俞霞　季明芳　程偉民　黃玉玲　李付貴

EBV抗體和EBV-DNA在鼻咽癌診斷及分期的研究*

俞霞季明芳程偉民黃玉玲李付貴

目的：評估EBNA1/IgA、Zta/IgA、VCA/IgA和EBV-DNA對不同分期鼻咽癌的診斷效能，探討各指標陽性率與鼻咽癌分期的關(guān)系。方法：收集2010年3月至2015年9月中山大學附屬中山醫(yī)院收治的初診鼻咽癌患者152例，健康體檢者675例。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清EBNA1/IgA、Zta/IgA和VCA/IgA抗體ROD值，熒光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)QPCR）檢測血漿EBV-DNA水平。比較單獨和聯(lián)合應用EBV標記物對各期鼻咽癌的診斷效能，同時分析各指標陽性率與鼻咽癌分期的關(guān)系。結(jié)果：鼻咽癌患者EBNA1/IgA、Zta/IgA、VCA/IgA和EBV-DNA陽性率顯著高于健康體檢者（P＜0.01）。EBNA1/IgA在早期鼻咽癌表達相對較高，靈敏度為77.8%，而EBV-DNA在晚期鼻咽癌的靈敏度最高為88.8%，兩者特異度均在96%以上。聯(lián)合檢測中EBNA1/IgA并聯(lián)EBV-DNA檢測的靈敏度為92.1%（早期為82.5%、晚期為98.9%），特異度為96.9%。EBV-DNA陽性率與鼻咽癌臨床分期和N分期呈正相關(guān)，Zta/IgA陽性率與N分期呈正相關(guān)（P＜0.01）。結(jié)論：在無癥狀人群中進行鼻咽癌篩查，單項指標首選EBNA1/IgA。晚期患者的輔助診斷則推薦EBV-DNA。兩者并聯(lián)檢測可進一步提高鼻咽癌診斷效能。EBV-DNA是鼻咽癌分期和病情監(jiān)測的重要指標，Zta/IgA可間接反映淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，有望對患者病情評估起到參考作用。

鼻咽癌EBV抗體EBV-DNA診斷分期

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）的持續(xù)感染與鼻咽癌密切相關(guān)［1］。早在20世紀90年代末就有研究者提出利用EBV特異性IgA抗體和EBV-DNA診斷鼻咽癌的設(shè)想［2-3］。然而，有關(guān)EBV標記物在鼻咽癌診斷和分期的研究仍存有爭議，且相關(guān)研究多局限于晚期患者。本研究在鼻咽癌高發(fā)地區(qū)廣東省中山市收集大量各期鼻咽癌患者，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清EBNA1/IgA、Zta/IgA和VCA/IgA抗體ROD值，熒光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）檢測血漿EBV-DNA水平，系統(tǒng)評價上述指標在各期鼻咽癌中的診斷價值及與分期的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1研究對象

鼻咽癌組為2010年3月至2015年9月在中山大學附屬中山醫(yī)院收治的初診鼻咽癌患者152例，所有患者均經(jīng)鼻咽活檢病理確診，病理類型以未分化非角化性癌為主占98.7%（150/152）。鼻咽癌分期按2008年福州分期標準。健康對照組為在中山大學附屬中山醫(yī)院行體檢的健康人群675例。

1.2方法

1.2.1血清EBV抗體檢測檢測EBNA1/IgA、Zta/ IgA和VCA/IgA的試劑盒均由中山生物工程有限公司提供。根據(jù)ELISA試劑盒的操作規(guī)程，檢測EBV抗體ROD值，ROD≥1.000為陽性。

1.2.2 血漿EBV-DNA檢測血漿EBV-DNA的提取采用QIAmp DNA Blood Mini kit試劑盒（購自德國Qiagen公司）。FQ-PCR擴增體系所用試劑采用2×TaqMan Universal PCR Master Mix試劑盒（購自廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司）。探針和引物由中國香港TECH DRAGON LTD公司合成；采用ABI7900型FQ-PCR儀進行擴增，計算EBV拷貝數(shù)，DNA水平＞100 copies/mL為陽性，具體過程參見參考文獻［4］。

1.2.3相關(guān)定義及計算靈敏度=a/（a+b）；特異度= d/（c+d）。其中a為檢測呈陽性結(jié)果的鼻咽癌患者例數(shù)，b為呈陰性結(jié)果的鼻咽癌患者例數(shù)，c為檢測呈陽性結(jié)果的健康人群例數(shù)，d為呈陰性結(jié)果的健康人群例數(shù)。

1.3統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料用百分數(shù)表示，組間陽性率的比較采用χ2檢驗。采用ROC曲線評價各指標對鼻咽癌診斷的效能。等級資料組間相關(guān)關(guān)系應用Spearman秩相關(guān)檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1鼻咽癌組和健康對照組一般資料及臨床資料分析

鼻咽癌組152例，男女比例為2.17：1，平均年齡為（48.75±7.13）歲。健康對照組675例，男女比例為1.5 4：1，平均年齡為（44.87±7.65）歲。兩組性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義（χ2=3.228，P=0.072，P＞0.05；Z= 3.065，P=0.054，P＞0.05，表1）。

2.2鼻咽癌組和健康對照組EBV抗體和EBV-DNA陽性率比較

鼻咽癌組患者中EBNA1/IgA、Zta/IgA、VCA/IgA 和EBV-DNA陽性率分別顯著高于健康對照組的各指標陽性率（P＜0.01，表2）。

表1　兩組人群一般資料和臨床資料分析Table 1　Clinical features and characteristics at baseline of two groups

表2　兩組人群EBV相關(guān)指標陽性率的比較Table 2　Comparison of positive rates for EBV in two groups

2.3EBV標記物單項指標檢測對鼻咽癌診斷效能的比較

以鼻咽癌組和健康對照組為研究對象，采用ROC曲線（圖1）。EBV-DNA的ROC曲線下面積為0.902（95% CI為0.865～0.940）；EBNA1/IgA的ROC曲線下面積為0.879（95%CI為0.840～0.918）；Zta/IgA的ROC曲線下面積為0.773（95%CI為0.724～0.823）；VCA/IgA的ROC曲線下面積為0.682（95%CI為0.629～0.735）。單項指標檢測，EBV-DNA和EBNA1/IgA診斷鼻咽癌靈敏度約為80%，特異度在96%以上。對鼻咽癌進一步分期顯示，在早期（Ⅰ期+Ⅱ期）鼻咽癌中，EBNA1/IgA的靈敏度和特異度分別為77.8%和96.9%，診斷效能相對較高。而在晚期（Ⅲ期+Ⅳ期）鼻咽癌中，EBV-DNA的靈敏度和特異度分別為88.8%和99.6%，故單項指標檢測推薦EBV-DNA。

2.4EBV標記物聯(lián)合檢測對鼻咽癌診斷效能的比較

EBV標記物聯(lián)合檢測方案中，“串聯(lián)”規(guī)則表示聯(lián)合檢測的幾個指標同時為陽性，則定位陽性，有1個為陰性則定位陰性?！安⒙?lián)”規(guī)則表示聯(lián)合檢測的幾個指標有1個為陽性就定位陽性，全部陰性就定位陰性。在串聯(lián)各組合中，特異度均約為99.0%，但靈敏度欠佳。其中EBNA1/IgA串聯(lián)EBV-DNA，靈敏度最高為65.9%。Zta/IgA串聯(lián)EBV-DNA，靈敏度次之為50.7%。4個指標串聯(lián)檢測，靈敏度最差為20.4%。在并聯(lián)組合中，最佳方案為EBNA1/IgA并聯(lián)EBV-DNA，其靈敏度為92.1%（早期為82.5%、晚期為98.9%），特異度為96.9%。在此基礎(chǔ)上增加Zta/IgA檢測，其靈敏度進一步提高至96.1%，但特異度下降為92.9%，為鼻咽癌診斷的候選方案。4個指標并聯(lián)檢測，其特異度最差為85.8%。

2.5EBV標記物陽性率與鼻咽癌分期的關(guān)系

圖1EBNA1/IgA、Zta/IgA、VCA/IgA和EBV-DNA的ROC曲線Figure 1　The ROC curve of EBNA1/IgA，Zta/IgA，VCA/IgA，and EBV-DNA

EBNA1/IgA、Zta/IgA、VCA/IgA和EBV-DNA陽性率在各T分期間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在N分期中Zta/IgA和EBV-DNA陽性率在各期間差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），隨著N分期的升高，Zta/IgA和EBV-DNA陽性率呈上升趨勢（P＜0.01），Spearson秩相關(guān)系數(shù)分別為0.264和0.324。在鼻咽癌臨床分期中，EBV-DNA陽性率在各期間差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），隨著臨床分期的升高，EBV-DNA陽性率呈上升趨勢（P＜0.01），Spearson秩相關(guān)系數(shù)為0.468，見表3。

表3　EBV抗體和EBV-DNA陽性率與鼻咽癌分期的關(guān)系Table 3　Relationship between stages of NPC and positive rates of EBV antibodies and EBV-DNA

3　討論

EBV在鼻咽癌診斷及分期的應用研究的相關(guān)報道多局限于晚期鼻咽癌病例，而EBV標記物種類及檢測方法學不斷更新［5-7］。因此，本研究在鼻咽癌高發(fā)地區(qū)廣東省中山市收集大量各期鼻咽癌患者，選用ELISA法檢測EBV各時相表達的IgA類抗原（EBNA1、Zta和VCA），F(xiàn)Q-PCR檢測血漿EBV-DNA，系統(tǒng)評估上述指標在各期鼻咽癌中的診斷價值及與分期的關(guān)系。

本研究鼻咽癌組EBNA1/IgA、Zta/IgA、VCA/IgA 和EBV-DNA陽性率顯著高于健康對照組。其中EBV-DNA和EBNA1/IgA的ROC曲線下面積約為0.9，診斷價值較高，Zta/IgA次之，VCA/IgA最差。進一步分析顯示，不同分期鼻咽癌中各指標診斷效能不同。EBNA1/IgA在早期鼻咽癌中靈敏度最高為77.8%，而晚期鼻咽癌中EBV-DNA靈敏度最高為88.8%，兩者特異度均在96%以上。有研究報道，EBV標記物診斷鼻咽癌效能各有差異，考慮不僅與檢測方法、試劑廠家不同有關(guān)外，還與鼻咽癌分期選擇偏倚有關(guān)［8-10］。EBNA1是唯一在EBV潛伏感染和活化狀態(tài)中均表達的蛋白，在鼻咽癌癌變前即可檢測出，有望成為鼻咽癌篩查的理想指標［11-12］。而EBV-DNA在晚期鼻咽癌中敏感度很高，缺點是在Ⅰ期鼻咽癌中假陰性率較高［13-14］。本研究結(jié)論也支持上述觀點。在無癥狀人群中進行鼻咽癌篩查，單項指標檢測首選EBNA1/IgA。晚期患者的輔助診斷則推薦EBV-DNA。

EBV標記物聯(lián)合檢測方案中，最佳組合為EBNA1/IgA并聯(lián)EBV-DNA檢測。進一步提高單項指標檢測的準確性，靈敏度為92.1%（早期為82.5%、晚期為98.9%），特異度為96.9%。不僅減少臨床漏診的概率，而且控制特異度為96.9%是較理想的水平，為EBV標記物聯(lián)合檢測診斷鼻咽癌的首選方案。而在此基礎(chǔ)上增加Zta/IgA檢測，在增加診斷成本的同時，雖然靈敏度進一步提高至96.1%，但特異度下降為92.9%，為鼻咽癌診斷的候選方案。

本研究結(jié)果還顯示EBV-DNA陽性率與鼻咽癌N分期和臨床分期有關(guān)，伴隨分期的升高，EBV-DNA陽性率呈上升趨勢，這與Ji等［4］研究結(jié)論一致。說明EBV-DNA水平與鼻咽癌患者頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和體內(nèi)腫瘤負荷呈正相關(guān)。在EBV血清學檢測中，EBNA1/IgA和VCA/IgA陽性率在各分期間差異均無統(tǒng)計學意義，僅Zta/IgA陽性率與N分期呈正相關(guān)。與蔡永林等［15］研究結(jié)論不相符，而與羅耀凌等［16］報道類似。Zta/IgA表達表明EBV已被激活進入溶解性感染期，隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移范圍的擴大，抗體水平也相應增多。EBV-DNA反映體內(nèi)腫瘤負荷，可作為鼻咽癌病情監(jiān)測的重要指標。血清Zta/IgA檢測可間接反映淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，是否對鼻咽癌病情評估起到一定提示意義有待于進一步研究證實。

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（2016-04-06收稿）

（2016-07-04修回）

（編輯：孫喜佳校對：楊紅欣）

Assessment of EBV antibodies and EBV-DNA in the diagnosis and stages of nasopharyngeal carcinoma

Xia YU，Mingfang JI，Weimin CHENG，Yuling HUANG，F(xiàn)ugui LI
Correspondence to：Mingfang JI，E-mail：jmftbh@sina.com
Cancer Research Institution of Zhongshan，Zhongshan Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Zhongshan 528400，China This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（No.81572062）

Objective：To evaluate the efficacy of Epstein-Barr nuclear antigen 1/immunoglobulin A（EBNA1/IgA），BamH1 Z transactivator/ IgA（Zta/IgA），capsid antigen/IgA（VCA/IgA），and Epstein-Barr virus deoxyribonucleic acid（EBV-DNA）in detecting different stages of nasopharyngeal carcinoma（NPC）.The relationship between the EBV markers and stages of NPC was also analyzed.Methods：Blood samples of 152 untreated patients with NPC and 675 healthy subjects were collected.ELISA was used to detect the serum levels of EBNA1/ IgA，Zta/IgA，and VCA/IgA.Fluorescence quantitative PCR（FQ-PCR）was used to detect the plasma levels of EBV-DNA.ROC and correlation analyses were employed to assess the detection assays for NPC diagnosis.The positive rates of EBV markers in NPC patients in different stages were analyzed statistically.Results：The positive rates of EBNA1/IgA，Zta/IgA，VCA/IgA，and EBV-DNA in NPC patients were higher than those in the healthy individuals.The expression of EBNA1/IgA was relatively high in early NPC.The sensitivity of EBNA1/IgA was 77.8%.In advanced NPC，the level of EBV-DNA was high，and the sensitivity of EBV-DNA was 88.8%.The specificity of EBV-DNA and EBNA1/IgA could reach more than 96%.The combination of EBV-DNA and EBNA1/IgA showed the best diagnostic value，with a sensitivity of 92.1%（early stage 82.5%，advanced stage 98.9%）and a specificity of 96.9%.The positive rates of EBV-DNA were positively associated with the NPC clinic stage and N stage.The positives rates of Zta/IgA were positively associated with the NPC N stage.Conclusion：The best single index for NPC screening in an asymptomatic population is EBNA1/IgA.EBV-DNA is an ideal index for auxiliary diagnostics of advanced NPC.The combination of EBV-DNA and EBNA1/IgA shows the best diagnostic value.EBV-DNA is an important index in the stage and illness monitoring of NPC.Zta/IgA can indirectly reflect the character of lymph node metastasis，and it may be useful in assessment of NPC surveillance.

nasopharyngeal carcinoma，EBV antibody，EBV-DNA，diagnosis，stage

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.15.393

中山大學附屬中山醫(yī)院，中山市腫瘤研究所（廣東省中山市528400）

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81572062）資助

季明芳jmftbh@sina.com

俞霞專業(yè)方向為惡性腫瘤的早診早治。E-mail：houls666@163.com