葛 凱左瑞華周夢(mèng)雪　董雅婷張雅廷程楠楠

（1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽六安　237012；2.皖西學(xué)院健康養(yǎng)殖與動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)預(yù)警工程技術(shù)中心，安徽六安　237012）

中草藥對(duì)產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎病豬分離菌體外抑菌試驗(yàn)

葛 凱1，2左瑞華1，2周夢(mèng)雪1董雅婷1張雅廷1程楠楠1

（1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽六安237012；2.皖西學(xué)院健康養(yǎng)殖與動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)預(yù)警工程技術(shù)中心，安徽六安237012）

選擇患有產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎的母豬，采集子宮分泌物，分離出兩種菌株：大腸桿菌和鏈球菌。選擇五味子等15種中草藥，應(yīng)用水提醇沉法制成質(zhì)量濃度為1g/mL中草藥提取液，分別應(yīng)用牛津杯法進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)；采用試管兩倍稀釋法測(cè)定了中草藥的最小抑菌濃度。結(jié)果顯示，15種中草藥中，五味子提取物對(duì)兩種細(xì)菌的抑菌效果較好，其強(qiáng)度均在中等以上，其余的中草藥抑菌效果不明顯；五味子對(duì)鏈球菌的最小抑菌濃度是15.65mg/m，對(duì)大腸桿菌是7.8mg/ml。通過(guò)此項(xiàng)研究，對(duì)中草藥五味子的開(kāi)發(fā)利用研究提供參考。

豬；產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎；大腸桿菌；鏈球菌；五味子

1 材料與方法

1.1病料采集和細(xì)菌分離

對(duì)某養(yǎng)豬場(chǎng)患有產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎病豬應(yīng)用輸精管采集子宮分泌物，注入滅菌的離心管中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用接種環(huán)蘸取備用的病料，均勻劃線涂抹在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24h。仔細(xì)觀察菌落，挑選數(shù)量較多、形態(tài)一致的菌落，轉(zhuǎn)接到另外一個(gè)培養(yǎng)基上，繼續(xù)37℃恒溫培養(yǎng)24h，即得到純化的菌種，取純化的單一菌落涂片，經(jīng)革蘭氏染色鑒定方法，進(jìn)行細(xì)菌初步鑒定。

1.2中草藥提取物

根據(jù)文獻(xiàn)資料，選擇15種中草藥：五味子、黃柏、金銀花、柴胡、蒲公英、大黃、連翹、苦參、黃苓、紅花、益母草、魚(yú)腥草、鐵皮石斛、丹參、大青葉，均購(gòu)自中藥材市場(chǎng)。

應(yīng)用水提醇沉法工藝制備中草藥提取液，取中草藥各100g，放在干凈的大燒杯中，加適量體積水浸泡24h，放在可調(diào)電爐上大火蒸煮，煮沸后，改為小火慢熬2h后，待冷卻后用干凈的雙層紗布過(guò)濾，收集濾液。將藥渣再次按前述方法制備濾液，將2次濾液合并，將濾液減壓濃縮至所需體積，按1：4的體積比加入無(wú)水乙醇，常溫靜置12h，真空抽濾去除沉淀，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮成100mL，獲得質(zhì)量濃度為1g/mL的中草藥提取液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3中草藥提取物體外抑菌試驗(yàn)

設(shè)置2個(gè)西藥對(duì)照組：環(huán)丙沙星和頭孢曲松；15個(gè)中草藥組：五味子、黃柏、金銀花、柴胡、蒲公英、大黃、連翹、苦參、黃苓、紅花、益母草、魚(yú)腥草、鐵皮石斛、丹參、大青葉。

西藥組用藥敏紙片法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)；中草藥組用牛津杯法：將純化的菌種均勻涂在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中。然后將培養(yǎng)基在底部劃分幾個(gè)均勻間隔區(qū)域并標(biāo)記，將牛津杯按區(qū)域放置（注意牛津杯放置時(shí)要輕輕地按壓一下，防止藥液滲出），再分別注入先前準(zhǔn)備好的中藥提取液均為200μl。最后，與西藥組共同置放在37℃恒溫培養(yǎng)24h，培養(yǎng)后用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。此項(xiàng)試驗(yàn)每種藥物設(shè)3個(gè)重復(fù)，取3次試驗(yàn)的平均值。

抑菌效果判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)抑菌圈直徑大小判定如下：

抑菌圈：>20mm，記為：++++，抑菌效果：強(qiáng)；

抑菌圈：15-20mm，記為：+++，抑菌效果：較強(qiáng)；

抑菌圈：10-15mm，記為：++，抑菌效果：中；

抑菌圈：5-10mm，記為：+，抑菌效果：差；

抑菌圈：＜5mm，記為：-，抑菌效果：無(wú)效。

1.4中草藥提取物最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

1.4.1菌液的制備

將分離純化的病菌，接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24h。挑取單一菌落，再接種于1%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24h。用高壓滅菌生理鹽水進(jìn)行稀釋，制成含菌落數(shù)量為105～106個(gè)/ml的菌懸液。

1.4.2最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定步驟

采用試管兩倍稀釋法測(cè)定MIC值，取10支大小一致試管順序編號(hào)：1～10號(hào)。每管均裝入5ml肉湯液體培養(yǎng)基，1號(hào)管中加入中草藥提取液5mL，渦旋混勻后吸取5ml轉(zhuǎn)移至2號(hào)管，以此類推，至8號(hào)管吸取5ml棄去，9號(hào)管為陽(yáng)性對(duì)照，10號(hào)管為陰性對(duì)照。1～8號(hào)管的中草藥提取液濃度分別為500，250，125，62.5，31.25，15.65，7.8，3.9mg/ml，然后于1～8號(hào)管中分別接入菌懸液20μl，37℃恒溫培養(yǎng)24h。轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，37℃，24h。最后觀察，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最小中藥濃度即為最小抑菌濃度（MIC）。

1.5數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS19.0分析軟件對(duì)中草藥的抑菌效果進(jìn)行方差分析，然后對(duì)均值進(jìn)行多重比較，結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎病豬分離菌

本次試驗(yàn)中，分離出多種細(xì)菌，其中菌落數(shù)量較多，最具優(yōu)勢(shì)的菌種是鏈球菌和大腸桿菌，因此選用這兩種菌作為本次試驗(yàn)菌。有的學(xué)者對(duì)從患有子宮內(nèi)膜炎病豬體內(nèi)分離獲得主要致病菌有葡萄球菌、綠膿桿菌等［7］，本次實(shí)驗(yàn)沒(méi)有分離到綠膿桿菌，葡萄球菌很少。

2.2中草藥提取物的抑菌效果

15種中草藥提取液分別做了抑菌試驗(yàn)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，五味子的抑菌效果非常明顯，與西藥效果相當(dāng)。其它14種中草藥抑菌效果不明顯或者沒(méi)有效果，此處不再列出。見(jiàn)表1 、表2。

水提醇沉法制備工藝獲得中草藥提取物是一種混合物，五味子的有效成分可能適合這種提取方法，而有的中草藥可能沒(méi)有提出有效成分。隨著現(xiàn)代中藥制劑工藝發(fā)展，有學(xué)者采用醇提或有機(jī)溶劑萃取法，得到更加單一的成分，有利于中藥制劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。同一種中草藥對(duì)不同細(xì)菌抑制效果也不一致，已有不少學(xué)者做了大量的研究報(bào)道，本試驗(yàn)中五味子對(duì)兩種細(xì)菌的抑制效果不完全一樣，也表現(xiàn)出這個(gè)特點(diǎn)。

表1　五味子對(duì)鏈球菌的抑制效果

表2　五味子對(duì)大腸桿菌的抑制效果

2.3五味子最小抑菌濃度（MIC）

抑菌效果不明顯的中草藥提取液此項(xiàng)試驗(yàn)省略。五味子對(duì)兩種分離菌的MIC值測(cè)定結(jié)果如表3所示。鏈球菌是15.65mg/ml，大腸桿菌是7.8mg/ml，五味子體外抑制大腸桿菌的強(qiáng)度明顯大于鏈球菌。此項(xiàng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所分離的細(xì)菌種類不同，所需要的五味子最小抑菌濃度也是不一樣。有學(xué)者對(duì)五味子的有效抑菌濃度做了各方面的研究，五味子提取物對(duì)鏈球菌和大腸桿菌的MIC值有一定的差別，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果較一致。

五味子因富含多糖等多種化學(xué)成分，具有保肝益腎等功能，近年來(lái)成研究熱點(diǎn)，五味子的提取物能夠有效抑制豬源大腸桿菌和鏈球菌的生長(zhǎng)，可能與五味子中具有多種抗菌成分有關(guān)。

表3　五味子抑制病原菌MlC值

3 小結(jié)

本項(xiàng)研究從眾多的中草藥中，發(fā)現(xiàn)五味子提取物能有效抑制產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎病豬的主要分離菌：大腸桿菌和鏈球菌，而且抑制效果與抗生素相當(dāng)。五味子的最小抑菌濃度分別是：鏈球菌是15.65mg/ml，大腸桿菌是7.8mg/ml。為了進(jìn)一步弄清楚五味子的抗菌活性成分，下一步將對(duì)五味子主要有效成分進(jìn)行分離提純并詳細(xì)分析鑒定，為中草藥制劑的精制和開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

［1］葉健毅，趙學(xué)峰，陶家樹(shù)，等.母豬子宮內(nèi)膜炎致病菌藥敏試驗(yàn)及臨床治療［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（12）：172-176.

［2］李淑紅，王京仁，成鋼，等.8種中草藥對(duì)豬大腸桿菌的體外抑菌試驗(yàn)［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，（22）：131 -135.

［3］張霞，艾啟俊，孫寶忠，等.中草藥提取物對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌效果研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，（1）：88-90.

皖西學(xué)院動(dòng)物科學(xué)專業(yè)校企合作實(shí)踐教學(xué)基地項(xiàng)目（2016WXXY30）。

葛凱（1977—），男，安徽壽縣人，碩士，講師，研究方向：中獸醫(yī)藥的研究與教學(xué)。