jié)構(gòu)和拷貝數(shù)有關(guān)。H APC患者m t D N A的數(shù)量較低，導(dǎo)致線粒體功能障礙，能量代謝發(fā)生異常，A T P生成不足，能量利用障礙，加重缺氧，進一步刺激R B C生成，形成惡性循環(huán)［17］。8-O H d G是D N A氧化損傷的標志性產(chǎn)物，檢測心肌組織8-O H d G的含量，可判斷心肌m t D N A的損傷程度，評價佐木阿湯保護心肌功能的作用［18］。本實驗證實，H APC模型大鼠的m t D N A與平原對照組相比顯著降低，8-O H d G含量顯著升高，說明高原低壓低氧環(huán)境對m t D N A造成了一定的損傷，而m t D N A的結(jié)構(gòu)變異和拷貝數(shù)下降可能在H APC患者心功能損傷的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。

m t D N A氧化損傷的修復(fù)主要靠線粒體堿基切除（m t B E R）途徑，D N A聚合酶γ是m t B E R途徑的關(guān)鍵，并且是迄今為止惟一被證實存在于脊椎動物線粒體的D N A聚合酶，對m t D N A的復(fù)制、合成與修復(fù)起著關(guān)鍵的作用［19］。線粒體D N A的復(fù)制過程由D N A聚合酶γ催化，一旦D N A聚合酶γ的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，線粒體D N A的復(fù)制將受到影響。在其修復(fù)B E R途徑中，被氧化或損傷的堿基由特定的脫嘌呤嘧啶核酸內(nèi)切酶切割此位點5′的磷酸二酯主鏈，形成一段懸浮的脫氧核糖核酸片段，由D N A聚合酶γ來填充這一個堿基空隙，并由D N A連接酶封閉缺口，完成修復(fù)［20］。缺氧可降低D N A聚合酶γ的活性，使m t D N A修復(fù)途徑受阻，拷貝數(shù)減少，線粒體功能障礙，進而加重缺氧［21］。本實驗證實，H APC模型大鼠的m t D N A受到了損傷，而其D N A聚合酶γ與平原組相比卻顯著降低，因此不能及時對m t D N A進行修復(fù)，更加重了心肌線粒體的損傷。

佐木阿湯是藏醫(yī)治療多血癥的經(jīng)典方，最早記載于14世紀的藏醫(yī)典籍《藏醫(yī)千萬舍利》中［22］，由5味藏藥組成，它通過清血火、調(diào)理血液黏稠度，消除肝火盛的作用達到治療多血癥的目的。其中，藏錦雞兒有消血栓、清血火、改善血液循環(huán)的作用，可緩解多血癥的血液黏稠和肝火亢盛引起的頭痛、頭暈、口干、靜脈曲張問題；巴夏嘎具有清血火的作用，是針對本病病理性質(zhì)和部位的；兔耳草、兒茶和矮紫堇共同具有消除血量增多，治火亢的作用，可消除口唇發(fā)紫、眼部充血等癥；矮紫堇可治木布病證，消除血熱證癥狀，防止多血癥引發(fā)的重癥疾病的發(fā)生和發(fā)展。

本實驗結(jié)果表明，佐木阿湯干預(yù)H APC模型大鼠后，心肌m t D N A與D N A聚合酶γ都有顯著性增多，損傷產(chǎn)物8-O H d G顯著性降低，證明佐木阿湯可以促進線粒體D N A損傷的修復(fù)，從而使心肌線粒體的結(jié)構(gòu)和功能逐漸恢復(fù)正常，改善H APC模型大鼠心肌的缺血缺氧狀態(tài)。

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Influenceof Tibetan M edicine ZuoMuA Tang on M yocardialm tDNA ofHAPC RatModel

LU Mengqian1，NIMA Ciren2，YU Tianyuan1△，XIAN Sitong1，DUOJIE Renqing2，PAN Fan1，BASANG Deji3，ZHANG Linfeng1，CHEN Guoyong1，WU Jiancong4
1 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；2 Tibetan TraditionalMedical College；3 Tibet Autonomous Region Academy of Tibetan Medicine；4 Beijing Massage Hospital

Objective：To explore themechanism of ZuoMuA Tang protecting myocardialmitochondria by observing its influence on the expressions ofmitochondria DNA（m tDNA）and DNA polymeraseγinmyocardial cells of ratmodelw ith high altitude polycythemia（HAPC）.Methods：Thirty-two ratswere random ized into plain control group，plateau control group，positivemedicine group and ZuoMuA Tang group.Except the rats in plain controlgroup，other ratswere kept in Lhasa to prepare HAPCmodels，and intervened by intragastric adm inistration of physiologicalsaline，HongJingTian（Rhodiola rosea L.）and ZuoMuA Tang after feeding in onemonths，the tissues were taken after intervened in threemonths，the contentsofmyocardialm tDNA，8-OHdG and DNA polymeraseγof the rats were detected respectively by adopting Realtime PCR，ELISA and Western blotmethod.Results：The contentsofm tDNA decreased notablywhen plateau controlgroup was compared w ith plain controlgroup（P＜0.05）；they raised obviously when positivemedicine group was compared w ith ZuoMuA Tang group and plateau control group（P＜0.05）；but therewas the differencewhen positivemedicine group was compared w ith plain controlgroup （P＜0.05）.The levelsof8-OHdG rose significantlywhen plateau controlgroupwascompared w ith plain controlgroup （P＜0.05）；they lowered when positivemedicine group was compared w ith ZuoMuA Tang group and plateau control group（P＜0.05）；therewas no obvious differencewhen positivemedicine group was compared w ith ZuoMuA Tang group and plain control group（P＜0.05）.The contents of DNA polymeraseγdecreased evidently when plateau control group was compared w ith plain control group（P＜0.05）；there was no obvious difference when positive medicine group and ZuoMuA Tang group were compared w ith plateau control group（P＞0.05）；it rose indistinctly when positive medicine group and ZuoMuA Tang group were compared w ith plain control group（P＞0.05）. Conclusion：The levels of myocardialm tDNA and DNA polymeraseγimproved significantly，and the levels of damage product 8-OHdG decreased obviously after intervened HAPC ratmodel by ZuoMuA Tang.ZuoMuA Tang could promote the recovery of m tDNA damage，therefore to make the structure and the functions ofmyocardial m itochondria restore to normal，and improve ischem ic and hypoxia state of HAPC ratmodel.

high altitude polycythemia；animalexperiments；rats；ZuoMuA Tang；m itochondria DNA；myocardium

R285.5

A

1004-6852（2016）04-0010-04

2015-11-09

國家自然科學(xué)基金項目（編號81260567）。

魯夢倩（1987—），女，博士研究生。研究方向：針灸推拿治療周圍神經(jīng)損傷的機理研究。

于天源（1965—），男，博士學(xué)位，教授。研究方向：針灸推拿治療周圍神經(jīng)損傷的機理研究。