馮潤(rùn)東，羅世書，高　翔，崔亞寧

(陜西省食品藥品檢驗(yàn)所人事教育科，陜西 西安　710065)

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復(fù)方止血貼溶血性的研究Δ

馮潤(rùn)東*，羅世書，高翔，崔亞寧

(陜西省食品藥品檢驗(yàn)所人事教育科，陜西 西安710065)

目的：研究復(fù)方止血貼中各成分的溶血作用，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：采用家兔體外試管法，插管采集家兔頸動(dòng)脈血，經(jīng)處理后留兔血紅細(xì)胞，并加入0.9%氯化鈉溶液和蒸餾水，將各管輕輕搖勻，立即置于37 ℃的恒溫箱中進(jìn)行溫育，分別于保溫15、30、45、60、120、180 min用肉眼觀察各管溶血情況，必要時(shí)用顯微鏡觀察紅細(xì)胞是否破裂，以此判斷復(fù)方止血貼及其主要成分凝血酶、氨基己酸的溶血作用。結(jié)果：復(fù)方止血貼及其主要成分均未產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，并且經(jīng)過(guò)溶血率測(cè)定得出復(fù)方止血貼及其主要成分凝血酶和氨基己酸的溶血率均<5%。結(jié)論：復(fù)方止血貼及其主要成分在家兔體外試管實(shí)驗(yàn)中未見(jiàn)明顯溶血作用，表明其在臨床可以安全使用。

復(fù)方止血貼； 溶血； 兔

外傷引起的失血是傷殘、死亡的主要原因[1]。盡管目前醫(yī)院已有許多行之有效的止血產(chǎn)品救治受傷人員，但對(duì)入院前外傷人員的急救止血還停留在傳統(tǒng)方式上，如包扎、固定和高體位的機(jī)械性止血等[2]。目前，市場(chǎng)上多采用明膠海綿等材料，這些材料在親水性、止血效果等方面仍有待改進(jìn)。為提高一線救治率、減少出血量[3]，英代生物科技有限公司研制了復(fù)方止血貼，擬申報(bào)國(guó)家一類新藥，其是由凝血酶、氨基己酸2種成分組成的復(fù)方制劑，其凝血和止血作用顯著，有很好的臨床應(yīng)用前景，但對(duì)其是否存在溶血方面的不良反應(yīng)還未有研究。本研究旨在探討復(fù)方止血貼的溶血作用，為開展進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料

1.1儀器

5804R型離心機(jī)(德國(guó)艾本德公司)；UV-721型紫外分光光度計(jì)(上海優(yōu)尼科公司)。

1.2藥品與試劑

復(fù)方止血貼(英代生物科技有限公司，批號(hào)：130309)；PVF海綿(英佳麥迪克醫(yī)用材料有限公司，批號(hào)：130420)；手術(shù)吸收性止血海綿(天和藥業(yè)生物科技有限公司，批號(hào)：20120602)；凝血酶(上海生化藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1110011)；氨基己酸(常州制藥公司，批號(hào)：120209)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭大白兔，雌雄兼用，體質(zhì)量約2 kg，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，陜動(dòng)證字08-018號(hào)，實(shí)驗(yàn)在溫度18～26 ℃中完成。

2　方法

2.1藥物濃度

復(fù)方止血貼中的藥物含量：貼片每片50 cm2，每片含凝血酶304 IU、氨基己酸3.04 g。假設(shè)敷片能被機(jī)體全部吸收，人體全身血液按5 L計(jì)算，則溶血實(shí)驗(yàn)所用濃度=每片所含藥物量/5 L，故本研究中復(fù)方止血貼組藥物含量為凝血酶61 IU/L、氨基已酸0.61 g/L。

2.2家兔體外溶血實(shí)驗(yàn)

于家兔頸動(dòng)脈插管取血約40 ml置于錐形瓶中，用玻璃珠攪拌去除纖維蛋白后移取10份1 ml移入10支10 ml刻度離心管中[5]，各加入0.9%氯化鈉溶液9 ml，混勻后1 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，去除上清液，沉淀的紅細(xì)胞再用0.9%氯化鈉溶液按上述方法洗滌3次，至上清液不顯紅色[4-5]。將10支試管所得紅細(xì)胞合并，并用0.9%氯化鈉溶液稀釋成體積比為2%的混懸液，備用。取潔凈試管21支，分為復(fù)方止血貼組、凝血酶組、氨基己酸組各7支，3組試藥分別為復(fù)方止血貼、凝血酶、氨基己酸。每組編號(hào)：1～5號(hào)管為供試品管，6號(hào)管為陰性對(duì)照管，7號(hào)管為陽(yáng)性對(duì)照管。依次加入2%紅細(xì)胞混懸液、試藥、0.9%氯化鈉溶液和蒸餾水，見(jiàn)表1。將各管輕輕搖勻，立即置于37 ℃的恒溫箱中進(jìn)行溫育，分別于保溫15、30、45、60、120、180 min后肉眼觀察各管溶血情況，必要時(shí)用顯微鏡觀察紅細(xì)胞是否破裂，以標(biāo)準(zhǔn)判斷紅細(xì)胞溶血、凝集程度：溶液澄明紅色(粉紅色混懸液)、管底無(wú)細(xì)胞殘留為全溶血；溶液澄明紅色或棕色(粉紅色混懸液)、管底有少量紅細(xì)胞殘留為部分溶血；紅細(xì)胞全部下沉、上層液體無(wú)色澄明(純?nèi)榘咨伙@紅色混懸液)為無(wú)溶血；紅細(xì)胞凝聚成塊、振搖后不能分散為凝集。

表1　體外溶血試驗(yàn)加樣表

注：“—”表示未加入試藥

Note：“—” stands for no use of the reagent

3　結(jié)果

3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果

蒸餾水對(duì)照管在15 min即全部溶血，其余各管在30、60、120、180 min均無(wú)溶血現(xiàn)象發(fā)生。

3.2溶血率測(cè)定

將“2.2”項(xiàng)下7支試管的液體置入離心管中，1 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，結(jié)果顯示：7號(hào)管管底無(wú)細(xì)胞殘留，全管溶液澄明紅色；1～6管紅細(xì)胞全部下沉，上層液體為無(wú)色透明液體。取各管上清溶液在UV-721型紫外分光光度計(jì)上545 nm處，以蒸餾水為空白讀取各管光密度(OD)[6-7]。溶血率計(jì)算公式如下：溶血率(%)=(ODnc-ODt)/(ODnc-ODpc)×100%(式中，ODt：試驗(yàn)管吸光度；ODnc：陰性對(duì)照管吸光度；ODpc：陽(yáng)性對(duì)照管吸光度)，溶血率>5%表示出現(xiàn)了溶血[8]。結(jié)果顯示，1～6號(hào)試管溶血率均<5%，表明復(fù)方止血貼均無(wú)溶血，見(jiàn)表2。

表2　復(fù)方止血貼各組分對(duì)溶血作用相互影響測(cè)定的OD值

4　討論

本研究采用家兔體外溶血實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，復(fù)方止血貼及其各組分均未發(fā)現(xiàn)存在溶血作用，且溶血率均<5%，驗(yàn)證了復(fù)方止血貼是安全可靠的，此研究為復(fù)方止血貼的臨床應(yīng)用和不良反應(yīng)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

近些年，國(guó)內(nèi)外對(duì)于新型止血產(chǎn)品的研究正在成為新的熱點(diǎn)[9]。復(fù)方止血貼主要成分是凝血酶和氨基己酸。凝血酶作為凝血因子Ⅱa，可不需經(jīng)過(guò)血液凝固的第一、二階段而直接作用于纖維蛋白原，使之轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，進(jìn)而使血液快速凝固、填塞出血點(diǎn)而達(dá)到止血的目的[10-11]。凝血酶的止血速度快、療效確切，主要用于臨床各科發(fā)生的毛細(xì)血管、小血管及實(shí)質(zhì)性臟器出血[12]。復(fù)方止血貼的應(yīng)用對(duì)臨床止血方法的創(chuàng)新起到了促進(jìn)作用，對(duì)提高臨床一線救治率具有積極意義。

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Study on Hemolysis of Compound Hemostatic StickΔ

FENG Rundong, LUO Shishu, GAO Xiang, CUI Yaning

(Dept.of Personnel and Education, Shaanxi Institute for Food and Drug Control, Shaanxi Xi’an 710065, China)

OBJECTIVE：To study the hemolytic effects of compound hemostatic stick, so as to provide experimental basis for the clinical application. METHODS: Vitro test tube method on rabbit was adopted, carotid arterial blood of rabbit was collected by intubation, after processing the rabbit red blood cells was collected to add 0.9% sodium chloride solution and distilled water. After gently shake, the tubes were put into the thermostat at temperature of 37 ℃.The hemolysis was observed respectively after 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 120 min and 180 min; the rupture of blood cells can be observed by microscope when necessary, and the hemolytic effects of compound hemostatic stick and its main components as thrombin and aminocaproic acid were judged. RESULTS: After study, compound hemostatic stick and its main components would not induce hemolysis phenomenon, and through the determination of hemolysis rate, compound hemostatic stick and its main components as thrombin and aminocaproic acid hemolysis rate were below 5%. CONCLUSIONS: There are no obvious hemolysis in compound hemostatic stick and its main components in rabbits in vitro test tube experiments, which shows that its role in hemolysis is safe in clinic.

Compound hemostatic stick; Hemolysis; Rabbit

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程項(xiàng)目(No.2014FWPT-01)

R944.2

A

1672-2124(2016)08-1021-02

10.14009/j.issn.1672-2124.2016.08.004

2016-01-13)

*主管藥師。研究方向：藥理學(xué)。E-mail：fengdong83@163.com