李生茂， 劉 琳， 彭 璐， 陳 珍， 顧 健， 譚 睿*（.川北醫(yī)學(xué)院，四川南充67000；.西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川成都600；.西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研究院，四川成都6004）

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益智仁HPLC指紋圖譜與其抗氧化活性

李生茂1， 劉 琳1， 彭 璐2， 陳 珍1， 顧 健3， 譚 睿2*
（1.川北醫(yī)學(xué)院，四川南充637000；2.西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川成都610031；3.西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研究院，四川成都610041）

目的 建立益智仁Alpinae Oxyphyllae Fructus HPLC指紋圖譜，并研究其抗氧化活性。方法 HPLC法建立指紋圖譜，通過(guò)相似度分析、聚類(lèi)分析、主成分分析進(jìn)行評(píng)價(jià)，DPPH法測(cè)定其抗氧化活性。結(jié)果 HPLC指紋圖譜中有24個(gè)共有峰，相似度在0.974以上，其中12、19和21號(hào)色譜峰確定為白楊素、楊芽黃素和圓柚酮。10批樣品均具有抗氧化活性，但都弱于維生素C。結(jié)論 該方法指紋色譜峰更多，分離度更高，而且分離時(shí)間更合適。

益智仁；HPLC指紋圖譜；抗氧化活性；相似度分析；聚類(lèi)分析；主成分分析；DPPH法

益智仁為姜科植物益智Alpinia oxyphylla Miq的干燥成熟果實(shí)［1］，主產(chǎn)于海南、廣東、廣西等地，為 “四大南藥”之一，也是2002年衛(wèi)生部公布的藥食同源植物之一［2］，具有暖腎固精縮尿，溫脾止瀉攝唾的功效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，益智仁中含有黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、二苯庚烷類(lèi)等化學(xué)成分，具有神經(jīng)保護(hù)、提高學(xué)習(xí)記憶、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗炎、強(qiáng)心和鎮(zhèn)靜催眠等作用［3-6］，其中抗氧化為其重要的活性之一，與神經(jīng)保護(hù)、提高學(xué)習(xí)記憶和抗衰老等作用關(guān)系密切［3］，但目前關(guān)于其抗氧化活性成分研究的報(bào)道較少，相關(guān)成分不太明確［4、7］。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)益智的質(zhì)量控制研究大多采用UV、HPLC等技術(shù)以總黃酮［8］、總多糖［9］或部分有效成分為指標(biāo)的定量測(cè)定［10-14］，或以TLC［15］、IR［16］、GC-MS［17］、HPLC［18］和UPLC［19］指紋圖譜定性檢測(cè)為主，但這些研究以單純的化學(xué)分析居多，而與藥效結(jié)合的整體性、聯(lián)系性探索較少，也未見(jiàn)有對(duì)益智仁HPLC指紋圖譜與其活性相關(guān)性的報(bào)道。基于此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同來(lái)源的益智仁進(jìn)行了HPLC指紋圖譜研究，并以其抗氧化活性為切入點(diǎn)，采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法研究指紋圖譜色譜峰與清除DPPH自由基作用的關(guān)系，以期初步探尋其抗氧化物質(zhì)基礎(chǔ)，并為更好地控制益智仁質(zhì)量提供一定依據(jù)。

1　儀器與材料

1.1儀器 Agi1ent 1220高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；Sartorius BP211D AG電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；KQ3200超聲清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司），Epoch微孔板分光光度計(jì) （美國(guó)BioTek公司）。

1.2試藥 圓柚酮、1，1-二苯基苦基苯肼 （美國(guó)Sigma公司，批號(hào)分別為101340870、034K1071，含有量＞99%）；白楊素 （中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111701-200501）；楊芽黃素（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)Y-193-150703，含有量＞98%）；維生素C（成都科龍化學(xué)試劑廠，批號(hào)20130516，含有量≥99.7%）。磷酸、甲醇為分析純；乙腈為色譜純；水為超純水 （自制）。

1.3藥材 益智仁分別購(gòu)自海南益智種植基地（編號(hào)s1～s3，s5）以及四川或廣東的藥廠 （s4，s6～s10），經(jīng)西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院宋良科副教授鑒定為姜科植物益智Alpinia oxyphylla Miq的干燥成熟果實(shí)，具體見(jiàn)表1。

表1　樣品信息Tab.1 Information of sam p les

2　方法與結(jié)果

2.1溶液制備

2.1.1供試品溶液 精密稱取益智藥材粗粉1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入20 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2對(duì)照品溶液 精密稱取白楊素、楊芽黃素和圓柚酮對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.462、2.189和16.128μg/mL的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.2指紋圖譜建立

2.2.1HPLC色譜條件 Agi1ent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相乙腈 （A）-0.4%磷酸水 （B），梯度洗脫 （0～15 min，35% A；15～32 min，35%～70%A；32～48 min，70%～77%A）；體積流量0.6 mL/min；柱溫35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；進(jìn)樣量20μL。

2.2.2方法學(xué)考察

2.2.2.1精密度試驗(yàn) 取s1樣品，按 “2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，以圓柚酮色譜峰 （S）為參照峰，測(cè)得各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積RSD值均小于5%，表明儀器精密度良好。

2.2.2.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 取s1樣品，按 “2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在 “2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，以圓柚酮色譜峰 （S）為參照峰，測(cè)得各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積RSD值均小于5%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.2.3重復(fù)性試驗(yàn) 取s1樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備5份供試品溶液，以圓柚酮色譜峰 （S）為參照峰，測(cè)得各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積RSD值均小于5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.3指紋圖譜測(cè)定 按 “2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別吸取各供試品和對(duì)照品混合溶液，在 “2.2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，記錄48 min內(nèi)色譜圖，采用國(guó)家藥典委員會(huì) 《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng) （2004A）》軟件，選取中位數(shù)法手動(dòng)匹配，得到10批益智仁HPLC指紋圖譜間的相似度及對(duì)照指紋圖譜，結(jié)果見(jiàn)表2～3、圖1～2。

表2　HPLC指紋圖譜共有峰峰面積Tab.2 Peak areas of common peaks of HPLC fingerp rints

表3　HPLC指紋圖譜相似度Tab.3 Sim ilarities of HPLC fingerprints

2.2.4聚類(lèi)分析 將10批HPLC指紋圖譜中各峰的峰面積導(dǎo)入SPSS13.0軟件，采用Ward法，Squared Euc1idean distance聚類(lèi)。結(jié)果，10批樣品聚為兩類(lèi)，第一類(lèi)包括s1～s5，第二類(lèi)包括s6～s10，見(jiàn)圖3。

圖1　10批樣品指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerp rints of ten batches of sam p les

圖2　對(duì)照品HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of reference substances

圖3　聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖Fig.3 Dendrogram of cluster analysis

2.2.5主成分分析 以10批HPLC指紋圖譜中的24個(gè)共有峰的峰面積為變量［20］，采用SPSS13.0軟件對(duì)其進(jìn)行原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理及主成分分析。結(jié)果顯示，第一主成分的特征值λ1為11.914，方差貢獻(xiàn)率為49.641%；第二主成分的特征值λ2為7.586，方差貢獻(xiàn)率為31.308%；第三主成分的特征值λ3為2.157，方差貢獻(xiàn)率為8.986%；第四主成分的特征值λ4為1.409，方差貢獻(xiàn)率為5.876%。前3個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率已達(dá)到90.235%（大于85%），故可用這3個(gè)新變量替代原有的24個(gè)變量。

將主成分載荷矩陣中的數(shù)據(jù)除以主成分相對(duì)應(yīng)的特征值，并開(kāi)平方根，得到兩個(gè)主成分中每個(gè)指標(biāo)所對(duì)應(yīng)的系數(shù)。經(jīng)計(jì)算，得主成分的模型為

F1=0.184 5X1+0.256 4X2+0.228 3X3+ 0.246 0X4+0.250 6X5+0.164 0X6+0.234 7X7+ 0.231 8X8+0.142 8X9+0.270 4X10+0.017 3X11+ 0.125 7X12+0.091 6X13+0.156 7X14+0.136 5X15+ 0.280 8X16+0.202 8X17+0.114 7X18+0.232 1X19+ 0.256 4X20+0.283 3X21+0.134 7X22+0.203 7X23+ 0.246 8X24。

F2=0.266 5X1-0.059 2X2-0.137 2X3-0.080 6X4+0.177 5X5+0.282 1X6+0.142 3X7+ 0.202 6X8+0.255 2X9+0.249 1X10-0.026 5X11-0.291 9X12+0.341 3X13+0.295 5X14-0.233 8X15-0.038 5X16-0.244 7X17-0.191 7X18-0.165 9X19-0.156 1X20+0.042 1X21-0.217 8X22-0.207 3X23-0.115 8X24。

F3=-0.030 0X1-0.140 9X2-0.033 4X3+ 0.273 7X4+0.008 9X5-0.027 9X6+0.202 9X7-0.117 8X8-0.234 2X9-0.066 1X10+0.641 4X11-0.191 3X12+0.014 3X13-0.070 1X14+0.278 5X15+ 0.055 8X16-0.012 9X17-0.334 3X18-0.167 5X19-0.004 8X20+0.062 6X21-0.230 8X22-0.076 9X23+ 0.225 4X24。

其中，X1、X2、…、X24為指紋圖譜對(duì)應(yīng)共有色譜峰x1、x2、…、x24峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化值。

在3個(gè)主成分中，第一主成分特征值最大，貢獻(xiàn)率最高，信息量最全面。其中，21號(hào)色譜峰（圓柚酮）的系數(shù)最大，表明其在益智仁質(zhì)量控制中有相對(duì)重要的作用，結(jié)合文獻(xiàn) ［4］，可以將其作為益智仁質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。

根據(jù)3個(gè)主成分模型，分別計(jì)算10批益智仁主成分得分，得到3維圖，見(jiàn)圖4。

圖4　PCA得分圖Fig.4 PCA score plot

2.3DPPH法測(cè)定抗氧化活性

2.3.1溶液配制 稱取DPPH適量，加甲醇配成110μmo1/L溶液，避光保存。再精密稱取維生素C適量，加甲醇制成50μg/m L溶液，避光保存。

2.3.2DPPH自由基清除作用 參考文獻(xiàn)［21］，按 “2.1.1”項(xiàng)下方法提取樣品，甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度 （相當(dāng)于生藥量）的供試品溶液。取0.15 mL，與0.15 mL DPPH溶液置于96孔板上，混勻后室溫避光放置60 min，517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度Ai，同時(shí)測(cè)定0.15 mL甲醇與0.15 mL DPPH溶液A0，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，計(jì)算清除率，公式為清除率=（1-Ai/A0）×100%。以清除率 （Y）對(duì)藥物質(zhì)量濃度 （X）進(jìn)行回歸，求出清除率為50%時(shí)藥物的質(zhì)量濃度 （IC50），結(jié)果見(jiàn)表5。

另取陽(yáng)性對(duì)照維生素C母液，分別稀釋成1、2、3、4和5μg/mL溶液，同法測(cè)得清除率分別為8.97%、30.04%、50.07%、69.51%和88.94%。并以清除率 （Y）對(duì)藥物質(zhì)量濃度 （X）進(jìn)行方程回歸，求得陽(yáng)性對(duì)照維生素 C的 IC50值為3.025μg/m L。

從結(jié)果來(lái)看，10批益智樣品均具有清除DPPH自由基的活性，但均低于維生素C。

表5　10批樣品抗氧化活性Tab.5 Antioxidant activities of ten batches of samples

2.4灰色關(guān)聯(lián)度分析 參考文獻(xiàn) ［22］，以益智仁清除DPPH自由基活性IC50為母序列，HPLC指紋圖譜各共有峰峰面積為子序列，分辨系數(shù)ρ取0.5，進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析。結(jié)果，各色譜峰對(duì)清除DPPH自由基的貢獻(xiàn)大小依次為x13＞x1＞x9＞x7＞x14＞x21＞x5＞x10＞x2＞x6＞x8＞x16＞x3＞x4＞x11＞x20＞x22＞x19＞x15＞x24＞x23＞x18＞x12＞x17，見(jiàn)表6。

表6　灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果Tab.6 Results of grey relational grade analysis

3　討論

益智化學(xué)成分復(fù)雜，富含萜類(lèi)、二苯庚烷類(lèi)等小極性成分，分析難度較大［3-4］。因此，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考察了影響HPLC分離效果的幾個(gè)主要因素，如流動(dòng)相 （甲醇-水、甲醇-0.4%磷酸水、乙腈-水和乙腈-0.4%磷酸水）、體積流量 （0.6、0.8和1 m L/min）、柱溫 （25、30、35和40℃）。最后確定，以柱溫35℃，流動(dòng)相乙腈-0.4%磷酸水，體積流量0.6 mL/min梯度洗脫，此時(shí)指紋圖譜中色譜峰數(shù)量多，主要色譜峰分離度好，而且分析時(shí)間合適。

建立了10批益智仁指紋圖譜，并確定了24個(gè)共有峰。相似度分析顯示，10批指紋圖譜整體面貌相似 （相似度在0.970以上），內(nèi)在質(zhì)量相對(duì)一致，僅成分含有量有差異。聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，10批益智仁大致分為2類(lèi)，其中采集于海南萬(wàn)寧（s1、s2）、海南瓊中 （s4）、海南昌屯 （s5）與購(gòu)于A藥廠 （s4）的樣品聚為一類(lèi)，而購(gòu)自B藥廠（s6、s7和s9）、C藥廠 （s8）以及D藥廠 （s10）聚為另外一類(lèi)。聚類(lèi)結(jié)果與產(chǎn)地?zé)o明顯相關(guān)性，推測(cè)可能與加工、儲(chǔ)藏等因素有關(guān)，但由于樣品數(shù)量較少、信息量有限，具體原因值得進(jìn)一步研究。PCA分析結(jié)果顯示，10批HPLC指紋圖譜24個(gè)共有峰中提取了3個(gè)主成分，其投影除s8外，與聚類(lèi)分析結(jié)果較為一致，兩種分析方法相互印證。

目前，中藥譜效關(guān)系的分析方法很多［23-24］，尚不統(tǒng)一，如主成分分析、相關(guān)分析、典型相關(guān)分析、多元線性回歸分析、逐步回歸分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、聚類(lèi)分析等等。其中，灰色關(guān)聯(lián)度分析為最常用的方法之一，是根據(jù)因素之間發(fā)展趨勢(shì)的相似或相異程度，亦即 “灰色關(guān)聯(lián)度”，作為衡量因素間關(guān)聯(lián)程度的一種方法，可描述系統(tǒng)發(fā)展過(guò)程中因素間相對(duì)變化的情況，如果兩者在發(fā)展過(guò)程中的相對(duì)變化基本一致，則認(rèn)為關(guān)聯(lián)度大，反之則關(guān)聯(lián)度?。?3-24］。

采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法，研究了益智仁HPLC指紋圖譜共有色譜峰與抗氧化活性之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)均有不同程度的關(guān)聯(lián)度，在0.636～0.499之間，表明益智仁抗氧化作用是多成分共同起效的結(jié)果。其中，12、19和21號(hào)色譜峰分別是白楊素、楊芽黃素和圓柚酮，但其他成分，特別是對(duì)益智仁抗氧化活性貢獻(xiàn)較大的13、1、9、7和14號(hào)色譜峰各代表什么成分，究竟起到了怎樣的作用，還有待于進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)在建立益智仁HPLC指紋圖譜的基礎(chǔ)上，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并進(jìn)一步采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法研究了其化學(xué)信息 “譜”和抗氧化活性信息 “效”之間的關(guān)系，為尋找益智仁抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)以及其質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

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［24］張 慧，海廣范，栗志勇，等.白芷中抗內(nèi)毒素血癥有效組分的譜效關(guān)系［J］.中成藥，2014，36（12）：2491-2497.

HPLC fingerprints and antioxidant activity of Alpinia Oxyphylllae Fructus

LISheng-mao1， LIU Lin1， PENG Lu2， CHEN Zhen1， GU Jian3， TAN Rui2*

（1.North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，China；2.CollegeofMedicine，Southwest Jiaotong University，Chengdu610031，China；3.Institute of National Medicine，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China）

AIM To estab1ish the HPLC fingerprints of Alpinia Oxyphylllae Fructus and to study the antioxidant activity.METHODS The fingerprintswere estab1ished by HPLC and eva1uated by simi1arity ana1ysis，c1us-ter ana1ysis and principa1 component ana1ysis.The antioxidant activity was determined by DPPH method.RESULTS There were twenty-four common peaks in the HPLC fingerprints，whose simi1arties were more than 0.974.Among them，peaks 12，19 and 21 were identified as chrysin，tectochrysin and nootkatone，respective1y. Ten batches of samp1es a11 showed antioxidant activities，which were weaker than that of vitamin C.CONCLUSION Thismethod has the advantages ofmore chromatographic peaks，higher reso1ution andmore proper separation time.

Alpinia oxyphylllae Fructus；HPLC fingerprints；antioxidant activity；simi1arity ana1ysis；c1uster ana1ysis；principa1 component ana1ysis；DPPH method

R284.1

A

1001-1528（2016）06-1319-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.024

2015-10-27

國(guó)家 “重大新藥創(chuàng)制”項(xiàng)目 （2013ZX09103002014，2012ZX09304005003）；2014年四川省科技創(chuàng)新苗子工程項(xiàng)目 （2014-105）；川北醫(yī)學(xué)院2015年大學(xué)生開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目 （2015）

李生茂 （1981—），男，博士，講師，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究。Te1：（0817）3300337，E-mai1：1sm9110 @163.com

譚 睿 （1969—），女，博士，教授，從事中藥、民族藥及復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究。Te1：（028）87601764，E-mai1：tanrui@swjut.edu.cn