曾玉梅

(梅州市食品藥品監(jiān)督檢驗所化學室，廣東 梅州　514071)

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反相高效液相色譜法測定復方肝浸膏片中維生素B1、維生素B2的含量

曾玉梅*

(梅州市食品藥品監(jiān)督檢驗所化學室，廣東 梅州514071)

目的：建立復方肝浸膏片中維生素B1、維生素B2的含量測定方法。方法：采用反相高效液相色譜法測定，色譜柱為SHIMADZU shim-packVP-ODS(250 mm×5 mm，4.6 μm)；流動相為甲醇-有機溶液(V∶V=9 ∶91)；檢測波長為266 nm；流速為1.0 ml/min。結果：維生素B1質量濃度在7.65～153.15 μg/ml范圍內、維生素B2質量濃度在2.54～50.85 μg/ml范圍內的線性關系良好，回歸方程維生素B1為Y=94.16X+10.34,r=1.000；維生素B2為Y=34.22X+29.61,r=1.000；加樣回收率符合要求。結論：該方法操作簡便、快捷、結果準確，可作為復方肝浸膏片的質量控制方法。

復方肝浸膏片； 維生素B1； 維生素B2； 含量測定

復方肝浸膏片是由肝浸膏、枸櫞酸鐵銨、維生素B1、維生素B2及干酵母制成的復方制劑，幫助身體恢復造血功能。據查目前國內有48個企業(yè)生產該品種，適用于缺鐵性貧血，營養(yǎng)性貧血，失血性貧血，孕期、哺乳期婦女貧血、兒童生長發(fā)育期貧血[1]。其每片含維生素B1200 μg、維生素B270 μg。維生素B1參與機體糖的代謝過程，維持神經、心臟及消化系統(tǒng)正常機能；維生素B2參與碳水化合物、蛋白質、核酸和脂肪的代謝可提高肌體對蛋白質的利用率，參與細胞的生長代謝，改善貧血癥狀[2]。復方肝浸膏片的國家標準[3]中，未對其中的維生素B1、維生素B2進行質量控制。為提高本品的質量標準，本研究參照相關文獻[4-11],采用反相高效液相色譜法同時測定復方肝浸膏片中的維生素B1、維生素B2的含量，所建立的方法具有良好的重現(xiàn)性和準確性，為本品中維生素B1、維生素B2的質量控制提供科學依據。

1　材料

1.1儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀及其工作站(安捷倫科技有限公司)；LC-20AT型高效液相色譜儀(含二極管陣列檢測器)、AUW220D型電子分析天平(日本島津公司)；MODEL HN1006型超聲波清潔器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；YB-3型澄明度檢查儀(天大天發(fā)科技有限公司)；DHG-9070A型電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.2試藥

維生素B1對照品(批號：100390-200703，含量為100.0%)、維生素B2對照品(批號：100369-200502，105 ℃干燥2 h后使用，含量為98.7%)均由中國藥品生物制品檢定研究院提供；復方肝浸膏片(臨汾奇林藥業(yè)有限公司，批準文號：國藥準字H14022800，批號：1312161、1305151、1304171，每片含維生素B1200 μg、維生素B270 μg)；甲醇、乙腈(天津四友精細化工有限公司，色譜純)，水為超純水，其他均為分析純。

2　方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱：SHIMADZU shim-pack VP-ODS(250 mm×5 mm，4.6 μm)；流動相：甲醇-有機溶液[甲醇-乙腈-0.02 mol/L庚烷磺酸鈉溶液(含1%三乙胺，用磷酸調節(jié)pH至5.5)(V∶V∶V=9 ∶9 ∶82)](V∶V=9 ∶91)；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。系統(tǒng)適用性中維生素B1和維生素B2分離度要符合要求。

2.2溶液的制備

2.2.1制備對照品溶液：精密稱取維生素B1對照品0.030 63 g、維生素B2對照品0.010 17 g，分別置100 ml量瓶中，加有機溶液適量，超聲處理5 min使溶解，放冷至室溫，用有機溶液稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備溶液；分別精密稱取維生素B1對照品溶液及維生素B2對照品儲備溶液5 ml置25 ml量瓶中，用有機溶液稀釋刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.2.2制備供試品溶液：精密稱取樣品3片量，置10 ml量瓶中，加有機溶液適量，超聲處理5 min使其溶解，放冷，再加有機溶液稀釋至刻度,搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3制備陰性對照溶液：按復方肝浸膏片處方及制備工藝，制備不含維生素B1、維生素B2的陰性對照樣品(即除去維生素B1、維生素B2及干酵母)，按供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

2.3系統(tǒng)適應性試驗

按“2.1及2.2”項下色譜條件，分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μl進樣，結果供試品溶液中各組分之間分離度較好(R>1.5),見圖1，陰性對照溶液色譜中無干擾峰出現(xiàn)，證明該方法專屬性強。

2.4線性關系考察

精密量取對照品儲備溶液5 ml，分別置于10、25、50、100、200 ml容量瓶中，用有機相稀釋制成含維生素B1質量濃度為153.15、61.26、30.63、15.31、7.65 μg/ml，維生素B2質量濃度為50.85、20.34、10.17、5.08、2.54 μg/ml混合對照品溶液，分別吸取10 μl注入高效液相色譜儀，測定并分別記錄峰面積。以各峰面積為縱坐標(Y)，相對應得對照品濃度為橫坐標(X)繪制標準曲線，可測得線性回歸方程為維生素B1為Y=94.16X+10.34,r=1.000；維生素B2為Y=34.22X+29.61,r=1.000。結果顯示所測目標成分具有良好的線性關系。

2.5精密度試驗

精密吸取“2.2.1對照品溶液”項下的對照品溶液10 μl，注入色譜儀中，重復進樣6次，以峰面積計算，結果測得維生素B1的RSD=0.35%，維生素B2的RSD=0.25%。

2.6穩(wěn)定性試驗

取批號為1312161的供試品溶液，分別在0、1、2、4、6、12 h內分別進樣10 μl，結果顯示維生素B1峰面積的RSD=0.72%，維生素B2峰面積的RSD=0.95%，表明本品的供試品溶液在12 h內基本穩(wěn)定不變質。

2.7破壞性試驗

精密稱取5份樣品細粉適量，分別為樣品1、2、3、4、5，樣品1加入稀鹽酸1 ml混勻，放置2 h；樣品2加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液1 ml混勻，放置30 min；樣品3加入0.3%過氧化氫溶液1 ml混勻，放置10 min，樣品4、5不加任何試劑。樣品1、2分別用等量的堿、酸中和；樣品4置于110 ℃干燥箱中放置1 h；樣品5置于1 000 lx照度下光照12 h。將所破壞性試驗樣品按“2.2.2”項下制備后分別進樣10 μl，記錄色譜圖。結果表明各降解產物與主成份峰均能完全分離，維生素B1和維生素B2的測定不受輔料和降解產物的干擾，經二級管陣列檢測器(DAD)檢測維生素B1及維生素B2的峰純度均能達到99%以上。維生素B1在酸、堿、氧化及熱破壞后峰面積均有一定的下降，維生素B2在堿、氧化及光照破壞后峰面積有一定的下降。結果表明復方肝浸膏片不耐酸堿，易氧化，避光，應在陰涼處保存。

2.8重復性試驗

精密稱取批號為1312161的復方肝浸膏片3片量，按供試品溶液制備方法操作制備樣品溶液共6份，測定峰面積并計算其含量，結果樣品中維生素B1含量為473.00 μg/g(RSD=0.75%)；維生素B2含量為94.71 μg/g(RSD=1.24%)，表明該試驗方法重現(xiàn)性較好。

A.對照品；B.供試品；C.陰性空白；1.維生素B2；2.維生素B1A.reference substance; B.test samples; C.negative blank; 1.vitamin B2; 2.vitamin B1圖1　高效液相色譜圖Fig 1　HPLC chromatogram

2.9加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的供試品(批號1312161)1.5片量，置于10 ml容量瓶中，再精密加對照品儲備溶液0.8、1.0、1.2 ml 制成含已知對照品80%、100%、120%濃度，按供試品溶液方法制備加樣回收溶液，測定并計算各個物質回收率，結果見表1。

表1　加樣回收實驗結果(n=6)

2.10檢測限與定量限

取“2.4線性關系考察”項下的已知低濃度的混合標準溶液，精密量取10 μl注入液相色譜儀，測出各標準物質較低濃度下的信噪比S/N，計算出當S/N為3時的各標準物質的濃度，以信噪比(S/N=3)時測得維生素B1及維生素B2的儀器檢出限分別為0.183 7、0.061 6 ng，以信噪比(S/N=10)時測得儀器定量限分別為0.612 6、0.205 4 ng。

2.11樣品含量測定

取臨汾奇林藥業(yè)有限公司生產的不同批號樣品3批，分別同“2.2.2”供試品溶液制備項下制備，并按上述條件測定記錄色譜圖并計算各自的含量，結果見表2。

表2　含量測定結果(n=3，%)

3　討論

早在1989年就有學者對此片劑處方配伍及其療效存有異議，認為本片劑處方設計欠合理，療效不確，建議予以淘汰[12]。直到現(xiàn)在國家藥監(jiān)局完整登記的企業(yè)有48家，并且批有國藥準字號，在市場上能滿足消費者的需求，說明該品種藥有存在的價值。

維生素B1、維生素B2對照品用有機溶液溶解，在紫外波長200～400 nm的掃描圖譜266 nm、228 nm附近都有強吸收，選擇266 nm作為檢測波長。

處方中用有機相即甲醇-乙腈-0.02 mol/L庚烷磺酸鈉溶液(含1%三乙胺，用磷酸調節(jié)pH至5.5)(V∶V∶V=9 ∶9 ∶82)作為流動相，其余系統(tǒng)適用性一致時，洗脫時間長，出峰慢導致峰形矮胖，先洗脫的維生素B2理論板數低，既浪費時間又浪費流動相，所以在有機相的基礎上添加9%甲醇作為流動相，洗脫時間短，峰形高瘦，理論板數高，效果好。

維生素B2又稱核黃素,是橙黃色結晶體,280 ℃時熔化分解,對空氣、熱、酸穩(wěn)定,對光敏感,受到光的照射時易分解,易溶于酸,在堿性溶液中受光線的照射很快轉化為光黃素，需避光操作[13-14]。

處方中含有干酵母，每克約含維生素B10.1～0.2 mg、維生素B20.4～0.6 mg，故將其干酵母去除后制備陰性溶液。在測定其含量時維生素B1僅能達到約90%，而維生素B2更低至53%，說明廠家投料不足或者在貯存過程中未注意保存方法而發(fā)生降解，本方法可促使廠家重視而改進工藝及包裝，為人們的健康保駕護航。

綜上所述，本研究的方法方便快捷、準確可信，可作為復方肝浸膏片的補充質量控制方法。

[1]趙琪鐘,盧文靜,刀兵.關于復方肝浸膏片檢驗方法的討論[J].中國醫(yī)藥指南，2012,10(7):396-397.

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[3]國家藥典委員會.國家藥品標準：化學藥品地方標準上升國家標準：第九冊[S].北京：國家食品與藥品監(jiān)督管理總局，2002：148.

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Content Determination of Vitamin B1, Vitamin B2in Compound Hepar Extractum Tablets by HPLC

ZENG Yumei

(Dept.of Chemistry, Meizhou Institute for Food and Drug Control, Guangdong Meizhou, 514071, China)

OBJECTIVE：To establish a method for the content determination of Vitamin B1, Vitamin B2in the Compound hepar extractum tablets. METHODS: HPLC method was adopted, the chromatographic column was SHIMADZU shim-packVP-ODS(250 mm×5 mm, 4.6 μm), the mobile phase was methanol-organic solution(V∶V=9 ∶91), the determine wavelength was 266 nm, with flow rate of 1.0 ml/min. RESULTS: Vitamin B1had a good linearity in the range of 7.65-153.15 μg/ml and Vitamin B2was 2.54-50.85 μg/ml. The regression equation of Vitamin B1wasY=94.16X+10.34,r=1.000, and Vitamin B2wasY=34.22X+29.61,r=1.000. The average recovery rates were accord with the requirements. CONCLUSIONS: The method is simple, fast and accurate, and can be used as the quality control method of Compound hepar extractum tablets.

Compound hepar extractum tablets; Vitamin B1; Vitamin B2; Content determination

R927.2

A

1672-2124(2016)08-1070-03

10.14009/j.issn.1672-2124.2016.08.024

2015-12-09)

*副主任藥師。研究方向：藥品質量評價與標準研究。E-mail：may011499@163.com