曾凡勇，吳衛(wèi)紅，劉建軍，張雁，李南玲，席冰玉

·臨床研究·

遺傳性代謝病高危患兒尿有機酸的篩查①

曾凡勇，吳衛(wèi)紅，劉建軍，張雁，李南玲，席冰玉

目的探討氣相色譜質(zhì)譜技術（GC/MS）在遺傳性代謝病高?；純汉Y查中的應用。方法2010年3月～2015年11月，疑有遺傳性代謝病患兒119例，采用GC/MS檢測尿液中有機酸的含量，對相關疾病進行篩查。結果陽性17例（14.29%），可疑陽性20例（16.81%）。陽性患兒主要表現(xiàn)為發(fā)育落后16例（94.12%）。結論GC/MS是篩查遺傳性代謝病高?；純翰∫虻囊环N有效措施，可為進一步明確診斷提供篩查依據(jù)。

遺傳性代謝??；氣相色譜質(zhì)譜；有機酸；篩查

［本文著錄格式］曾凡勇，吳衛(wèi)紅，劉建軍，等.遺傳性代謝病高?；純耗蛴袡C酸的篩查［J］.中國康復理論與實踐，2016，22（8）：947-951.

CITED AS：Zeng FY，Wu WH，Liu JJ，et al.Screening of urinary organic acid in children with high risk of inherited metabolic diseases［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（8）：947-951.

遺傳性代謝?。╥nherited metabolic disease，IMD）又稱先天性代謝缺陷（inborn errors of metabolism，IEM），由英國醫(yī)生Garrod在1902年首先提出。它是單基因突變導致維持機體正常代謝所必需的某種酶、運載蛋白、膜或受體等的編碼基因發(fā)生突變，從而導致機體生化代謝紊亂，造成中間、旁路代謝產(chǎn)物蓄積，或終末代謝產(chǎn)物缺乏，引起一系列臨床癥狀的一組疾病［1］。

先天性遺傳代謝病病因及臨床表現(xiàn)復雜，常常導致嚴重神經(jīng)系統(tǒng)損害，臨床表現(xiàn)具有非特異性，診斷完全依賴特殊實驗室檢查，包括代謝產(chǎn)物分析、酶學或蛋白組學分析和基因分析。對代謝產(chǎn)物進行檢測分析是篩查、診斷和鑒別診斷代謝缺陷病的主要方法，也是酶學或基因分析的前提和基礎。氣相色譜質(zhì)譜技術（gas chromatography mass spectrometry，GC/MS）是目前常用的檢測代謝產(chǎn)物的方法之一。GC/MS是由色譜分析技術和質(zhì)譜分析技術組成，利用氣相色譜儀的分離能力讓混合物中的組分分離，并用質(zhì)譜儀鑒定分離出來的組分（定性分析），計算出精確的量（定量分析）。

1　對象和方法

1.1對象

2010年3月～2015年11月，到本科門診就診或住院康復，疑有遺傳性代謝病患兒119例，其中男性70例，女性49例；來診時年齡最小58 d，最大9歲9個月，平均（1.97±1.68）歲。

2　篩查結果

2.1陽性

篩查陽性的患兒可以是其中一項指標異常，也可以是2項或多項指標異常，如某一患兒多項指標異常，統(tǒng)計時按1例患兒計算。共17例患兒篩查結果為陽性，陽性率為14.29%。

甲基丙二酸尿癥7例，其中4例檢出的甲基丙二酸數(shù)值分別為6.53 μmol/L、0.95 μmol/L、6.67 μmol/ L、1.07 μmol/L，另3例少量甲基丙二酸檢出。戊二酸尿癥2例，檢出3-羥基丙酸。生物素缺乏或多種羧化酶缺乏癥5例，檢出巴豆酰甘氨酸、3-甲基巴豆酰甘氨酸。線粒體脂肪酸代謝障礙5例，其中3例并發(fā)其他代謝障礙。非酮癥性二羥基尿癥3例，其中2例并發(fā)他代謝障礙。

這17例患兒中，1例為甲基丙二酸尿癥并發(fā)線粒體脂肪酸代謝障礙；1例為甲基丙二酸尿癥、非酮癥性二羧基酸尿癥并發(fā)線粒體脂肪酸代謝障礙；1例為生物素缺乏或多羧化酶缺乏癥、非酮癥性二羧基酸尿癥并發(fā)線粒體脂肪酸代謝障礙。

2.2可疑陽性

可疑陽性主要指某些指標超出正常值范圍，但僅憑這些指標無法明確診斷，需要依據(jù)其他檢測方法進一步確定。共20例，可疑陽性率16.81%，其中包括酮癥、營養(yǎng)障礙17例，維生素B族缺乏3例。

2.3陽性患兒主要臨床表現(xiàn)

其中發(fā)育落后占16例（94.12%），孕期保胎、感染史占4例（23.53%），生時窒息3例（17.65%），雙胎、早產(chǎn)、低體質(zhì)量占4例（23.53%），有異常家族史占3例（17.65%），肌張力高、病理征陽性4例（23.52%）；腦電圖或頭部MRI異常者5例（29.41%）。見表2。

表1　篩查陽性患兒主要異常指標（μmol/L）

表2　篩查陽性患兒臨床表現(xiàn)（n）

3　討論

遺傳性代謝病單一病種發(fā)病率低，屬少見病，但病種多樣，迄今已發(fā)現(xiàn)的遺傳性代謝病超過1000種。近年來隨著生物化學、分子遺傳學和計算機科學的迅速發(fā)展，遺傳性代謝病的診斷和治療在我國逐步引起重視［2-3］。我國臺灣地區(qū)2000年～2009年篩查新生兒1，495，132例，確診遺傳性代謝病170例，總體發(fā)病率為1∶6219；其中氨基酸代謝異常107例，有機酸代謝異常51例及脂肪酸代謝異常12例［4］。遺傳性代謝病常引起多器官功能損害，最常累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可導致智力及運動功能障礙，甚至殘疾，部分疾病治療費用昂貴，給家庭和社會帶來沉重的精神及經(jīng)濟負擔。目前，北美、歐洲、日本和新加坡等國家已普遍將GC/MS技術應用于小兒遺傳性代謝病篩查方案中［5］。

在臨床工作中，碰到原因不明的智力低下/發(fā)育落后、頑固性驚厥、肌張力異常、持續(xù)或反復黃疸/肝功能損害、肝脾腫大、反復嘔吐/腹瀉/喂養(yǎng)困難的患兒，尤其并發(fā)以下情況時，應及時進行遺傳性代謝病高危篩查，防止誤診誤治。①陽性家族史；②實驗室檢查異常如反復或持續(xù)低血糖、嚴重代謝性酸中毒、高血氨、頭部影像學改變等；③經(jīng)常規(guī)抗癲癇、護肝等治療后病情無好轉。早期診斷對于一些可給予特殊飲食及藥物干預的疾病（如苯丙酮尿癥、甲基丙二酸血癥并發(fā)同型半胱氨酸血癥等）的預后有重要意義［6-7］。

因臨床癥狀體征缺乏特異性，遺傳性代謝病的診斷主要依賴實驗室檢查。由于尿液中含有氨基酸、糖類、有機酸、醇類等代謝終產(chǎn)物，其濃度高于血清，易于收集，而且大部分代謝產(chǎn)物易揮發(fā)，故可以通過GC/MS檢測尿液的特征性代謝產(chǎn)物，為診斷遺傳性代謝病提供依據(jù)［8］。常見的特征性代謝產(chǎn)物［8-10］見表3。

由于采樣時期、患者個體的差異，相同疾病患者尿液GC/MS代謝產(chǎn)物譜圖會不同，特別在疾病發(fā)作的間歇期，尿液代謝產(chǎn)物譜圖常未見異常，故采用患者急性期樣本或進行多次檢測，可提高疾病的檢出率。臨床上最常用的篩查、確診遺傳性代謝病的手段主要是GC/MS法和串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass spectrometry，MS/MS）法［11-12］。其中GC/MS對于有機酸尿癥的診斷最敏感［13］。隨著尿素酶前處理技術的成熟和普及，由于尿中各種代謝產(chǎn)物沒有被提取，GC/MS檢測不僅局限于有機酸尿癥，還能診斷氨基酸代謝異常等［14］。故尿液GC/MS技術是篩查和診斷有機酸尿癥及氨基酸代謝異常的重要方法。

GC/MS、MS/MS、酶活性測定、基因檢測等方法互為補充。如對于高苯丙氨酸血癥患者，除了GC/ MS、MS/MS檢測外，應進行尿液喋呤譜分析、四氫生物喋呤負荷試驗，鑒別是否為四氫生物喋呤反應性高苯丙氨酸血癥，根據(jù)疾病類型進行相應的基因診斷；尿液中甲基丙二酸顯著增高可以診斷為甲基丙二酸尿癥（methylmalonic aciduria，MMA），通過血清或尿液總同型半胱氨酸測定鑒別單獨型MMA或MMA并發(fā)同型半胱氨酸血癥。同時，一些指標異常也可能與多種疾病有關，需要進一步鑒別診斷。如血液中丙酰肉堿增高可以發(fā)生在MMA、生物素酶缺乏患者，也可能發(fā)生在腦葉酸缺乏癥及維生素B12、葉酸、生物素缺乏的患者。戊二酸尿癥Ⅱ型、極長鏈酯酰輔酶A脫氫酶缺乏癥、高氨血癥Ⅱ型等患者可呈間歇性異常，在發(fā)熱、饑餓、疲勞、飲食不當、某些藥物刺激下出現(xiàn)代謝紊亂。因此，應重視間歇性異常、急性代謝紊亂、急性腦病、肝病、猝死樣發(fā)作患者的代謝病篩查。GC/MS只能確診有限的遺傳代謝性疾病，需要結合幾種方法來綜合判斷，為患者提供更準確的診斷并指導治療。遺傳性代謝病診斷流程見圖1［15］。

表3　遺傳代謝性疾病的常見特征性代謝產(chǎn)物

圖1　遺傳性代謝病診斷流程

此次篩查分析的陽性率為14.29%，可疑陽性率為16.81%?？梢申栃月瘦^高的原因可能如下。首先，GC/MS法篩查可疑陽性者不能即認為是遺傳性代謝病，只是提示先天性代謝異?？赡埽@些異常需要在進一步的特異性檢查后確診或排除。其次，已經(jīng)表現(xiàn)為發(fā)育落后的患兒其先天性代謝異常的發(fā)病率遠高于目前表現(xiàn)為正常的患兒。同時，與本次分析的樣本量較小有關。

17例篩查陽性的患兒從病例特點來看，絕大多數(shù)臨床上表現(xiàn)為發(fā)育落后（94.12%），只有4例有孕期保胎、感染史（23.53%），3例生時窒息（17.65%），4例為雙胎、早產(chǎn)、低體重（23.53%），3例有家族史（17.65%），5例EEG或MRI異常（29.41%），比例均低于30%。需要注意的是，有4例臨床上疑似為“腦性癱瘓”，臨床查體發(fā)現(xiàn)肌張力高、病理征陽性的患兒，進行代謝篩查后有陽性發(fā)現(xiàn)。故對于以發(fā)育落后為主要表現(xiàn)，康復訓練效果欠佳，臨床癥狀有波動的疑似遺傳代謝性疾病的患兒，需要高度警惕遺傳性代謝病的可能。

我們需要進一步做的是：①將可疑陽性的病例根據(jù)不同篩查結果，選擇血氨基酸譜、?；鈮A分析，血糖、血電解質(zhì)、血氨、乳酸、丙酮酸、基因分析等，根據(jù)病情選擇性進行組織活檢和影像學檢查，腦電圖、超聲心動圖、裂隙燈等特殊檢查，進一步明確診斷；②與檢測機構合作，在大樣本量的檢測基礎上，制定不同年齡段各項指標的正常值范圍，為臨床診斷和鑒別診斷提供更加可靠的依據(jù)；③也可以將此篩查項目擴展到新生兒的常規(guī)篩查，對于許多遺傳性代謝病的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療，有重要的指導作用。

對于明確診斷的遺傳性代謝病，治療的主要措施包括控制代謝產(chǎn)物蓄積（限制飲食攝入、控制內(nèi)源性毒性底物產(chǎn)生、加速毒性產(chǎn)物清除），替代終末代謝產(chǎn)物（反應產(chǎn)物替代、基因產(chǎn)物替代），輔助因子替代（維生素、生物素、葉酸、輔酶Q），基因轉移（器官移植、單基因轉移）和及時正確的支持對癥處理（補充液體、糾正酸堿平衡和電解質(zhì)紊亂）等［16-17］。如MMA患者主要通過維生素B12進行實驗性治療，如果患者對維生素B12治療有效，則為甲基丙二酰輔酶A變位酶（methylmalonyl coenzyme amutase，MCM）輔酶缺陷型，通過補充維生素B12，改善酶功能進行治療；而維生素B12治療無效的，則需嚴格減少支鏈氨基酸的攝入，高熱量低蛋白飲食，體內(nèi)甲基丙二酸升高者需服用左卡尼汀幫助機體排出毒性有機酸［18］。經(jīng)過針對性治療，許多疾病可以得到有效控制，并輔以適當?shù)目祻陀柧?，以減少患兒肢體、智力、語言的功能障礙。

因此，疑有遺傳性代謝病的患兒進行相關的尿液篩查，對于明確診斷，選擇下一步治療方案有積極的作用。同時也是開展遺傳咨詢和系譜分析，進行產(chǎn)前診斷、攜帶者檢出、基因分析、遺傳病分子機制研究的基礎，對于提高人口素質(zhì)、降低出生缺陷等具有重要意義。

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Screening of Urinary OrganicAcid in Children with High Risk of Inherited Metabolic Diseases

ZENG Fan-yong，WU Wei-hong，LIU Jian-jun，ZHANG Yan，LI Nan-ling，XI Bing-yu
1.Capital Medical University School of Rehabilitation Medicine，Beijing 100068，China；2.Beijing Bo'ai Hospital，China Rehabilitation Research Centre，Beijing 100068，China

Correspondence to ZENG Fan-yong.E-mail：zengfyzeng@sina.com

Objective To explore the application of gas chromatography mass spectrometry（GC/MS）in children with high risk of inherited metabolic disease.Methods From March，2010 to November，2015，119 children suspected with inherited metabolic disease were included.The urinary organic acid was detected with GC/MS，and related diseases were screened.Results Seventeen children（14.29%）were positive with inherited metabolic disease，in which 16 cases（94.12%）manifested with development retardation.20 children（16.81%）were probable positive.Conclusion GC/MS is effective in screening children with high risk of inherited metabolic disease，which can provide basis for further diagnosis.

inherited metabolic disease；gas chromatography mass spectrometry；organic acid；screening

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.08.014

R722.11

A

1006-9771（2016）08-0947-05

1.首都醫(yī)科大學康復醫(yī)學院，北京市100068；2.中國康復研究中心北京博愛醫(yī)院，北京市100068。作者簡介：曾凡勇（1976-），女，漢族，四川隆昌縣人，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向：兒童康復。E-mail：zengfyzeng@sina.com

納入標準：①不明原因智力低下、發(fā)育落后；②難以控制的驚厥發(fā)作；③不明原因肝脾腫大/肝功能損害、反復嘔吐/腹瀉/喂養(yǎng)困難等；④不明原因的代謝紊亂，如低血糖、高氨血癥、代謝性酸中毒、酮癥等；⑤常與進食蛋白質(zhì)相關的嚴重嘔吐；⑥尿液、汗液有特殊氣味；⑦容貌怪異、皮膚和毛發(fā)顏色異常、脫發(fā)、頑固皮疹等。

排除標準：已明確診斷為腦性癱瘓、染色體病、腦外傷恢復期、病毒性/細菌性腦炎、格林-巴利綜合征恢復期、脊髓性肌萎縮癥等疾病所致運動、智力、語言等功能障礙。

對符合標準的患兒進行尿液GC/MS檢查。

1.2標本采集

留取晨起空腹尿液8～10 ml（1周內(nèi)未使用任何藥物），如患兒年齡小無法留取晨尿，也可以留取隨機尿。尿樣均放置在冰箱-18℃冷凍，冰盒保存送檢。樣本送至北京福佑龍惠（遺傳）?？崎T診部（Similan Labs），應用氣質(zhì)聯(lián)用儀GCMS-QP2010Plus（日本島津公司）上樣檢查，該儀器可篩查尿有機酸化合物共133種。

1.2.1樣品處理

試劑和材料：雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基氯硅烷（TMCS）、托品酸、17烷酸、24烷酸、尿素酶：美國Sigma Aldrich公司。鹽酸羥銨、氫氧化鈉、鹽酸、無水硫酸鈉、乙酸乙酯：北京國藥公司。

取尿液5 ml，測定肌酐濃度。取相當于含0.2 mg肌酐的尿樣，依次加入尿素酶、鹽酸羥銨、氫氧化鈉、鹽酸，除去蛋白質(zhì)，進行α-酮酸的腭化處理，并加入托品酸、17烷酸、24烷酸作為內(nèi)標。用乙酸乙酯兩次萃取，分取有機溶劑相，加無水硫酸鈉去除殘余水分，用高純氮氣吹干后，加入雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺與三甲基氯硅烷混合物進行甲基硅烷化衍生，80℃溫育后移至GC/MS進行分析。

1.2.2儀器設置

色譜柱DB-5 30 m×0.25 mm×1.00 μm；柱溫100℃；進樣口溫度280℃；分流比20∶1；柱流量1.00 ml/min；溫度程序100℃（4 min）-4℃/min-280℃（10 min）；進樣量1 μl；離子源溫度200℃；接口溫度280℃；采集模式SCAN；掃描時間6～53 min；掃描范圍m/z 50～m/z 500。

1.3統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對檢測結果進行分析，對于陽性病例的檢測異常指標采用單樣本t檢驗。顯著性水平α=0.05。

（2016-02-02

2016-04-14）