樊曉旭，趙永剛，李　林，吳曉東，王志亮（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，外來病研究中心，山東青島　266032）

重組酶聚合酶擴增技術(shù)在疾病快速檢測中的研究進展

樊曉旭，趙永剛，李林，吳曉東，王志亮
（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，外來病研究中心，山東青島266032）

重組酶聚合酶擴增技術(shù)（RPA）是近年來開發(fā)的核酸擴增技術(shù)，在保證靈敏、特異的同時，操作簡單、耗時短，能夠在常溫下10～20分鐘內(nèi)對靶DNA進行擴增，對實驗設(shè)備、資源的要求低，適用于獸醫(yī)、食品安全、生物防御、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的快速診斷。本文介紹了該技術(shù)的原理及目前在病毒、細菌、寄生蟲等病原檢測方面的應(yīng)用，展望了其現(xiàn)場檢測方面的應(yīng)用前景。

重組酶聚合酶擴增；快速診斷；應(yīng)用

1　引言

1985年，美國PE-Cetus公司發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。該原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，反應(yīng)通過變性、退火、延伸三個步驟，在基于靶序列兩端互補的特異性寡核苷酸引物參與下，實現(xiàn)DNA的體外合成和擴增?，F(xiàn)在，由英國TwistDx Inc公司開發(fā)的重組酶聚合酶擴增技術(shù)（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），對核酸擴增技術(shù)進行改進［1］。相比經(jīng)典PCR技術(shù)，RPA技術(shù)主要優(yōu)勢之一在于等溫。常規(guī)PCR必須經(jīng)過不同溫度環(huán)節(jié)，而RPA反應(yīng)在常溫下即可進行反應(yīng)，甚至人體體溫即可提供反應(yīng)所需的溫度環(huán)境，其最適溫度在37～42 ℃。優(yōu)勢之二在于檢測耗時短。整個過程在10～20分鐘內(nèi)即可完成，且無需變性，不僅大大縮短了檢測反應(yīng)時間，也無需與PCR儀類似的專門溫控設(shè)備，從而實現(xiàn)了便攜式快速核酸檢測。優(yōu)勢之三在于靈敏。RPA技術(shù)在縮短反應(yīng)時間的同時也保持了高靈敏性，從單個模板分子可得到大約1012數(shù)量級的擴增產(chǎn)物。優(yōu)勢之四在于結(jié)果讀取多樣化。RPA結(jié)果可通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，也可類似real-time PCR對擴增過程進行實時監(jiān)控，還可以通過試紙條（側(cè)流層析試紙條LFD）讀取結(jié)果。本文擬從RPA技術(shù)的原理、在疾病快速檢測中的應(yīng)用方面作一綜述。

2　原理

2.1 擴增原理

RPA反應(yīng)中，重組酶首先與上下游引物結(jié)合，尋找同源的雙鏈DNA，一旦定位，發(fā)生鏈交換，單鏈綁定蛋白（SSB）與親本鏈綁定，阻止其與脫離的模板鏈發(fā)生相互作用。接著，DNA聚合酶從上下游引物的3'端啟動模板合成，形成兩條雙鏈DNA，如此循環(huán)重復(fù)進而實現(xiàn)擴增［2］（圖1）。若引入逆轉(zhuǎn)錄酶，建立RT-RPA方法，也適用于RNA的快速檢測。

圖1　重組酶聚合酶擴增反應(yīng)機理［2］

2.2 引物、探針設(shè)計

在引物設(shè)計上，RPA與PCR類似，但差異之處在于引物的長度、序列組成和選取標(biāo)準(zhǔn)。RPA引物在長度上通常至少為30～35 bp，這是由于單鏈綁定蛋白需要寡核苷酸長度在30～35 bp以上才能將其整合到雙鏈DNA［3］。所擴增的產(chǎn)物長度通常在500 bp以內(nèi)，以100～200 bp為宜，可保證檢測的敏感性和反應(yīng)速度。此外，RPA引物的序列組成有著特定的要求：5'端3～5個核苷酸應(yīng)當(dāng)避免出現(xiàn)多個G；在3'端應(yīng)有GC；避免連續(xù)出現(xiàn)多個相同核苷酸；GC含量占30～70%；避免引物形成二聚體和二級結(jié)構(gòu)。3'端錯配數(shù)超過一個堿基，會阻礙RPA反應(yīng)的進行。在引物兩端和中心有3個堿基發(fā)生錯配，則會影響RPA的檢測效率。RPA實驗中的探針長度約為46～52個核苷酸，在3'端設(shè)計阻斷物，如C3-間隔、磷酸鹽、胺、生物素四乙二醇（BTG）等，抑制DNA鏈的延伸。探針內(nèi)部添加了切割位點，可供exo、nfo、fpg酶切割。只有當(dāng)探針與模板DNA呈綁定狀態(tài)，才發(fā)生切割。探針的切割位點距離5'端至少30個堿基，距離3'端至少15個堿基。

2.3 擴增產(chǎn)物的檢測方式

目前，TwistAmp basic kit試劑盒可采用瓊脂糖凝膠電泳方法讀取結(jié)果；TwistAmp exo/fpg kit 和TwistAmp nfo kit可分別通過實時熒光定量和側(cè)流層析試紙條方式讀取結(jié)果，上述兩類試劑盒與TwistAmp basic kit相比，實際應(yīng)用更為廣泛。

在實時熒光定量檢測中，TwistAmp exo探針內(nèi)部切割位點側(cè)面有dT-熒光發(fā)光基團，與dT-淬滅基團相對應(yīng)。探針上具有四氫呋喃（THF）殘基，可供大腸桿菌核酸外切酶III（exo酶）識別，切割分離熒光基團和淬滅基團，產(chǎn)生并積累熒光信號，供便攜式熒光檢測儀進行檢測。同時，通過exo識別THF，釋放3'端阻斷物，在Bsu聚合酶作用下開始從3'端延長擴增。

在TwistAmp nfo實驗中，探針上的四氫呋喃（THF）殘基由大腸桿菌核酸內(nèi)切酶IV（nfo酶）識別，抗熒光標(biāo)記的金納米顆粒與熒光團結(jié)合；通過綁定鏈霉親和素，還可檢測到在下游引物5'端標(biāo)記的生物素，由此可通過側(cè)流層析試紙條檢測到標(biāo)記的雙鏈（圖2）。

圖2　重組酶聚合酶擴增不同的檢測方法［2］

3　應(yīng)用

以PubMed（NLM）數(shù)據(jù)庫為例，按關(guān)鍵詞“Recombinase Polymerase Amplification”進行題目檢索，可檢索到相關(guān)文獻共63篇。其中，2010年1篇、2011年1篇、2012年3篇、2013年6篇、2014年19篇、2015年21篇，2016年截至5月11篇。從2010—2016年平均每月發(fā)表的文章數(shù)量可以看出，總體上，RPA相關(guān)研究數(shù)呈上升趨勢（圖3）。研究包括了對感染動植物的病原微生物檢測，如病毒、細菌、寄生蟲、鉤端螺旋體、衣原體等。

圖3　RPA相關(guān)文獻發(fā)表情況（截至2016年5月）

3.1 病毒檢測

在病毒檢測方面，RPA被應(yīng)用到嬰兒艾滋病毒感染的檢測中，無需復(fù)雜的儀器，在20分鐘內(nèi)即可檢測低拷貝量的HIV-1亞型前DNA，同時增加了逆轉(zhuǎn)錄（RT）RPA反應(yīng)，可檢測HIV-1 RNA，方法敏感、快速、操作簡便［4］。在31～43℃溫度范圍內(nèi)，可保證RPA-HIV技術(shù)的檢測效果，適于撒哈拉以南非洲地區(qū)戶外使用。Yehia 等針對埃及禽流感病毒流行株，在H5基因HA2片段970 bp，設(shè)計了三條上游引物、三條下游引物、一條exo探針。開發(fā)H5RT-RPA方法可在7分鐘檢測到單個RNA分子，而實時RT-PCR檢測方法耗時至少90分鐘，實時RT-LAMP技術(shù)也需要30～60分鐘。在保證敏感性和特異性的同時，RPA較其他檢測方法縮短了反應(yīng)時間［5］。針對犬細小病毒2型（CPV-2）VP2基因保守區(qū)片段（約210 bp）開發(fā)了RPA檢測方法，反應(yīng)可在等溫水浴中進行，在資源有限的環(huán)境下可作為犬細小病毒檢測潛在的替代方法［6］。針對4個血清型DENV 3'UTR保守區(qū)，設(shè)計的引物和探針，建立RT-RPA方法，相比RT-LAMP、RT-qPCR，RT-RPA表現(xiàn)出良好的一致性，是目前最快速的分子診斷方法，也成為實驗室常規(guī)血清學(xué)檢測方法的補充。Faye等［7］報道了在幾內(nèi)亞埃博拉疫情暴發(fā)期間，使用Qiagen公司SpeedXtract （SE）快速提取血清和拭子樣本中的病毒RNA，并使用RT-RPA方法對N基因進行檢測，其特異性、靈敏性良好，可在8分鐘檢測到血漿樣品中15個拷貝數(shù)的RNA，在檢測臨床樣本中，與RT-qPCR方法的復(fù)合率為100%。口蹄疫病毒實時定量RTRPA檢測方法與RT-LAMP方法相比，引物設(shè)計上更為簡單；較RT-PCR方法，節(jié)約了反應(yīng)時間，適于邊境口岸監(jiān)測及口蹄疫暴發(fā)地區(qū)的感染動物篩查。目前，分別針對中東呼吸綜合征冠狀病毒、牛冠狀病毒、牛痘病毒、埃博拉病毒、蘇丹病毒、馬爾堡病毒、西格瑪病毒、羊口瘡病毒等設(shè)計了特異引物和探針，建立了RPA方法，證實具有良好的特異性和敏感性（表1）。

3.2 細菌檢測

在細菌檢測方面，關(guān)于RPA最早報道是對耐藥性金黃色葡萄球菌的檢測研究。Lutz等［8］開發(fā)了基于鉑片微流體技術(shù)的卡盒，檢出限為20個拷貝數(shù)DNA，反應(yīng)15分鐘即可得到結(jié)果。Ren等［9］針對布氏桿菌omp31基因片段設(shè)計了四條上游引物和四條下游引物，進行組合并檢測其反應(yīng)時間和熒光強度，篩選出最佳引物組合。通過將RPA技術(shù)與固相芯片技術(shù)結(jié)合，開發(fā)了淋病奈瑟氏菌、沙門氏菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的快速、多重檢測技術(shù)。針對新生兒B族鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體（MTC）、鼠疫桿菌、炭疽桿菌、弗朗西斯土拉桿菌等開發(fā)的RPA檢測方法較PCR技術(shù)明顯縮短了檢測時間，具有臨床分子診斷應(yīng)用前景［10］。在食品安全檢測領(lǐng)域，特別是在污染細菌的牛奶檢測中，RPA酶和緩沖液混合，在39 ℃下，無需提取DNA，即可檢測牛奶樣品中的沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7、副溶血性弧菌，整個檢測至結(jié)果讀取總耗時僅為30分鐘。

表1　RPA技術(shù)檢測病原的報道

3.3 寄生蟲檢測

在寄生蟲檢測方面，Crannell等［11］采用RPA檢測糞便樣品中賈第鞭毛蟲，使用側(cè)流層析試紙條讀取結(jié)果，每毫升糞便樣品中最低可檢測到103～103.5個卵囊，敏感性是PCR方法的73%，特異性是顯微鏡檢查方法的95%，方法通過進一步改進有望用于“point-of-care”（POC，床旁檢測、現(xiàn)場檢測）。Crannell等［12］進一步開發(fā)了基于RPA技術(shù)的多重側(cè)流層析試紙條，通過構(gòu)建不同的標(biāo)記探針，能夠同時檢測和鑒別引起腹瀉的原蟲：賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲和阿米巴蟲DNA，從糞便樣本提取活寄生蟲DNA，檢測限分別為每個反應(yīng)444、6、9個寄生蟲。目前還開發(fā)尿路血吸蟲、阿米巴變形蟲、惡性瘧原蟲側(cè)流層析試紙條，已證實具有良好的特異性和靈敏性，且使用便捷。

3.4 其他病原

針對山羊支原體、恙蟲病立克次體、沙眼衣原體（O. tsutsugamushi或 R. typhi）分別開發(fā)了熒光定量RPA方法和RPA側(cè)流層析試紙條，檢測靈敏度與熒光定量PCR方法相當(dāng)。Ahmed等［13］開發(fā)實時定量RPA方法用于檢測血液臨床樣品中的鉤端螺旋體，并有望檢測水庫等環(huán)境中存在的病原。

4　展望

今后RPA檢測技術(shù)有望向多重、現(xiàn)場快速檢測方向發(fā)展。

4.1 多重

使用絕緣硅芯片制備64道光學(xué)環(huán)狀諧振器，與RPA技術(shù)聯(lián)用，可實現(xiàn)樣品的多重檢測。Crannell等［12］基于RPA技術(shù)的多重側(cè)流層析試紙條，通過構(gòu)建不同的標(biāo)記探針，能夠同時檢測和鑒別引起腹瀉的原蟲：賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲和阿米巴蟲。通過將RPA技術(shù)與固相芯片技術(shù)結(jié)合，開發(fā)了多重檢測技術(shù)，通過特定的固定化寡核苷酸產(chǎn)生空間分辨的信號，并對信號進行讀取，實現(xiàn)在38℃下對淋病奈瑟氏菌、沙門氏菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的快速檢測［14］。

4.2 現(xiàn)場

由于實時定量RT-PCR儀通常體積較大、價格昂貴、操作復(fù)雜，不適合現(xiàn)場篩查檢測分析。目前基于RPA技術(shù)和SlipChip（滑動芯片），開發(fā)透明丙烯酸樹脂裝置，用于檢測艱難梭菌毒素B基因，由于其易用性和低成本，可投放于醫(yī)療條件有限的地區(qū)應(yīng)用于現(xiàn)場快速診斷［1］。微流體數(shù)字化RPA滑動芯片，可對單分子靶核酸進行放大和計數(shù)，從RPA擴增反應(yīng)起始前可淘汰假陽性結(jié)果，采用終點熒光讀數(shù)進行“是”或“否”的數(shù)字量化［15］。例如，2014年，當(dāng)幾內(nèi)亞暴發(fā)埃博拉疫情時，使用了移動實驗室對埃博拉病毒進行診斷，其核心技術(shù)為RPA。移動實驗室包括手套式操作箱和DiaS裝置（含用于實時熒光檢測的ESEQuant TS2和集成觸摸屏），易于安裝和運輸。通過使用DiaS裝置，進行RT-RPA反應(yīng)，包括加樣和混勻時間，共需20分鐘即可讀取結(jié)果。移動實驗室通過太陽能電池可工作16小時［7］。

5　小結(jié)

相比傳統(tǒng)血清學(xué)檢測，RPA技術(shù)的優(yōu)勢在于可實現(xiàn)感染早期的診斷，且敏感性高。與RPA等溫擴增技術(shù)類似，迄今，由日本Eiken公司開發(fā)的LAMP（環(huán)介導(dǎo)等溫擴增）技術(shù)的相關(guān)文獻報道已超過1 000篇。但相比RPA技術(shù)，LAMP技術(shù)引物設(shè)計繁瑣、反應(yīng)時間長、讀取結(jié)果主觀性強。RPA方法操作簡單，耗時短，無需昂貴的設(shè)備及相關(guān)的專業(yè)培訓(xùn)，在檢測的靈敏性和特異性上與熒光定量PCR相當(dāng)。該方法適用于一些難以根除的疾病，如艾滋病、瘧疾、肺結(jié)核以及烈性、新發(fā)傳染病病原，如埃博拉病毒、中東呼吸綜合征冠狀病毒、寨卡病毒的檢測，特別適用于經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)的現(xiàn)場檢測，具有廣闊的應(yīng)用前景。

［1］ Tsaloglou M N，Watson R J，Rushworth C M，et al. Realtime microfluidic recombinase polymerase amplification for the toxin B gene of Clostridium difficile on a SlipChip platform［J］. Analyst，2015，140（1）：264-258.

［2］ James A，Macdonald J. Recombinase polymerase amplification: Emergence as a critical molecular technology for rapid，low-resource diagnostics［J］. Expert Rev Mol Diagn，2015，15（11）：1475-1489.

［3］ Piepenburg O，Williams C H，Stemple D L，et al. DNA detection using recombination proteins［J］. PLoS Biol，2006，4（7）：e204.

［4］ Crannell Z A，Rohrman B，Richards-Kortum R. Quantification of HIV-1 DNA using real-time recombinase polymerase amplification［J］. Anal Chem，2014，86（12）：5615-5619.

［5］ Yehia N，Arafa A S，Abd El Wahed A，et al. Development of reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for avian influenza H5N1 HA gene detection［J］. J Virol Methods，2015，223：45-49.

［6］ Wang J，Liu L，Li R，et al. Rapid and sensitive detection of canine parvovirus type 2 by recombinase polymerase amplification［J］. Arch Virol，2016，161（4）：1015-1018.

［7］ Faye O，F(xiàn)aye O，Soropogui B，et al. Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015［J］. Euro Surveill，2015，20（44）：1.

［8］ Lutz S，Weber P，F(xiàn)ocke M，et al. Microfluidic lab-on-afoil for nucleic acid analysis based on isothermal recombinase polymerase amplification（RPA）［J］. Lab Chip，2010，10（7）：893-887.

［9］ Ren H，Yang M，Zhang G，et al. Development of a rapid recombinase polymerase amplification assay for detection of Brucella in blood samples［J］. Mol Cell Probes，2016，30（2）：122-124.

［10］ Euler M，Wang Y，Heidenreich D，et al. Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents［J］. J Clin Microbiol，2013，51（4）：1110-1117.

［11］ Crannell Z A，Cabada M M，Castellanos-Gonzalez A，et al. Recombinase polymerase amplification-based assay to diagnose Giardia in stool samples［J］. Am J Trop Med Hyg，2015，92（3）：583-587.

［12］ Crannell Z，Castellanos-Gonzalez A，Nair G，et al. Multiplexed Recombinase Polymerase Amplification Assay To Detect Intestinal Protozoa［J］. Anal Chem，2016，88（3）：1610.

［13］ Ahmed A，van der Linden H，Hartskeerl R A. Development of a recombinase polymerase amplification assay for the detection of pathogenic Leptospira［J］. Int J Environ Res Public Health，2014，11（5）：4953-4964.

［14］ Kersting S，Rausch V，Bier F F，et al. Multiplex isothermal solid-phase recombinase polymerase amplification for the specific and fast DNA-based detection of three bacterial pathogens［J］. Mikrochim Acta，2014，181（13）：1715-1723.

［15］ Shen F，Davydova E K，Du W，et al. Digital isothermal quantification of nucleic acids via simultaneous chemical initiation of recombinase polymerase amplification reactions on SlipChip［J］. Anal Chem，2011，83（9）：3533-3540.

（責(zé)任編輯：杜憲）

Research Progress of Recombinant Enzyme Polymerase Amplification （RPA）in Rapid Detection of Diseases

Fan Xiaoxu，Zhao Yonggang，Li Lin，Wu Xiaodong，Wang Zhiliang
（China Animal Health and Epidemiology Center，External Disease Research Center，Qingdao，Shandong 266032）

Recombinase polymerase amplification （RPA） is a nucleic acid amplification technique developed in recent years. The test retains the highest levels of sensitivity and specificity，while adding extraordinary speed and portability. The assay generally amplified target DNA at room temperature in 10～20 minutes. It reduces the need of infrastructure and resources and is particularly suitable for rapid diagnosis in veterinary，food safety，biological defense，agriculture and other fields. The principle of RPA as well as the current application in the detection of viruses，bacteria，parasites and other pathogens were introduced，and the future use of testing in point of care and field settings were prospected.

recombinase polymerase amplification；rapid diagnosis；application

R730.43

A

1005-944X（2016）08-0072-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.08.021

潛在入侵的畜禽疫病口岸監(jiān)測技術(shù)研究（2016YFD0501104）

王志亮