孟菲菲　司君利　劉璐　崔京遠(yuǎn)　亓玉琴　呂梅

長(zhǎng)鏈非編碼RNA MEG3在胃癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

孟菲菲①司君利②劉璐③崔京遠(yuǎn)④亓玉琴①呂梅①

目的：研究長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）母系表達(dá)基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）在胃癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系，并進(jìn)一步探討MEG3與凋亡相關(guān)蛋白P53、鼠雙微基因2（murine double minute 2，MDM2）的相關(guān)性。方法：收集2012年9月至2013年6月青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院55例行手術(shù)治療的胃癌切除標(biāo)本（包括癌組織及對(duì)應(yīng)的遠(yuǎn)端正常組織），實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)胃癌組織中MEG3的表達(dá)，并分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系；應(yīng)用免疫蛋白印跡法（Western blot）檢測(cè)胃癌中P53、MDM2蛋白的表達(dá)水平，并分析其與MEG3的相關(guān)性。結(jié)果：lncRNA MEG3在胃癌組織的相對(duì)表達(dá)水平（7.98±0.19）低于所對(duì)應(yīng)的正常組織（9.47±0.18，P＜0.05）；在胃癌組織（r=-0.627，P＜0.001）及遠(yuǎn)端正常組織（r=-0.807，P＜0.001）中，P53與MDM2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；P53與MEG3的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.591，P＜0.05），MDM2與MEG3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.346，P＜0.05）；MEG3高表達(dá)者較低表達(dá)者中位生存期明顯延長(zhǎng)。結(jié)論：MEG3在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起抑癌基因的作用；MEG3與P53、MDM2在胃癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制上有重要聯(lián)系；檢測(cè)MEG3的表達(dá)水平對(duì)胃癌預(yù)后有潛在價(jià)值。

胃癌長(zhǎng)鏈非編碼RNA母系表達(dá)基因3實(shí)時(shí)熒光定量PCR

胃癌是人體最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，位居消化道惡性腫瘤之首，其死亡率占惡性腫瘤死亡率的第2位［1］。由于癥狀缺乏特異性，因此其早期診斷困難，多數(shù)患者確診時(shí)已屬中晚期，且5年生存率仍處在較低水平。因此尋找有效的早期診斷、靶向治療及預(yù)后判斷標(biāo)志物是目前研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，某些lncRNA在正常組織與相應(yīng)的腫瘤組織中的表達(dá)呈顯著性差異，特異性表達(dá)的lncRNA可作為某些惡性腫瘤的預(yù)測(cè)因子［2］。母系表達(dá)基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)有腫瘤抑制功能的lncRNA。有報(bào)道提示，MEG3在多種人類(lèi)組織中呈高表達(dá)，但在乳腺、肝、肺和前列腺等多種腫瘤細(xì)胞系表達(dá)為下降或缺失［3-5］。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)MEG3在胃癌組織及正常組織中的表達(dá)，分析其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，并進(jìn)一步采用免疫蛋白印跡法（Western blot）檢測(cè)胃癌及正常組織中P53、MDM2蛋白的表達(dá)，分析其與MEG3的相關(guān)性，旨在探索胃癌發(fā)病機(jī)制，并探討其作為胃癌靶向治療及預(yù)后判斷標(biāo)志物的可行性。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病例資料收集2012年9月至2013年6月于青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院行手術(shù)治療的胃癌切除標(biāo)本55例，標(biāo)本均經(jīng)病理科兩位以上的資深醫(yī)師證實(shí)，術(shù)前均未接受任何化療、放療或生物治療，且均進(jìn)行局部淋巴結(jié)的清掃。55例標(biāo)本均分為胃癌及配對(duì)的手術(shù)切緣正常組織（距離邊緣≥5 cm），將胃癌手術(shù)切除標(biāo)本立即置于-80℃冰箱，用于qRT-PCR逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)及Western blot檢測(cè)。隨訪時(shí)間從術(shù)后開(kāi)始截至2015年12月31日。本研究經(jīng)過(guò)被研究對(duì)象或其家屬知情同意并獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。1.1.2主要試劑和儀器cDNA合成試劑盒、PCR試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購(gòu)于美國(guó)BIOMIGA公司。P53抗體、MDM2抗體、GAPDH抗體均購(gòu)于美國(guó)AbSci公司。羊抗兔IgG購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。Light Cycler96熒光定量PCR儀購(gòu)于瑞士羅氏公司。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR取100 mg的凍存組織置于研磨器中，加入1 mL Trizol，將研磨器放置于液氮中磨成粉末狀，靜置5 min后提取總RNA。取5 μL總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)其完整性。逆轉(zhuǎn)錄按照BIOMIGA公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｒ镉缮虾Ｉど锕こ碳夹g(shù)服務(wù)有限公司合成。qRT-PCR按照美國(guó)BIOMIGA公司的SYBR GreenⅠ說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系。取cDNA進(jìn)行qRT-PCR。條件如下：95℃預(yù)變性10 min，95℃15 s，60℃1 min，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。qRT-PCR引物序列如下［6］，MEG3：F：5'-ATCATCCG TCCACCTCCTTGTCTTC-3'；R：5'-GTATGAGCATAG CAAAGGTCAG GGC-3'。GAPDH：F：5'-GAAGGTC GGAGTCAACGGATT-3'；R：5'-CGCTCCTGGAAGAT GGTGAT-3'。

1.2.2Western blot檢測(cè)取RIPA裂解液裂解組織，用勻漿器勻漿化處理，提取總蛋白，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取70 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉液封閉（4℃過(guò)夜），用P53兔多克隆抗體（1：200）、MDM2兔多克隆抗體（1：200）和GAPDH兔多克隆抗體（1：2 000）孵育，室溫?fù)u床輕搖3 h，TBST洗滌3次（10 min/次）后，再分別用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1：2 000）室溫孵育2 h，TBST洗滌3次（10 min/次），最后用化學(xué)發(fā)光顯色劑顯影并觀察結(jié)果。

1.2.3qRT-PCR結(jié)果判定△Ct=樣本Ct均值-內(nèi)參Ct均值，△△Ct=△Ct-（隨機(jī)陰性對(duì)照樣品Ct均值-該樣品內(nèi)參Ct均值），以2-△△Ct表示樣品中目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4Western blot結(jié)果判定應(yīng)用Quantity one圖像分析軟件對(duì)Western blot雜交條帶進(jìn)行密度掃描，以P53及MDM2條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值比值表示各組織中P53及MDM2表達(dá)水平（灰度值為條帶密度值及面積值的乘積）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用x±s表示，組間計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)。MEG3與P53及MDM2表達(dá)的相關(guān)性應(yīng)用Pearson進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)分析。生存分析采用Kaplan-Meier分析，組間比較采用Log rank法。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1qRT-PCR檢測(cè)MEG3表達(dá)水平及其與臨床病理特征的關(guān)系

55例患者中，胃癌組織中MEG3的表達(dá)水平（7.98±0.19）低于正常組織中的表達(dá)水平（9.47± 0.18），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)MEG3的表達(dá)水平與各臨床病理參數(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，MEG3與年齡、性別、腫瘤大小無(wú)相關(guān)性，與分化程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)（表1）。

2.2Western blot檢測(cè)P53、MDM2的表達(dá)水平及P53、MDM2相關(guān)性分析

應(yīng)用Western blot法對(duì)胃癌及遠(yuǎn)端正常組織中P53、MDM2蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)P53蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平低于正常組織，MDM2蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平高于正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01，表2，圖1）。采用Pearson對(duì)P53、MDM2蛋白的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在胃癌及遠(yuǎn)端正常組織中，兩種蛋白均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.627，P＜0.001；r=-0.807，P＜0.001，圖2）。

表1　長(zhǎng)鏈非編碼RNA MEG3的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 1　Expression and clinicopathologic factors of lncRNA MEG3 in gastric cancer

表2　P53蛋白和MDM2蛋白的表達(dá)Table 2　Expression of protein P53 and MDM2

圖1　Western b1ot檢測(cè)部分樣本GAPDH、P53、MDM2蛋白表達(dá)Figure 1　Part of the expression of proteins GAPDH，P53，and MDM2 detected by Western blot

2.3MEG3的相對(duì)表達(dá)水平與P53、MDM2的相關(guān)性分析

采用Pearson對(duì)MEG3的相對(duì)表達(dá)水平分別與P53、MDM2進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，癌組織中MEG3的相對(duì)表達(dá)水平與P53呈正相關(guān)（r=0.591，P＜0.001）；而癌組織中MEG3的相對(duì)表達(dá)水平與MDM2呈負(fù)相關(guān)（r=-0.346，P=0.020）。

2.4MEG3表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

采用Kaplan-Meier分析顯示，MEG3高表達(dá)組和低表達(dá)組的中位生存時(shí)間分別為33.7個(gè)月和25.6個(gè)月，MEG3低表達(dá)的胃癌患者的生存時(shí)間明顯低于高表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖3）。

圖2　P53和MDM2蛋白在不同胃組織中表達(dá)的相關(guān)性分析Figure 2　Correlation analysis of the expression of proteins P53 and MDM2 in different gastric tissues

圖3MEG3相關(guān)生存曲線Figure 3　MEG3-related survival curve

3　討論

隨著對(duì)人類(lèi)基因組學(xué)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)基因組序列中只有2%被翻譯成蛋白質(zhì)，而大部分被轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA［7］。根據(jù)基因序列的長(zhǎng)短，將非編碼RNA又分為小非編碼RNA和lncRNA。lncRNA是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的RNA分子的總稱(chēng)，其缺少完整的開(kāi)放閱讀框，一度被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的噪音，不具有生物學(xué)功能。近年來(lái)研究表明，lncRNA與多種疾病密切相關(guān)，如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、風(fēng)濕免疫性疾病等［7］。

MEG3定位于染色體14q32.3，長(zhǎng)約1.6 kb，是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)有腫瘤抑制功能的lncRNA。研究顯示，MEG3在腦、垂體、卵巢等多種正常組織中表達(dá)上調(diào)，但在多種腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)降低甚至缺失［7-8］。過(guò)表達(dá)MEG3能抑制腫瘤細(xì)胞系的增殖，表明其扮演著一個(gè)抑癌基因的角色。目前研究證實(shí)，其抑癌作用與p53途徑有關(guān)，Lu等［8］發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌（non small-cell lung cancer，NSCLC）組織和細(xì)胞系中，MEG3表達(dá)均下降，通過(guò)上調(diào)MEG3表達(dá)后發(fā)現(xiàn)p53基因活性增高，提示MEG3可能通過(guò)P53途徑抑制NSCLC細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡。已有報(bào)道證實(shí)，MEG3可通過(guò)多種途徑發(fā)揮抑癌作用，其機(jī)制與DNA甲基化、P53途徑、Rb途徑及影響血管生成均有關(guān)［9］。

本研究通過(guò)檢測(cè)MEG3基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在胃癌組織中的表達(dá)低于對(duì)應(yīng)正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可推測(cè)其參與胃癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程。通過(guò)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，MEG3的表達(dá)與分化程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)，分化程度越差，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TNM分期越高，MEG3的表達(dá)水平越低，而與性別、年齡、腫瘤直徑無(wú)關(guān)，提示其與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。進(jìn)一步采用Western blot法檢測(cè)胃癌及正常組織中P53及MDM2蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)P53在正常組織中的表達(dá)高于胃癌組織，而MDM2在胃癌組織中的表達(dá)相對(duì)較高，且在胃癌組織中及正常組織中，P53與MDM2的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)。對(duì)MEG3與P53及MDM2作相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)MEG3與P53呈正相關(guān)，與MDM2呈負(fù)相關(guān)。已有研究表明，P53在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。P53的泛素化主要由MDM2調(diào)節(jié)，而MEG3可以下調(diào)MDM2的表達(dá)，使P53的水平保持相對(duì)穩(wěn)定，進(jìn)而激活各種依賴(lài)P53的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，達(dá)到抑制腫瘤發(fā)生的作用［10］。因此可以推測(cè)，MEG3可通過(guò)影響MDM2、P53蛋白的表達(dá)水平來(lái)抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MEG3高水平表達(dá)者較低水平者生存時(shí)間長(zhǎng)，說(shuō)明MEG3可成為判斷預(yù)后的標(biāo)志。

綜上所述，本研究采用qRT-PCR檢測(cè)MEG3在在胃癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系，并結(jié)合臨床病理參數(shù)分析，結(jié)果表明其參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，并顯示MEG3可通過(guò)P53途徑影響細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑癌作用，且MEG3的表達(dá)水平與預(yù)后明顯相關(guān)。因此，檢測(cè)MEG3有助于胃癌的診斷及對(duì)發(fā)現(xiàn)胃癌治療新靶點(diǎn)、評(píng)估預(yù)后提供新的思路。

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（2016-05-14收稿）

（2016-06-30修回）

（編輯：孫喜佳校對(duì)：武斌）

孟菲菲專(zhuān)業(yè)方向?yàn)橄滥[瘤的診斷及治療。

E-mail：17854299805@163.com

Expression of long non-coding RNA MEG3 and its relationship with the prognosis of human gastric cancer

Feifei MENG1，Junli SI2，Lu LIU3，Jingyuan CUI4，Yuqin QI1，Mei LV1
Correspondence to：Yuqin QI；E-mail：17854299805@163.com
1Department of Gastroenterology，Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Qingdao University，Qingdao 266011，China；2Department of Emergency，Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Qingdao University，Qingdao 266011，China；3State Key Laboratory of Marine Drugs Medical College，Ocean University of China，Qingdao 266000，China；4Department of General Surgery，Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Qingdao University，Qingdao 266011，China

Objective：To investigate the expression of maternally expressed gene 3（MEG3），a long non-coding RNA gene，in gastric cancer tissues；determine the relationship of MEG3 with the prognosis of gastric cancer；and explore the relationship between MEG3 and apoptosis-associated protein P53 as well as murine double minute 2（MDM2）.Methods：Fifty-five consecutive patients with gastric cancer admitted to Qingdao Municipal Hospital for surgical treatment from September 2012 to June 2013 were included in this study. Gastric cancer and paired normal tissues were collected.The expression of MEG3 was tested through real-time quantitative polymerase chain reaction（qRT-PCR）.Western blot analysis was used to detect the expression of P53 and MDM2 in gastric cancer and evaluate their correlations with MEG3.Results：The expression of MEG3 decreased in cancer tissues（7.98±0.19）relative to the corresponding normal tissues（9.47±0.18）（P<0.05）.P53 and MDM2 showed negative relationships in the gastric cancer and normal tissues.A positive relationship was found between P53 and MEG3（r=0.591，P<0.05），whereas a negative relationship was found between MDM2 and MEG3（r=-0.346，P<0.05）.The median survival time was significantly prolonged in patients with high MEG3 expression compared with patients with low MEG3 expression.Conclusion：MEG3 exerts an inhibiting effect on the development of gastric cancer.MEG3，P53，and MDM2 may have important relationships in the biological mechanisms of gastric cancer development.Detecting the expression level of MEG3 may be useful for the prognosis of gastric cancer.

gastric cancer，long non-coding RNA，maternally expressed gene 3，real-time fluorescent quantitative reverse transcriptase PCR

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.15.565

①青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院消化科（山東省青島市266011）；②青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院急診科；③中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院海洋藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；④青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院普外科

亓玉琴17854299805@163.com