馮　超，陳忠瓊（重慶市動物疫病預防控制中心，重慶　401120）

重慶市2012—2015年新城疫流行病學監(jiān)測

馮超，陳忠瓊
（重慶市動物疫病預防控制中心，重慶401120）

采用熒光RT-PCR方法，對隨機抽取自2012—2015年重慶市23個區(qū)縣561個場點臨床健康的15 930份禽咽肛拭子和環(huán)境拭子樣品，進行新城疫病毒病原學檢測，并對檢出樣品所在群體進行流行病學調查。病原學檢測結果顯示：228份樣品呈新城疫病毒核酸陽性，病毒個體總檢出率為1.43%；53個場點檢出新城疫病毒，群體總檢出率為9.45%。流行病學調查顯示：2012—2015年重慶市存在不同程度的新城疫感染，病毒檢出率呈逐年下降趨勢。一年四季均可檢出病毒，其中冬季、春季和秋冬交接季的檢出率較高。不同環(huán)節(jié)中，不同品種、日齡的家禽病毒檢出率有差異。其中，市場環(huán)節(jié)中的病毒檢出率最高，其次是中小型養(yǎng)殖場；鴿群中的病毒檢出率高于其他禽群；蛋雞中病毒檢出率較高的主要集中在120～300日齡，而肉雞主要集中在40～120日齡。不同地區(qū)的病毒檢出率亦不同，渝西片區(qū)高于渝東南和渝東北片區(qū)。監(jiān)測結果表明，重慶市的市場和中小型養(yǎng)殖場發(fā)生新城疫感染和傳播的風險最大，應重點加強監(jiān)測和防控。

新城疫病毒；病原學檢測；流行病學調查

新城疫（Newcastle Disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）強毒株感染引起的一種敗血性、急性、高度接觸性禽類傳染病［1］。多年來，我國盡管開展了以疫苗接種為主的綜合防控措施，有效控制了新城疫的暴發(fā)流行，但由于其病原多樣，環(huán)境中病毒污染嚴重，局部地區(qū)呈地方性流行，非典型新城疫及免疫帶毒現象普遍［2］，以及各養(yǎng)殖企業(yè)防控水平差異較大，新城疫仍然是嚴重危害我國養(yǎng)禽業(yè)的常見病。為了解近年來重慶市家禽新城疫流行情況，2012—2015年在重慶市23個區(qū)縣561個場點進行了新城疫病毒病原學檢測和流行病學調查。

1　材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品。2012—2015年，按照三級抽樣法，在重慶市家禽主產的23個區(qū)縣68個鄉(xiāng)鎮(zhèn)137個行政村561個場點，隨機抽取臨床健康的15 930份禽拭子樣品，其中咽肛拭子樣品14 973份、環(huán)境拭子樣品957份。樣品置于含抗生素和甘油的PBS液（pH7.4）中保存。

1.1.2 試劑。新城疫病毒強毒株（NDV）熒光RT-PCR檢測試劑盒，購自凱杰生物工程（深圳）有限公司；病毒RNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取。參照天根生化科技（北京）有限公司的病毒RNA 提取試劑盒說明書提取樣品的RNA。

1.2.2 熒光RT-PCR檢測。以提取的RNA 為核酸模板，采用熒光RT-PCR方法，對樣品進行NDV病原學檢測。參照凱杰生物工程（深圳）有限公司的新城疫病毒強毒株（NDV）熒光RT-PCR檢測試劑盒說明書，進行如下操作：設檢測樣品數量為N，取一個干凈無菌的1.5 mL離心管，向離心管中分別加入N×0.25 μL Taq酶、N×0.25 μL RT-PCR酶、N×15 μL RT-PCR反應液，充分混勻并低速瞬時離心后，分別向N個PCR反應管中各分裝15 μL混合液，之后再分別向每個PCR反應管中加入10 μL RNA模板。在熒光PCR儀上進行42 ℃ 30 min；92 ℃ 3 min；92 ℃ 10 sec，45 ℃ 30 sec，72 ℃1 min，5個循環(huán)；92 ℃ 10 sec，60 ℃ 30 sec，收集熒光FAM，40個循環(huán)的擴增反應。

1.2.3 流行病學調查。根據流行病學調查方法，對病毒檢出樣品所在群體進行流行病學調查分析。

2　結果

2.1 NDV總檢測結果

2012—2015年，采集的15 930份拭子樣品中，有228份樣品呈NDV核酸陽性，病毒個體檢出率為1.43%，其中咽肛拭子樣品和環(huán)境拭子樣品病毒個體檢出率分別為1.12%和 6.37%（表1）。561個場點中有53個場點檢出NDV，病毒群體檢出率為9.45%。

表1　重慶市2012—2015年拭子樣品NDV檢測結果

2.2 不同時間段的病毒檢出結果

不同年份均有NDV被檢出，總體呈下降趨勢，具體數據和變化見表2和圖1。不同月份的NDV檢出率有差異，病毒個體檢出率最高的月份依次是1月和12月，最低的是7月和8月，詳見表3和圖2。

表2　重慶市2012—2015年不同年份NDV檢測結果

圖1　重慶市2012—2015年不同年份NDV檢測結果變化曲線

2.3 不同環(huán)節(jié)的病毒檢出結果

不同環(huán)節(jié)中，養(yǎng)殖場、散養(yǎng)戶和市場中樣品的病毒個體檢出率不同，市場中的檢出率最高，詳見表4。

2.4 不同禽群的病毒檢出結果

除種禽中未檢出NDV之外，其他禽群均有不同程度的檢出，詳見表5。

表3　重慶市2012—2015年不同月份NDV檢測結果

圖2　重慶市2012—2015年各月份NDV病毒檢出率變化曲線

表4　重慶市2012—2015年不同環(huán)節(jié)NDV檢測結果

表5　重慶市2012—2015年不同禽群NDV檢測結果

2.5 不同日齡的病毒檢出結果

不同日齡的NDV檢出率不同。蛋雞中的病毒檢出主要集中在120～300日齡的產蛋高峰期蛋雞，病毒個體檢出率為0.92%，群體檢出率為7.02%；肉雞中的病毒檢出主要集中在40～120日齡的雛雞和青年雞，病毒個體檢出率為1.83%，群體檢出率為15.60%；鴨群中的病毒檢出主要集中在小于49日齡的雛鴨，病毒個體檢出率為3.77%，群體檢出率為15.79%；鵝群中的病毒檢出主要在30～60日齡的鵝，病毒個體檢出率為2.78%，群體檢出率為11.11%；鴿群中的病毒檢出主要在小于30日齡的雛鴿，病毒個體檢出率為5.56%，群體檢出率為16.67%（表6）。

表6　重慶市2012—2015年不同家禽日齡NDV檢測結果

2.6 不同地區(qū)的病毒檢出結果

2012—2015年，重慶市不同地區(qū)均有NDV被檢出，但存在區(qū)間差異，詳見表7。

表7　重慶市2012—2015年不同地區(qū)NDV檢測結果

3　分析與討論

2012—2015年的NDV病原學檢測結果顯示，15 930份家禽和環(huán)境樣品中有228份樣品檢出病毒，其中家禽樣品病毒檢出率為1.12%，環(huán)境樣品病毒檢出率為6.37%，病毒群體總檢出率為9.45%，說明重慶市存在一定的NDV感染，并且環(huán)境中病毒污染情況相對嚴重。此外，重慶市不同地區(qū)NDV的檢出情況不同，渝西片區(qū)病毒檢出率高于渝東南片區(qū)和渝東北片區(qū)，這可能與渝西片區(qū)家禽養(yǎng)殖量大、飼養(yǎng)密度高有關。

2012—2015年的NDV病毒檢出率呈逐年下降趨勢，說明近年來重慶市家禽新城疫的防控取得良好成效。這和近年來規(guī)?；B(yǎng)殖程度逐漸提高有關，同時還得益于重慶市大力推行的“以監(jiān)促防、以檢計酬獸醫(yī)工作考核機制”和“憑動物疫病監(jiān)（檢）測報告、風險評估報告出具產地檢疫證明”的新工作制度。

調查結果表明，重慶市市場環(huán)節(jié)病毒檢出率高于養(yǎng)殖場和散養(yǎng)戶。流行病學調查顯示，病毒檢出率高的市場，大多環(huán)境差、流通頻繁復雜，未按規(guī)定進行日常消毒或消毒不徹底，不同來源地的家禽混合一起銷售，未實行全進全出。因此，市場是新城疫的主要傳染源。本次調查還發(fā)現，有病毒檢出的養(yǎng)殖場多為中小型養(yǎng)殖場（存欄量＜6 000羽），約占80%，且大多是半封閉式，禽群飼養(yǎng)密度高，通風不良，環(huán)境衛(wèi)生差，免疫程序混亂，技術水平和飼養(yǎng)管理欠佳，生物安全意識欠缺，消毒措施不健全。這與伏小平等［3-5］的中小型飼養(yǎng)場新城疫發(fā)病率相對更高的研究調查結果相一致，說明中小規(guī)模飼養(yǎng)場是發(fā)生新城疫的高風險區(qū)。

NDV在不同禽群中均可檢出，說明重慶市NDV感染無種群特異性，張春嶺［5］和岳旭龍等［4］的研究結果也證實了這一觀點。值得關注的是，以前人們普遍認為水禽對NDV具有很強的抵抗力，但近年來不但相繼出現鵝群和鴨群發(fā)病，以及鴨產蛋下降的報道［6-8］，還出現了健康家養(yǎng)水禽均可攜帶NDV弱毒并通過泄殖腔和氣管向外排出的報道［9-10］。弱毒株感染雞體后通過連續(xù)傳代能夠增強其毒力［11］。因此，水禽和陸禽之間的NDV交叉循環(huán)傳播，特別是水禽NDV的高帶毒率對家禽新城疫的流行病學意義，應引起高度重視。

重慶市一年四季均可檢出NDV，沒有明顯的季節(jié)性，但各月的病毒檢出率存在差異。寒冷濕潤月份的病毒檢出率較高，而比較炎熱月份的病毒檢出率較低。總體而言，冬季、春季以及秋冬交接季的病毒檢出率較高，說明重慶市新城疫的發(fā)生與氣候存在一定的相關性。這可能與重慶市四季氣候差異明顯、寒冷季節(jié)家禽自身抵抗力減弱有關。這與國內學者徐劍［12］、王玨等［9］、徐守振等［13］的調查結果相一致。

重慶市各日齡段的家禽病毒檢出率各不相同，雛禽和青年禽檢出率較高。蛋雞中的病毒檢出主要集中產蛋高峰期蛋雞。NDV可影響蛋的品質和產蛋率。而肉雞主要集中在雛雞和青年雞。這與岳旭龍等［4］調查發(fā)現河南省2010—2011年間部分地區(qū)新城疫發(fā)病日齡主要集中在34～42日齡肉雞和40～70日齡蛋雞，以及李華坤等［14］對徐州市調查發(fā)現新城疫發(fā)病主要集中在20日齡雞的結果存在一定差異，其原因還有待進一步深入調查與研究。

資料［15］顯示，檢測NDV最靈敏的方法是采用雞胚進行病毒分離。限于實驗條件，本研究采用了靈敏性略低于雞胚病毒分離但能檢測中強毒株的熒光RT-PCR方法。該方法特異性好、敏感性高（能檢測10-8～10-7感染尿囊液），所用試劑均來自于同一個廠家，因此研究結果能夠客觀反映重慶市2012—2015年的NDV流行規(guī)律。

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（責任編輯：朱迪國）

Epidemiological Investigation of Newcastle Disease Virus in Chongqing City during 2012—2015

Feng Chao，Chen Zhongqiong
（Chongqiong Center for Animal Disease Control and Prevention，Chongqing 401120）

Etiological detection on Newcastle Disease Virus（NDV）was carried out in Chongqing from 2012 to 2015. 15 930 pharyngeal， cloacal andenvironmental swab samples randomly collected from clinical health poultry in 561 poultry farms of 23 districts in Chongqing were tested by fluorescence RT-PCR ，and epidemiological investigation was conducted towards flocks from which positive samples were detected. The etiological detection results showed that 228 samples were NDV positives with avirus detection rate at individual level of 1.43%，and 53 flocks were NDV positives with a virus detection rate at flock of 9.45%. According to the results of epidemiological investigation，there were different levels of infection on NDV in Chongqing during 2012—2015，and the virus detection rate declined year by year. The virus could be detected all the year round，but the virus detection rate was relatively higher in spring，winter and later autumn. The virus detection rate of samples from different sources，different kinds and different dayold poultry were different. The virus detection rate of samples from markets was the highest，and the second was samples from the small and medium-sized farms. The virus detection rate of pigeons was higher than that of other poultry. Positive samples of layers were mainly from 120～300 days old chicken，while those of broilers were mainly from 40～120 days old ones. The virus detection rate of different areas were different. The virus detection rate of west Chongqiong was higher than that of the southeast and southwest of Chongqiong. The results indicated that the highest risk of infection and spreading of ND were at markets，as well as on small and medium sized farms of Chongqing. This suggests that NDV surveillance and control should be enhanced.

Newcastle disease virus；etiological detection；epidemiological investigation

S851.3

B

1005-944X（2016）08-0017-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.08.005