汪難喜，翟學(xué)佳，朱超然，陳　芬，張新林，呂永寧

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，湖北 武漢　430022)

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·論著·

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法測定人血漿中頭孢地尼的濃度及生物等效性研究

汪難喜*，翟學(xué)佳，朱超然，陳芬，張新林，呂永寧#

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，湖北 武漢430022)

目的：建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatography-tandem mass spectrum，LC-MS/MS)測定人血漿中頭孢地尼的濃度，評價(jià)健康人餐后服用2種頭孢地尼顆粒的生物等效性。方法：24例男性健康志愿者餐后隨機(jī)交叉單劑量口服頭孢地尼顆粒受試制劑或參比制劑，LC-MS/MS法測定頭孢地尼體內(nèi)血藥濃度。采用藥動學(xué)軟件DAS對其藥動學(xué)參數(shù)及等效性進(jìn)行計(jì)算和評價(jià)。結(jié)果：頭孢地尼在10.14～1 267.50 ng/ml質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好(r>0.999)，最低下限為10.14 ng/ml；日內(nèi)、日間精密度RSD分別≤1.78%、3.75%。受試制劑和參比制劑的主要藥動學(xué)參數(shù)包括: 藥-時(shí)曲線下面積(AUC)0～t分別為(4 284.81±1 150.02) 和(4 479.97±1 333.70) μg·h/L，AUC0～∞分別為(4 425.56±1 173.44) 和(4 632.83±1 369.83) μg·h/L，半衰期分別為(1.81±0.25)和(1.83±0.26) h，達(dá)峰時(shí)間分別為(3.70±0.71)和(3.73±0.51) h，峰濃度分別為(814.67±250.92)和(870.80±281.99) ng/ml。結(jié)論：該方法分析快速、靈敏、準(zhǔn)確，適用于人血漿中頭孢地尼濃度的測定，可成功用于頭孢地尼顆粒生物等效性的評價(jià)。

頭孢地尼顆粒； 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用； 生物等效性； 藥動學(xué)

頭孢地尼具有抗菌譜廣、不良反應(yīng)少的特點(diǎn)，臨床上廣泛用于上、下呼吸道感染和泌尿道感染的治療[1-3]。其對各種細(xì)菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，對革蘭陽性菌中的葡萄球菌屬、鏈球菌屬等的抗菌活性比第1、2代口服頭孢菌素更強(qiáng)[4-5]。近年來，國內(nèi)外對頭孢地尼血漿濃度的測量方法有高效液相色譜-紫外分光光度法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatography-tandem mass spectrum,LC-MS/MS)等[6-11]，但都存在一定的局限性，如樣本處理過程復(fù)雜[7]、采用比較昂貴的固相萃取法[8]或檢測時(shí)間長[9-10]等。本研究建立了快速、靈敏、準(zhǔn)確的LC-MS/MS法測定頭孢地尼血漿濃度，并應(yīng)用于受試和參比制劑頭孢地尼顆粒在健康人體餐后的藥動學(xué)和生物等效性研究，以期為臨床用藥提供參考。

1　材料

1.1儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀，含在線脫氣機(jī)(G1322A)、高壓四元泵(G1311A)、自動進(jìn)樣器(G1329A)、柱溫箱(G1316A)；API 4000 型四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國ABI公司)，配備電噴霧離子化源(ESI)；色譜工作站: Analyst 1.6.1；AUW220D型天平(日本島津公司)。

1.2藥品與試劑

受試制劑：頭孢地尼顆粒(批號：311130108，規(guī)格：50 mg/袋) 由石家莊華新藥業(yè)有限責(zé)任公司提供；參比制劑：頭孢地尼顆粒(批號：025310；規(guī)格：100 mg/袋)購自日本藤澤公司；頭孢地尼標(biāo)準(zhǔn)對照品(批號：130502-201403，含量為98%)、頭孢克洛標(biāo)準(zhǔn)對照品(批號: 130481-200503，含量為93.2%) 由中國食品藥品檢定研究院提供。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

分析柱：Waters AtlantisTMdC18柱 (2.1 mm×150 mm，5 μm)，預(yù)柱:Phenomenex C18保護(hù)柱(4 mm×3.0 mm，5 μm)；流動相 ∶甲醇-0.3%甲酸水溶液(V∶V=38 ∶62)；洗脫方式：等度洗脫；流速: 0.3 ml/min；進(jìn)樣量: 10 μl；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣器溫度：4 ℃。

質(zhì)譜采用正離子電噴霧離子源，以多反應(yīng)監(jiān)測方式進(jìn)行定量分析。離子噴射電壓：5 500 V；溫度：550 ℃；源內(nèi)氣體1壓力：344.75 kPa；氣體2壓力：344.75 kPa；氣簾氣壓力：172.37 kPa；碰撞氣壓力：41.37 kPa；掃描方式為質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測；頭孢地尼和內(nèi)標(biāo)頭孢克洛在正離子模式下定量分析離子對分別為：396.2→227.1和368.1→174.2，解簇電壓分別為60 和69 V，碰撞能量分別為19和18 V，離子掃描質(zhì)譜圖見圖1。

圖1　頭孢地尼(A)與內(nèi)標(biāo)頭孢克洛(B)的二級全掃描質(zhì)譜圖Fig 1　Representative product ion scan spectra of cefdinir (A) and cefaclor (B) in positive ionization mode

2.2對照品溶液的配制

2.2.1頭孢地尼儲備液:精密稱定頭孢地尼對照品9.75 mg，置于10 ml容量瓶中，用10 mmol/L的乙酸銨溶液溶解并定容，得到975 μg/ml頭孢地尼的儲備液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫褂脮r(shí)進(jìn)一步稀釋至濃度適當(dāng)?shù)墓ぷ饕骸?/p>

2.2.2頭孢克洛(內(nèi)標(biāo))儲備液：精密稱定頭孢克洛對照品，加10 mmol/L的乙酸銨溶液溶解并稀釋至刻度，制備成132 μg/ml的頭孢克洛儲備液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫褂脮r(shí)用10 mmol/L的乙酸銨溶液稀釋成5 280 ng/ml的內(nèi)標(biāo)工作液。

2.3血漿樣品的處理

精密吸取血漿200 μl，加入內(nèi)標(biāo)工作液20 μl(頭孢克洛，5 280 ng/ml)，加入10 mmol/L的乙酸銨溶液20 μl，渦旋30 s混勻，再加入500 μl甲醇沉淀蛋白，渦旋1 min，14 800 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，取上清液用等量10 mmol/L的乙酸銨溶液溶稀釋，渦旋30 s混勻、14 800 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上清進(jìn)行分析，并記錄色譜圖。

2.4專屬性試驗(yàn)

分別取6批空白血漿、血漿加對照品、服藥后的血漿樣品，按照“2.3項(xiàng)”下操作，在“2.1項(xiàng)”的條件下，頭孢地尼與內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為2.6、2.8 min，見圖2。血漿中內(nèi)源性物質(zhì)均不干擾樣品峰，方法專屬性良好。

2.5基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率

取空白血漿樣品200 μl，加入10 mmol/L的乙酸銨溶液20 μl，加入500 μl甲醇沉淀蛋白，渦旋1 min，14 800 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，取上清加入頭孢地尼低、高質(zhì)控溶液(濃度分別為：30、1 000 ng/ml)及內(nèi)標(biāo)溶液20 μl，渦旋30 s，取上清液用10 mmol/L的乙酸銨溶液等量稀釋，混勻、離心，取上清液進(jìn)樣分析。所得的峰面積與以200 μl的10 mmol/L乙酸銨溶液代替空白血漿同法處理后的峰面積進(jìn)行比較，以評價(jià)方法的基質(zhì)效應(yīng)。低、高2個濃度頭孢地尼血漿樣本中的基質(zhì)效應(yīng)為(67.20±5.82)%和(53.37±7.9)%，內(nèi)標(biāo)頭孢克洛的基質(zhì)效應(yīng)為(69.95±11.25)%。經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化后，低、高2個濃度基質(zhì)效應(yīng)因子RSD為6.88 %和5.27 % (n=6)，均不超過15%。配制成頭孢地尼濃度各為30、300、1 000 ng/ml低、中、高3個質(zhì)量濃度的血漿樣品各6份。按照“2.3項(xiàng)”下操作，進(jìn)樣測定，所得的峰面積與經(jīng)過處理后血漿上清再加入同量的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液比較，以評價(jià)方法的提取回收率。低、中、高3個質(zhì)量濃度血漿樣本中頭孢地尼的提取回收率分別為(93.79±2.57)%，(77.38±4.91)% 和(81.46±4.82)%；RSD分別為2.17%、4.22%、3.22%。同法測得內(nèi)標(biāo)提取回收率為(80.86 ±1.63)%，RSD為3.24%。

2.6線性范圍和定量限

取空白血漿200 μl，依次加入頭孢地尼系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μl，配制成相當(dāng)于頭孢地尼質(zhì)量濃度為10.14、50.70、126.75、253.50、430.95、887.25、1 267.50 ng/ml的血漿樣品。按照“2.3項(xiàng)”下操作，處理血漿樣品，記錄色譜圖；以待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(f)為縱坐標(biāo)，待測物濃度(C)為橫坐標(biāo)，用加權(quán)(W=1/x2) 最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=0.004 84X+0.029 6(r=0.999 2)，線性范圍為10.14～1 267.50 ng/ml，以信噪比為10 確定定量限，該方法的定量限為10.14 ng/ml。

A.空白血漿；B.空白血漿+頭孢地尼及內(nèi)標(biāo)；C.受試者口服頭孢地尼顆粒100 mg 后3.5 h 的血漿樣本 Ⅰ.頭孢地尼；Ⅱ.頭孢克洛A. Blank plasma sample; B. Blank plasma sample+cefdinir; C. Plasma sample from the volunteer 3.5 h after administration of 200 mg of cefdinir; Ⅰ.Cefdinir; Ⅱ. Cefaclor圖2　頭孢地尼與內(nèi)標(biāo)頭孢克洛的典型色譜圖Fig 2　Typical chromatograms of cefdinir and cefaclor

2.7精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)

按照“2.3項(xiàng)”下操作，處理定量下限、低、中、高4個質(zhì)量濃度的血漿模擬樣本，每一濃度平行測定6份，連續(xù)測定6 d。根據(jù)同一分析批的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算質(zhì)控樣本的測定濃度，分析日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度，見表1。批內(nèi)、批間RSD均<15%，RE均在(±15%)的范圍內(nèi)。

2.8殘留效應(yīng)

測定定量上限樣本之后, 隨后測定1個空白血漿樣本和1個定量下限樣本，平行3次，來考察方法的殘留效應(yīng)。頭孢地尼和內(nèi)標(biāo)的殘留效應(yīng)因子分別為10.7%和0%，滿足分析要求。

2.9穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別考察低、高2個質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品在不同條件下血漿樣本的穩(wěn)定性。結(jié)果表明含頭孢地尼的血漿樣品在上述條件穩(wěn)定性良好，見表2。

表1　血漿中頭孢地尼的精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表2　各種條件下低、高濃度頭孢地尼穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3　生物等效性研究

3.1受試者的選擇

24名中國健康男性受試者，平均年齡(23.54±2.26)歲，平均身高(173.00±6.06)cm，平均體質(zhì)量(67.00±4.78)kg，平均體質(zhì)量指數(shù)(22.39±1.17)kg/m2。試驗(yàn)前進(jìn)行病史詢問和體格檢查，血常規(guī)、尿常規(guī)、肝腎功能及心電圖檢查等結(jié)果均正常。試驗(yàn)前2周及試驗(yàn)期間未服用任何藥物，試驗(yàn)期間禁煙酒或含咖啡因的飲料。試驗(yàn)前皆在了解本研究的目的、意義、步驟、利益和可能發(fā)生的損害后簽署知情同意書。本試驗(yàn)方案通過華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查。

3.2血藥濃度測定和等效性評價(jià)

本試驗(yàn)采用雙周期自身交叉對照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，24名受試者隨機(jī)分為2組，每組每次試驗(yàn)餐后單次口服受試制劑或參比制劑，2次試驗(yàn)間的清洗期為1周。受試者于前1 d入住，晚餐統(tǒng)一清淡飲食，禁食10 h、不禁水過夜。次日早晨攝入標(biāo)準(zhǔn)早餐(饅頭約100 g、稀飯約150 ml、菜籽油約20 ml、烹飪的豬肉75 g、煎蛋1枚及蔬菜100 g)；餐后30 min，用250 ml溫開水送服口服受試制劑或參比制劑(100 mg)。于服藥后1.0、2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、10.0和12.0 h各取血1次，每次約4 ml，置于含乙二胺四醋酸的抗凝管中，30 min內(nèi)14 800 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，分離血漿，置于-80 ℃冰箱備用。

采用DAS 3.2.7軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)算餐后單次口服頭孢地尼受試制劑和參比制劑的主要藥動學(xué)參數(shù)(見表3、圖3)。對受試制劑和參比制劑的平均藥動學(xué)參數(shù)峰濃度(Cmax)、藥-時(shí)曲線下面積(AUC)0～t、AUC0～∞經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析，并采用雙向單側(cè)t檢驗(yàn)及[1-2α]%置信區(qū)間法進(jìn)行生物等效性評價(jià)，其中達(dá)峰時(shí)間(Tmax)采用非參數(shù)法(Wilcoxon符號秩檢驗(yàn))檢驗(yàn)法。結(jié)果表明：Cmax、AUC0～t、AUC0-∞均拒絕生物不等效假設(shè)；對受試制劑，經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后的Cmax、AUC0～t、AUC0～∞的90%置信區(qū)間分別為79.8%～110.4%、85.1%～109.8%、85.3%～109.4%，受試制劑與參比制劑的Tmax經(jīng)非參數(shù)法檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明餐后口服受試制劑和參比制劑具有生物等效性。

參數(shù)測試值參考值半衰期(t1/2)/h1.81±0.251.83±0.26tmax/h3.70±0.713.73±0.51Cmax/(μg/L)814.67±250.92870.80±281.99AUC0～t/(μg·h/L)4284.81±1150.024479.97±1333.70AUC0～∞/(μg·h/L)4425.56±1173.444632.83±1369.83

圖3　24例健康受試者口服參比制劑和受試制劑后血漿頭孢地尼平均血藥濃度-時(shí)間曲線Fig 3　Mean plasma concentration-time profiles of oral test or reference preparation in 24 male volunteers

4　討論

本研究根據(jù)等效性研究與生物樣品處理的指導(dǎo)原則[12]，建立了測定人血漿頭孢地尼濃頭度的LC-MS/MS法。該法分析時(shí)間短(<3.5 min)，靈敏度高，定量下限達(dá)到10 ng/ml，且專屬性強(qiáng)，適合于頭孢地尼人體藥動學(xué)與生物等效性等研究中生物樣品的分析測定。在血漿樣本的處理方面，比較了液-液萃取法與蛋白沉淀法，發(fā)現(xiàn)蛋白沉淀法處理血漿樣品，方法簡單、快速、成本低，且回收率更好。同時(shí)，乙酸銨溶液能提高頭孢地尼的檢測靈敏度，將用甲醇沉淀后上清液與10 mmol/L的乙酸銨溶液等體積稀釋進(jìn)樣時(shí)，靈敏度大大提高。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，流動相中加入適量的甲酸有助于改善色譜峰的脫尾現(xiàn)象。

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LC-MS/MS Method for Determination of Cefdinir in Human Plasma and the Bioequivalence Study

WANG Nanxi, ZHAI Xuejia, ZHU Chaoran, CHEN Fen, ZHANG Xinlin, Lü Yongning

(Dept.of Pharmacy, Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology, Hubei Wuhan 430022, China)

OBJECTIVE：To establish a liquid chromatography-tandem mass spectrum(LC-MS/MS) method for deter-mination of cefdinir in human plasma, and to evaluate the bioequivalence after taking cefdinir granules in healthy volunteers. METHODS: A single dose of cefdinir granules of test or reference preparation were administered orally in 24 healthy male volunteers according to the randomized, two-way cross-over study. LC-MS/MS was adopted to determine the cefdinir concentration in human plasma. And the pharmacokinetic parameters and bioequivalence were calculated and evaluated with use of DAS software. RESULTS: The calibration curve was linear over the concentration ranges of 10.14-1 267.50 ng/ml(r>0.999), with the lower limit of quantitation (LLOQ) 10.14 ng/mL.RSDof within-day and between-day were lower than 1.78% and 3.75%. The main pharmacokinetic parameters of test and reference preparations were as follows:AUC0-t(4 284.81±1 150.02) μg·h/L and (4 479.97±1 333.70) μg·h/L,AUC0-∞(4 425.56±1 173.44) μg·h/L and (4 632.83±1 369.83) μg·h/L,t1/2(1.81±0.25) h and (1.83±0.26) h,tmax(3.70±0.71) h and (3.73±0.51) h,Cmax(814.67±250.92) ng/ml and (870.80±281.99) ng/ml.CONCLUSIONS: The method is rapid, sensitive and accurate for the determination of cefdinir in human plasma, which had been successfully applied in the bioequivalence study of cefdinir granules in healthy volunteers.

Cefdinir granules; LC-MS/MS; Bioequivalence; Pharmacokinetics

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81473287)

主任藥師。研究方向：藥動學(xué)及藥物相互作用研究。E-mail：luyn_union@163.com

R978.1；R969.1

A

1672-2124(2016)08-1014-04

10.14009/j.issn.1672-2124.2016.08.002

2016-07-12)

*碩士研究生。研究方向：藥動學(xué)及藥物相互作用研究。E-mail：wangnx_union@163.com