孫艷艷，陳 蕾，吳希雯，丁 倩

(蘇州科技大學(xué) 化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215009)

科研與開(kāi)發(fā)

含雙膦酸基團(tuán)的鉑配合物的設(shè)計(jì)合成及抗腫瘤活性研究

孫艷艷，陳 蕾，吳希雯，丁 倩

(蘇州科技大學(xué) 化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215009)

設(shè)計(jì)并合成一系列含雙膦酸基團(tuán)的乙二胺衍生物及其鉑配合物，通過(guò)核磁、質(zhì)譜及元素分析對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，并通過(guò)CCK-8法測(cè)定其對(duì)卵巢癌及骨肉瘤細(xì)胞系的體外抗腫瘤活性，篩選出高活性的典型化合物，為后期研究奠定基礎(chǔ)。

鉑配合物；雙膦酸；抗腫瘤

1978年美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的順鉑是臨床上用于治療睪丸癌及卵巢癌的首選化療藥物，并且對(duì)骨肉瘤、子宮頸癌、乳腺癌等實(shí)體瘤有明顯療效[1]。然而，由于順鉑的水溶性差、腫瘤選擇性低等特點(diǎn)導(dǎo)致其在臨床上的應(yīng)用受到很大的限制包括具有嚴(yán)重的毒副作用及耐藥性[2]。因此研究開(kāi)發(fā)具有腫瘤靶向性的高效低毒的新型鉑類(lèi)抗腫瘤藥物至關(guān)重要，從而降低化療藥物的毒副作用，提高腫瘤選擇性。將具有骨靶向性的功能性基團(tuán)引入到鉑配合物中是一種有效的研究策略。雙膦酸基團(tuán)是一種具有骨靶向性的典型基團(tuán)，已有文獻(xiàn)報(bào)道其對(duì)骨質(zhì)磷灰石具有較高的親和性，從而顯示出對(duì)骨質(zhì)及相關(guān)骨組織的高度靶向性[3]。許多含有雙膦酸基團(tuán)的藥物對(duì)骨質(zhì)疏松癥、骨髓瘤、高血鈣癥以及 Paget癥顯示出較好的療效[4]。早在1990年，Keppler課題組設(shè)計(jì)一類(lèi)含有膦酸基團(tuán)的鉑配合物，針對(duì)轉(zhuǎn)移骨肉瘤顯示較高的體外及體內(nèi)細(xì)胞毒活性[5]。Natile課題組將雙膦酸引入到鉑配合物的離去基團(tuán)中并發(fā)現(xiàn)不同于順鉑的作用機(jī)理[6]。Bose團(tuán)隊(duì)研究開(kāi)發(fā)的鉑-焦磷酸配合物對(duì)卵巢癌顯示出非DNA共價(jià)結(jié)合的作用機(jī)制[7]。國(guó)內(nèi)的研究者也取得了一些進(jìn)展，包括南京大學(xué)的郭子建教授和廣西師范大學(xué)的梁宏教授，分別設(shè)計(jì)并合成以含有雙膦酸或單膦酸基團(tuán)的吡啶衍生物為載體配基的鉑配合物，并顯示對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞較高的毒活性[8-9]。

本文設(shè)計(jì)并合成以含有N,N'-二雙膦酸基的乙二胺衍生物為載體配基的鉑配合物，并對(duì)其體外抗腫瘤活性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。這種含有對(duì)稱性的兩個(gè)雙膦酸基團(tuán)的鉑配合物目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)中所有化學(xué)試劑均為分析純，氯亞鉑酸鉀采購(gòu)于昆明鉑銳金屬材料有限公司。制備鉑配合物時(shí)需避光通氮?dú)獗Ｗo(hù)。生物測(cè)試中的細(xì)胞株培養(yǎng)基均用RPMI-1640。CCK-8試劑盒采購(gòu)于碧云天。

核磁共振儀(Bruker Avance III HD 400 MHz)，液質(zhì)聯(lián)用儀(Agilent 6230 Accurate-Mass TOF LC/MS)，元素分析儀Vario EL (Elementar)。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 配體及鉑配合物的制備及表征

配體的制備：中間體M1的制備參考Hoechst前期研究工作[10]。1 mol的M1溶解在6 mol的85%亞磷酸和500 mL氯苯中，加熱至100 ℃，逐滴滴加4 mol三氯化磷，攪拌1 h產(chǎn)生大量黃色沉淀，不需攪拌加熱5 h，輕輕倒出氯苯，將剩余物減壓蒸餾除去溶劑，加入1000 mL水，加熱回流1 h，再加入活性炭攪拌10 min，過(guò)濾，減壓濃縮得到粗產(chǎn)物，用水-丙酮重結(jié)晶得到白色固體的化合物L(fēng)1，產(chǎn)率25%?；衔風(fēng)2和L3的制備方法如上所示,見(jiàn)圖1。

化合物 L1：白色固體(產(chǎn)率25%)。1H NMR (d6-DMSO):δ 2.59～2.82 (m, 8H, CH2),5.64～5.68 (m, 2H, NH),6.50 (s, 2H, COH),11.95 (s, 8H, POH) ppm;31P NMR (d6-DMSO):17.42 ppm;HRMS:m/z [M-H]-calcd. for C6H19N2O14P4:466.97867, found:466.97778; Anal. calcd for C6H20N2O14P4:C15.39, H 4.31,N 5.98,found:C 15.33, H 4.35, N 5.94。

化合物L(fēng)2：白色固體(產(chǎn)率31%)。1H NMR (d6-DMSO): δ 1.78 (t, 4H, CCH2), 2.61～2.85 (m, 8H, NCH2), 5.63～5.67 (m, 2H, NH), 6.46 (s, 2H, COH), 11.90 (s, 8H, POH) ppm;31P NMR (d6-DMSO): 17.44 ppm; HRMS: m/z [M-H]-calcd. for C8H23N2O14P4:495.00997, found: 495.00915. Anal. calcd for C8H24N2O14P4:C 19.37, H 4.88, N 5.65, found: C 19.32, H 4.85, N 5.70。

化合物 L3：淺黃色固體(產(chǎn)率40%)。1H NMR (d6-DMSO): δ 1.65～1.85 (m, 8H, CCH2CH2), 2.65～2.87 (m, 8H, NCH2), 5.60～5.64 (m, 2H, NH), 6.48 (s, 2H, COH), 11.92 (s, 8H, POH) ppm;31P NMR (d6-DMSO): 17.45 ppm; HRMS: m/z [M-H]-calcd. for C10H27N2O14P4:523.04127, found: 524.04285. Anal. calcd for C10H28N2O14P4:C 22.91, H 5.38, N 5.34, found: C 22.97, H 5.35, N 5.30。

配合物的制備：化合物L(fēng)1-L3 (2 mmol)溶解在60 mL氯仿中，加入K2PtCl4(0.83 g, 2 mmol)，室溫下攪拌反應(yīng)20 h，避光通氮?dú)獗Ｗo(hù)。過(guò)濾得黃色澄清溶液，減壓濃縮至少量溶劑，4 ℃冷卻過(guò)夜，析出黃色固體，過(guò)濾，干燥，得配合物1-3，產(chǎn)率62%～76%。

配合物1：黃色固體 (1.10 g, 65%)。1H NMR (d6-DMSO): δ 2.40～2.65 (m, 8H, CH2), 4.74～4.79 (m, 2H, NH), 5.90 (s, 2H, COH), 11.74 (s, 8H, POH) ppm;31P NMR (d6-DMSO): 21.60 ppm; HRMS: m/z [M-Cl]+calcd. for C6H20N2O14P4ClPt: 697.92013, found: 697.921645. Anal. calcd for C6H20N2O14P4Cl2Pt: C 9.82, H 2.75, N 3.82, Pt 26.57, found: C 9.90, H 2.71, N 3.85, Pt 26.50。

配合物2：黃色固體 (1.25 g, 72%)。1H NMR (d6-DMSO): δ 1.65 (t, 4H, CCH2), 2.44～2.70 (m, 8H, NCH2), 4.60～4.65 (m, 2H, NH), 5.86 (s, 2H, COH), 11.70 (s, 8H, POH) ppm;31P NMR (d6-DMSO): 21.55 ppm; HRMS: m/z[M-Cl]+calcd. for C8H24N2O14P4ClPt: 725.95143, found: 725.95198. Anal. calcd for C8H24N2O14P4Cl2Pt: C 12.61, H 3.17, N 3.68, Pt 25.60, found: C 12.68, H 3.15, N 3.65, Pt 25.67。

配合物3：黃色固體 (1.23 g, 68%)。1H NMR (d6-DMSO): δ 1.57～1.76 (m, 8H, CCH2CH2), 2.38～2.64 (m, 8H, NCH2), 4.70～4.76 (m, 2H, NH), 5.88 (s, 2H, COH), 11.73 (s, 8H, POH) ppm;31P NMR (d6-DMSO): 21.40 ppm; HRMS: m/z [M-Cl]+calcd. for C10H28N2O14P4ClPt:753.98273, found: 753.98304. Anal. calcd for C10H28N2O14P4Cl2Pt: C 15.20, H 3.57, N 3.55, Pt 24.69, found: C 15.26, H 3.52, N 3.58, Pt 24.60。

1.2.2 體外活性測(cè)試

通過(guò)CCK-8法對(duì)配體L1-L3及配合物1-3的體外抗腫瘤活性進(jìn)行測(cè)試。將96孔板每孔放置4000細(xì)胞/孔，37 ℃，5% CO2條件下無(wú)菌培養(yǎng)24 h。所以待測(cè)化合物預(yù)溶于超純水中，再用培養(yǎng)基溶解至所需濃度。將藥物溶液加入96孔板中，37 ℃，5% CO2條件下無(wú)菌培養(yǎng)48 h，加入10 μLCCK-8溶液，孵育4 h。450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定水溶性甲瓚的吸光度，并計(jì)算細(xì)胞存活率，將存活率(%)與化合物濃度(μM)作圖，得到IC50值。

圖1 配體L1-L3的合成

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的合成與表征

以乙二胺與氯乙酸為原料，氫氧化鋁為縛酸劑制備中間體M1，并以亞磷酸和三氯化磷為磷酸化試劑對(duì)中間體M1進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，得到配體L1，其他配體制備如上所述(圖1)。以配體L1-L3與K2PtCl4為原料制備最終產(chǎn)物1-3(圖2)。所有化合物均通過(guò)核磁共振氫譜、磷譜、元素分析及高分辨質(zhì)譜進(jìn)行表征，譜圖數(shù)據(jù)均與結(jié)構(gòu)一致。

圖2 配合物1-3的合成2.2 體外細(xì)胞毒活性

通過(guò)CCK-8法對(duì)配體L1-L3、配合物1-3及陽(yáng)性對(duì)照順鉑和唑來(lái)膦酸進(jìn)行卵巢癌SKOV3及骨肉瘤細(xì)胞系MG-63的體外細(xì)胞毒活性測(cè)試，結(jié)果如表1所示。從表中的IC50值可知,鉑配合物1-3的細(xì)胞毒活性比雙膦酸配體L1-L3(IC50 = 10.21-32.91 μM)整體較高，說(shuō)明雙膦酸基團(tuán)和鉑單元共同發(fā)揮抗腫瘤協(xié)同作用。對(duì)SKOV3細(xì)胞系而言，配合物2的活性(IC50 = 12.70 μM)與陽(yáng)性對(duì)照順鉑相當(dāng)，且是唑來(lái)膦酸活性的兩倍；針對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞系，配合物2的活性(IC50 = 10.21 μM)與陽(yáng)性對(duì)照順鉑、唑來(lái)膦酸相當(dāng)。由此可見(jiàn)，配合物2顯示出對(duì)兩種細(xì)胞系較高的細(xì)胞毒活性，是一種潛在的高效抗腫瘤試劑，為下一步體內(nèi)活性測(cè)試提供依據(jù)。

表1 配體及配合物的IC50值

3 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)并合成了一系列含對(duì)稱的雙膦酸取代基的乙二胺配體及其鉑配合物，研究所有化合物對(duì)卵巢癌及骨肉瘤兩種細(xì)胞系的細(xì)胞毒活性。通過(guò)IC50值結(jié)果可知，鉑配合物比雙磷酸配體具有更高的體外抗腫瘤活性，表明雙膦酸基團(tuán)與鉑單元發(fā)揮抗腫瘤協(xié)同作用，并從所有化合物中篩選出具備較高細(xì)胞毒活性的典型化合物2，為后續(xù)體內(nèi)活性研究提供理論依據(jù)。

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(本文文獻(xiàn)格式：孫艷艷，陳 蕾，吳希雯，等.含雙膦酸基團(tuán)的鉑配合物的設(shè)計(jì)合成及抗腫瘤活性研究[J].山東化工，2016，45(24)：1-2，5.)

Synthesis and Antitumor Activity of Platinum-based Complexes with Bisphosphonate Groups

Sun Yanyan,Chen Lei, Wu Xiwen, Ding Qian

(School of Chemistry Biology and Material Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China)

A series of ethylenediamine derivatives containing bifunctional bisphosphonate substituents and their corresponding dichloroplatinum(II) complexes have been synthesized and characterized by elemental analysis,1H NMR,31P NMR, and HRMS spectra. All the compounds were tested for their in vitro cytotoxicity by CCK-8 assay against SKOV3 and MG-63. It can be found that representative complex 2 with high cytotoxicity has been screened as a potential antitumor agent for subsequent in vivo study.

platinum(II) complexes; bisphosphonate; antitumor

2016-10-31

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(21401137)，江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510332057X)

孫艷艷(1985—)，女，講師，主要研究方向：藥物化學(xué)。

R943；0641.4

A

1008-021X(2016)24-0001-02