李翠平,李愛玲,王振坤

(天方藥業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463000)

去甲金霉素添加金屬離子工藝研究

李翠平,李愛玲,王振坤

(天方藥業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463000)

以金色鏈霉菌發(fā)酵制備去甲金霉素，在發(fā)酵過程中在不同時(shí)間添加不同濃度、不同種類的金屬離子，通過搖瓶實(shí)驗(yàn)、小試實(shí)驗(yàn)選出了能提高去甲金霉素發(fā)酵生產(chǎn)的金屬離子。通過12m3發(fā)酵罐的連續(xù)5批驗(yàn)證在48h添加0.02%的Co2+，使去甲金霉素發(fā)酵水平提高120.52%。

去甲金霉素；發(fā)酵；金屬離子

在1957年由McCormick首先報(bào)導(dǎo)的去甲金霉素[1](Demethylchlortetracycline),又稱地美環(huán)素、去甲氯四環(huán)素,其是一種四環(huán)類抗生素。金色鏈霉菌(Streptmyces sureofaciens)染色體上的閱讀框CTC09在受抑制的情況下,即可產(chǎn)生去甲金霉素[2]。去甲基金霉素作為四環(huán)類抗生素，其抗菌譜與金霉素及四環(huán)素相似，其作用比四環(huán)素、土霉素強(qiáng)，臨床用于肺炎、尿路感染及小兒猩紅熱等，它可以作為醫(yī)藥原料，也可以作為合成米諾環(huán)素和替加環(huán)素的中間體。因此，在制藥工業(yè)中，生產(chǎn)去甲金霉素具有良好的發(fā)展前途。

國(guó)內(nèi)單純對(duì)去甲基金霉素的研究并不多[3-4]；國(guó)外主要是關(guān)于四環(huán)類抗生素分子及代謝方面的研究[5-7]，去甲基金霉素的合成總共需要8個(gè)丙二酰CoA的參與，丙二酸在去甲基金霉素的生物合成中起著至關(guān)主要的作用[8]。根據(jù)文獻(xiàn)[9]，丙二酰CoA的合成可由乙酰CoA通過羧化反應(yīng)生成，隨著乙酰CoA羧化酶活性降低，合成的丙二酰CoA也會(huì)降低。李友元[10]等報(bào)道某些金屬離子可以不同程度的激活酰基輔酶。本實(shí)驗(yàn)就是通過搖瓶實(shí)驗(yàn)、小試試驗(yàn)、中試試驗(yàn)考察不同金屬離子、不同添加濃度、不同添加時(shí)間對(duì)去甲金霉素發(fā)酵水平的影響，從而找到提高去甲金霉素發(fā)酵水平所需添加的金屬離子。

1 儀器與材料

1.1 儀器

15升、50升、100升智能發(fā)酵罐、12m3發(fā)酵罐、超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，搖床，顯微鏡，離心機(jī)，電子天平，1200型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)等。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

菌種：金色鏈霉菌(Streptomyces aureus)為原始出發(fā)菌(天方藥業(yè)有限公司提供)。 斜面培養(yǎng)基/g·L-1[8]：葡萄糖 10.0，牛肉膏 2.0，L- 門冬酰胺0.25，無水磷酸二氫鉀 0.4，瓊脂 20 ；pH值 6.8 ～ 7.0。

搖瓶種子培養(yǎng)基/g·L-1[8]：玉米淀粉 30，黃豆粉 30，蛋白胨 5，酵母粉 2，硫酸銨 2，碳酸鈣 10，無水磷酸二氫鉀 1.5，豆油 16 mL/L ；pH 自然。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基/g·L-1[8]：玉米淀粉 80，ɑ-淀粉酶 0.1%，黃豆粉 30，L- 賴氨酸鹽 8，氯化鈉 4，硫酸銨 3，碳酸鈣 10，玉米漿 4，豆油 12 mL/L ；pH 自然。

稀料配方/g·L-1：玉米淀粉 100，ɑ-淀粉酶 0.1，L- 賴氨酸鹽 7，豆油 30mL/L，碳酸鈣 30；pH自然。

上述培養(yǎng)基均于121 ℃滅菌30 min。

2 方法與結(jié)果

2.1 培養(yǎng)方法

2.1.1 斜面培養(yǎng)

將菌種由沙土管接種到斜面培養(yǎng)基上,27±1℃培養(yǎng)14～16天,至斜面孢子變?yōu)榘咨?濕度控制在40%～50%。

2.1.2 搖瓶種子培養(yǎng)

在250mL搖瓶中加入30mL種子培養(yǎng)基,將培養(yǎng)基在121±1℃滅菌30min,然后將斜面孢子挑塊至種子培養(yǎng)基中,27±1℃ , 210r/min搖床振蕩培養(yǎng)46～48h,濕度控制在40%～50%。

2.1.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

在250mL搖瓶中加入30mL發(fā)酵培養(yǎng)基,將培養(yǎng)基在121±1℃滅菌30min,然后按10%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中, 27±1℃,210r/min搖床振蕩培養(yǎng)7d, 濕度控制在40%～50%。

2.1.4 種子培養(yǎng)

2.1.4.1 一級(jí)種子培養(yǎng)

將種子培養(yǎng)基在121±1℃滅菌30min,然后按0.02%的接種量接種至一級(jí)種子培養(yǎng)基中, 27±1℃,培養(yǎng)46～48h

2.1.4.2 二級(jí)種子培養(yǎng)

將種子培養(yǎng)基在121±1℃滅菌30min,然后按10%的接種量接種至二級(jí)種子培養(yǎng)基中, 27±1℃,培養(yǎng)27～30h

2.1.5 發(fā)酵培養(yǎng)

將發(fā)酵培養(yǎng)基在121±1℃滅菌30min,然后按5～10%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中, 27±1℃,培養(yǎng)9d。

2.2 HPLC測(cè)定去甲金霉素效價(jià)

色譜條件色譜柱C18 4.6×150mm 5μm粒徑填料流速：1.0mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm,溫度：30℃,流動(dòng)相：V(乙腈)：V(1%磷酸液)=20：80,進(jìn)樣量：20μL。

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 搖瓶實(shí)驗(yàn)：

2.3.1.1 在搖瓶發(fā)酵初期中分別加入Fe2+、Cu2+、Mg2+、Co2+等無機(jī)離子，每組結(jié)果為3只搖瓶的平均效價(jià)，得到的以對(duì)照為100.00的相對(duì)效價(jià)結(jié)果見表1：

表1

從以上結(jié)果可以看出添加Co2+及Fe2+可以提高去甲金霉素效價(jià)，其中添加0.02%的Co2+及添加0.015%的Fe2+提高較多，接著的搖瓶實(shí)驗(yàn)是對(duì)添加0.02%的Co2+及添加0.015%的Fe2+的添加時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

2.3.1.2 在搖瓶發(fā)酵不同時(shí)期中分別加入0.015%Fe2+、0.02%Co2+無機(jī)離子，每組結(jié)果為3只搖瓶的平均效價(jià)，得到的以對(duì)照為100.00的相對(duì)效價(jià)結(jié)果見表2：

表2

從以上結(jié)果可以看出添加Co2+及Fe2+可以提高去甲金霉素效價(jià)，其中在搖瓶發(fā)酵48h添加最好，接著在100升智能發(fā)酵罐中對(duì)添加0.02%的Co2+及添加0.015%的Fe2+的添加時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

2.3.2 小試

小試在100L智能發(fā)酵罐中進(jìn)行，由于去甲金霉素發(fā)酵過程中溶解氧在16～30h處于低谷pH也較低，菌絲濃度偏低，菌種處于快速生長(zhǎng)階段，在36～54h溶解氧和pH已回升至正常水平，菌絲濃度達(dá)到相對(duì)較高濃度，菌體進(jìn)入抗生素的合成期，所以選擇實(shí)驗(yàn)分別在36h、42h、48h、54h添加0.015%Fe2+、0.02%Co2+，實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基配方及工藝控制參數(shù)均按正常發(fā)酵工藝控制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3：

表3

從以上結(jié)果可以看出48h添加Co2+最好。去甲金霉素效價(jià)比對(duì)照提高19.48%，42h添加Fe2+也可以提高去甲金霉素的效價(jià)，比對(duì)照提高9.47%。接著在12m3發(fā)酵罐對(duì)Co2+進(jìn)行中試驗(yàn)證

2.3.3 中試驗(yàn)證

在12m3發(fā)酵罐上連續(xù)進(jìn)行5批進(jìn)行批量驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果見表4：

表4

3 討論

本研究通過搖瓶、小試、中試對(duì)多種金屬離子進(jìn)行篩選，通過對(duì)添加金屬離子的濃度及添加時(shí)間的驗(yàn)證，選出了能提高去甲金霉素發(fā)酵效價(jià)的Co2+，通過添加Co2+可以使去甲金霉素發(fā)酵水平提高120.52%，發(fā)酵水平大幅提高，可以大幅降低生產(chǎn)成本，將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益及社會(huì)效益。

[1] 趙 謹(jǐn),于淑秋,伍志春.中性磷類萃取去甲金霉素規(guī)律的研究.化工冶金[J],1992,13(2):145-150.

[2] 俞文和主編.新編抗生素工藝學(xué).北京:中國(guó)建材工業(yè)出版社,1996年.

[3] 賀筱蓉;李永泉 原生質(zhì)體誘變選育去甲基金霉素高產(chǎn)菌.杭州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)[J].1997，24(2):170-177.

[4] 賀筱蓉;李永泉;李鈞敏 去甲基金霉素發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究，化學(xué)反應(yīng)工程與工藝[J]. 1997，24(2)：170-177.

[5] Erban V，Novotná J，Běhal V，et al.Growth rate，sugar consumption，chlortetracycline production and anhydrotetracycline oxygenase activity in Streptomyces aureofaciens[J]. Folia Microbiological,1983,28(4):262-267.

[6] Vaněk Z,Cudlín J,Blumauerová M,et al.How many genes are required for the synthesis of chlortetracycline[J]. Folia Microbiological,1971,16(3):225-240.

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[8] 李士杭，葉蕊芳，呂和平,等.去甲基金霉素發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化及機(jī)制分析[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,2012, 43(11).896-901.

[9] 儲(chǔ) 炬;李友榮，等.現(xiàn)代工業(yè)發(fā)酵調(diào)控學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002年.

[10] 李友元，陳長(zhǎng)華，李永東等 ?；っ负王；鵆oA對(duì)螺旋霉素合成的影響[J].華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2001,27(3)：251.

(本文文獻(xiàn)格式：李翠平,李愛玲,王振坤.去甲金霉素添加金屬離子工藝研究[J].山東化工，2016，45(12)：36-37,42.)

Technique Research of Metal Ions on Demethylchlortetracycline

Li Cuiping,Li Ailing,Wang Zhenkun

(Topfond Pharmaceutical Co., Ltd., Zhumadian 463000)

Demethylchlortetracycline was prepared from Streptomyces aureus. The metal ions was selected which could improve production level of Demethylchlortetracycline by adding different metal ions with different concentrations at different periods on flask-shaking and lab-scale fermentation tests. By five continuous tests in 12m3fermentation tank, proved that the production level of Demethylchlortetracycline could be improved to 120.52% by added 0.02% Co2+at 48h of the fermentation process.

demethylchlortetracycline; fermentation; metal ions

2016-04-19

李翠平(1969—)，女，河南息縣人，工程師，主要從事生物化工研究。

TQ465

A

1008-021X(2016)12-0036-02