段慧榮，王鎖民（蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730020）

鹽地堿蓬高親和性K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Ss HAK2的克隆與表達(dá)模式分析

段慧榮，王鎖民*
（蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730020）

鹽地堿蓬在高鹽生境中可以有效吸收K+，并維持細(xì)胞內(nèi)K+濃度的相對(duì)穩(wěn)定。高親和性K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白KT/ HAK/KUP家族成員在植物K+吸收過程中發(fā)揮重要作用。本研究從鹽地堿蓬中克隆到一個(gè)KT/HAK/KUP家族成員HAK 2的同源基因Ss HAK 2，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式分析。Ss HAK2編碼788個(gè)氨基酸，與不同植物的HAK2類蛋白具有較高的同源性（80%～92%）。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，Ss HAK2屬于KT/HAK/ KUP家族亞族Ⅱ成員，與擬南芥At KUP2位于同一進(jìn)化分枝。實(shí)時(shí)定量qPCR分析顯示，Ss HAK2在鹽地堿蓬的根和葉中均有高豐度表達(dá)，且葉中的表達(dá)豐度顯著高于根中。Ss HAK 2的表達(dá)受外界不同濃度K+（2.5和0.01 mmol/L）的誘導(dǎo)。2.5 mmol/L K+處理下，根和葉中Ss HAK 2的表達(dá)受25 mmol/L NaCl的顯著誘導(dǎo)；0.01 mmol/L K+處理下，25和150 mmol/L NaCl的添加抑制根中Ss HAK 2的表達(dá)，卻顯著促進(jìn)其在葉中的表達(dá)。以上研究結(jié)果表明，Ss HAK2可能參與鹽地堿蓬K+吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)過程，在根和葉中發(fā)揮不同的功能。

鹽地堿蓬；Ss HAK2；克?。槐磉_(dá)分析

http：//cyxb.lzu.edu.cn

段慧榮，王鎖民.鹽地堿蓬高親和性K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Ss H AK 2的克隆與表達(dá)模式分析.草業(yè)學(xué)報(bào)，2016，25（2）：114-123.

DUAN Hui-Rong，WANG Suo-Min.Cloning and expression analysis of a high-affinity K+transporter gene Ss HAK 2 in Suaedasalsa.Acta Prataculturae Sinica，2016，25（2）：114-123.

K+是植物中含量最為豐富的陽離子，也是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，占植物總干重的2%～10%［1］。作為重要的無機(jī)滲透調(diào)節(jié)劑和酶促劑，K+在細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)、膨壓維持、細(xì)胞伸長(zhǎng)、氣孔運(yùn)動(dòng)、氮代謝、脂肪代謝、蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞膜的極化等過程中均發(fā)揮著重要作用［2］。土壤鹽堿化是引起植物體內(nèi)K+虧缺現(xiàn)象的主要非生物因素之一，土壤中高濃度的Na+會(huì)限制植物體內(nèi)K+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，使植物生長(zhǎng)受抑，甚至死亡［3］。鹽生植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成了多種有效機(jī)制來抵御鹽脅迫［4-6］，例如維持細(xì)胞內(nèi)K+濃度的穩(wěn)定。

鹽地堿蓬（Suaeda salsa）又名蓬子菜、鹽蒿，是藜科堿蓬屬一年生多汁草本鹽生植物，生于鹽漬化土壤、湖濱、河岸和沿海地帶［7］。鹽地堿蓬的幼嫩莖葉營(yíng)養(yǎng)豐富，是很好的綠色蔬菜，也可用作動(dòng)物飼料，其種子中富含不飽和脂肪酸和亞油酸等，可壓榨食用油，具有很好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值；鹽地堿蓬在鹽堿地的改良、污染地的植被修復(fù)和有毒金屬的吸附方面效果顯著，具有很好的生態(tài)價(jià)值［8］。鹽地堿蓬可在400 mmol/L的鹽濃度下完成其生活史，是典型的鹽堿地指示植物，它通過將根部吸收的大量Na+運(yùn)輸至地上部并區(qū)域化進(jìn)液泡以減輕Na+毒害，也是極具代表性的積鹽型植物［9］。Mori等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，鹽地堿蓬K+、Na+選擇性吸收能力（SAk）隨外界NaCl濃度（5～50 mmol/L）的增加顯著提高，且植株體內(nèi)K+吸收速率和K+濃度能維持相對(duì)穩(wěn)定?？梢姡行誎+并維持體內(nèi)K+濃度的相對(duì)穩(wěn)定可能是鹽地堿蓬適應(yīng)高鹽生境的重要策略之一。

大量研究表明，KT/HAK/KUP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、HKT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和Shaker K+通道主要參與植物根系K+吸收過程［11］。Shao等［12］研究發(fā)現(xiàn)，鹽地堿蓬HKT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員Ss HKT1；1參與根系K+吸收過程，在鹽脅迫下維持植株體內(nèi)K+營(yíng)養(yǎng)穩(wěn)態(tài)，從而提高植物耐鹽性。此外，Duan等［13］克隆并鑒定了鹽地堿蓬Shaker K+通道成員Ss AKT1，推測(cè)其可能參與鹽地堿蓬根中的K+吸收過程，并在耐鹽性中發(fā)揮重要作用?？梢姡}地堿蓬體內(nèi)存在多基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的K+吸收途徑，然而，KT/HAK/KUP家族成員的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。

植物KT/HAK/KUP家族蛋白具有高親和轉(zhuǎn)運(yùn)K+的特性，與細(xì)菌中的K+吸收透性酶KUP及真菌中的高親和性K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HAKs的同源性極高，最早從大麥（Hordeum vulgare）中克隆到了該家族成員Hv HAK1［14］。在植物中，KT/HAK/KUP家族成員能夠恢復(fù)酵母或細(xì)菌K+吸收缺陷突變體的K+吸收，在植物根和地上部K+穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用［15］。此外，亦有研究表明，KT/HAK/KUP家族部分成員可以介導(dǎo)Na+從土壤進(jìn)入植物根部［16-17］。Wang等［16］的研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥根中僅存在At HKT1；1和At HAK5兩條主要的低親和性Na+吸收途徑，且當(dāng)At HKT1；1功能喪失后，At HAK5成為唯一主要的低親和性Na+吸收途徑，并且在低K+條件下，其作用更為重要。Zhang等［17］對(duì)海濱堿蓬（Suaeda maritima）的研究發(fā)現(xiàn)，KT/HAK/KUP家族可能參與95～200 mmol/L Na+條件下的植株根系低親和性Na+吸收過程?？梢姡琄T/HAK/KUP家族成員在植物K+、Na+吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)過程中可能發(fā)揮重要作用。

本研究以鹽地堿蓬為材料，克隆KT/HAK/KUP家族成員基因Ss HAK 2的cDNA全長(zhǎng)并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用實(shí)時(shí)定量qPCR的方法分析Ss HAK 2在不同濃度K+（0.01和2.5 mmol/L）和NaCl（25和150 mmol/L）處理下的表達(dá)模式，以期為進(jìn)一步研究Ss HAK2的功能提供分子基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料培養(yǎng)

2013年3月，挑選籽粒飽滿無缺損的鹽地堿蓬種子，用蒸餾水沖洗2～3遍，在直徑9 cm的培養(yǎng)皿上鋪濾紙潤(rùn)濕后播種于其上，種子密度約為4粒/cm2，28℃下催芽，待發(fā)芽后，挑選均勻一致的幼苗移至裝有滅菌紅沙的塑料穴盤（5 cm×5 cm×5 cm）中，4株/穴，在溫室中澆灌調(diào)整后的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行植物材料培養(yǎng)。調(diào)整后的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液（p H=5.7）包括2 mmol/L KNO3，0.5 mmol/L KH2PO4，0.5 mmol/L MgSO4·7H2O，0.25 mmol/L Ca（NO3）2·4 H2O，1.25 mmol/L CaCl2·2H2O，0.06 mmol/L Fe-citrate，50μmol/L H3BO3，10 μmol/L MnCl2·4H2O，1.6μmol/L ZnSO4·7H2O，0.6μmol/L CuSO4·5H2O，0.05μmol/L Na2Mo O4· 2H2O。溫室的晝夜溫度為（28±2）℃/（23±2）℃，光照16 h/d，光強(qiáng)度約600μmol/（m2·s），相對(duì)濕度60%～80%。

表1　引物序列Table1　The sequences of primers

1.2Ss HAK 2的全長(zhǎng)克隆

3周齡鹽地堿蓬幼苗用0.01 mmol/L KCl處理6 h后取樣，參照Trizol試劑盒說明書（上海生工）從根中提取總RNA，按照PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書（大連寶生物）合成cDNA第1鏈。通過對(duì)已知植物的HAK2類核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，找出高度保守區(qū)域，根據(jù)同源性高和簡(jiǎn)并性低的原則，利用DNAMAN和Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)簡(jiǎn)并引物P1和P2（表1），用于擴(kuò)增鹽地堿蓬H AK 2基因核心片段，推測(cè)目的片段的長(zhǎng)度為474 bp。根據(jù)已測(cè)得的核心片段序列設(shè)計(jì)5′端特異引物P3（外側(cè)引物）、P4（巢式引物）（表1）及3′端特異引物P5（外側(cè)引物）、P6（巢式引物）（表1），分別與GeneRacerTM試劑盒（Invitrogen，USA）提供的5′Primer（5′P）、5′Nested Primer（5′NP）及3′Primer（3′P）、3′Nested Primer（3′NP）配對(duì)，用于外側(cè)和巢式PCR擴(kuò)增，推測(cè)5′cDNA和3′cDNA堿基序列的長(zhǎng)度約為801 bp和1250 bp左右。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：在200μL PCR管中依次加入10×PCR Buffer 5μL、25 mmol/L MgCl23.5μL、10 mmol/L d NTP 1μL、10μmol/L P11μL、10μmol/L P21μL、Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.5μL、c DNA 2 μL，加純水至50μL。核心片段PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s、56℃退火50 s、72℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min；5′-RACE的PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s、58℃退火50 s、72℃延伸80 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min；3′-RACE的PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s、58℃退火50 s、72℃延伸130 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，目的片段的回收和純化按照UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒（上海生工）操作說明進(jìn)行?；厥盏腜CR產(chǎn)物連接到TransTMT5載體，轉(zhuǎn)化TransTM1-T1感受態(tài)細(xì)胞，送至上海生工測(cè)序。將這些片段拼接得到了Ss HAK 2的全長(zhǎng)cDNA。

1.3生物信息學(xué)分析

在NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）網(wǎng)站上，將測(cè)序得到的Ss HAK 2基因序列和氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行Blastn和Blastp分析；序列的翻譯、開放閱讀框分析在DNAMAN 6.0生物軟件上進(jìn)行，氨基酸序列與其他序列的同源比較用Bioedit軟件進(jìn)行，氨基酸的跨膜區(qū)預(yù)測(cè)用在線生物學(xué)軟件TMHMM （http：//w ww.cbs.dtu.dk/services/TMH MM/）進(jìn)行。系統(tǒng)進(jìn)化樹用MEGA 6.0軟件的最大似然法（Maximum likelihood method）進(jìn)行構(gòu)建。

1.4Ss HAK 2的表達(dá)模式分析

采用實(shí)時(shí)定量qPCR方法分析鹽地堿蓬Ss HAK 2的表達(dá)模式。材料處理方案如下：（1）正常K+加鹽處理：待鹽地堿蓬幼苗生長(zhǎng)至30 d，向Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中加25或150 mmol/L NaCl處理0，6，24 h。（2）低K+（0.01 mmol/L）加鹽處理：待鹽地堿蓬幼苗生長(zhǎng)至23 d時(shí)，轉(zhuǎn)入低K+（0.01 mmol/L）（2 mmol/L KNO3用2 mmol/L HNO3代替，0.5 mmol/L KH2PO4用0.5 mmol/L H3PO4代替，加入0.01 mmol/L KCl，用1 mol/L Tris調(diào)整營(yíng)養(yǎng)液p H值為5.7）營(yíng)養(yǎng)液中處理7 d，隨后向低K+Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中加入25或150 mmol/L NaCl處理0，6，24 h。處理液每天更換。處理結(jié)束后，分別收集根和葉，經(jīng)無菌水沖洗后，置于消毒濾紙上迅速吸干表面水分，于液氮中快速冷凍用于RNA的提取。不同處理下鹽地堿蓬根和葉總RNA的提取參照Trizol試劑盒說明書（上海生工）進(jìn)行，按照PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）試劑盒操作說明（大連寶生物）合成cDNA第1鏈。熒光定量qPCR反應(yīng)在ABI 7500熒光定量PCR儀（ABI，America）中進(jìn)行，用于表達(dá)分析的特異性引物由大連寶生物工程有限公司設(shè)計(jì)，分別為P7和P8（表1），待擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為155 bp，以SsACTIN （GenBank登錄號(hào)為EU429457）為內(nèi)參基因，引物為A1和A2（表1），待擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為111 bp。PCR反應(yīng)條件如下：95℃30 s，40個(gè)循環(huán)（95℃5 s，60℃34 s）。采用2-△△ct法［18］計(jì)算Ss HAK 2的相對(duì)表達(dá)量，以無處理的根樣作為對(duì)照。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.5數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，運(yùn)用Duncan多重比較進(jìn)行差異顯著性分析，最小差異顯著性水平為P＜0.05。用Excel 2010、MEGA 6.0等軟件作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1鹽地堿蓬Ss H AK 2全長(zhǎng)cDNA的克隆及生物信息學(xué)分析

以總RNA反轉(zhuǎn)錄所得到的第1鏈cDNA為模板，利用簡(jiǎn)并性引物P1和P2進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)約在474 bp處有1條亮帶，且上下無雜帶（圖1a），測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST檢測(cè)表明該cDNA片段與其他高等植物的HAK2序列具有較高的同源性（78%～88%），其中與空心蓮子草（Alternanthera philoxeroides）Ap KUP 2基因（Gen-Bank登錄號(hào)：JN635515）核苷酸序列的同源性高達(dá)88%，可見該片段是鹽地堿蓬HAK 2類基因片段。根據(jù)此核心片段進(jìn)一步設(shè)計(jì)了特異引物進(jìn)行5′端和3′端的RT-PCR擴(kuò)增，分別得到801 bp的5′RACE產(chǎn)物和1250 bp的3′RACE產(chǎn)物（圖1b和c），將5′端、核心片段和3′端的序列進(jìn)行拼接，得到全長(zhǎng)2890 bp的cDNA（圖2）。該cDNA包含一個(gè)228 bp的5′非翻譯區(qū)（5′UTR）、2367 bp的開放閱讀框（ORF）以及296 bp的3′非翻譯區(qū)（3′UTR），有12個(gè)高度保守的跨膜區(qū)（圖3），編碼788個(gè)氨基酸，推測(cè)其分子量為107.3 k Da。本研究將其命名為Ss HAK 2。

多重比較分析結(jié)果表明，鹽地堿蓬Ss HAK2與其他植物的HAK2類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有很高的同源性（圖4），其中與甜菜（Beta vulgaris）、空心蓮子草、冰葉日中花（Mesembryanthemum crystallinum）和葡萄（Vitis vinifera）HAK2的同源性分別為92%，87%，86%和80%。系統(tǒng)進(jìn)化分析進(jìn)一步表明，Ss HAK2屬于KT/HAK/KUP家族的亞族Ⅱ成員，與擬南芥At KUP2、At KUP6和At KUP8的進(jìn)化關(guān)系較近，而與其他亞族成員的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)（圖5）。

2.2鹽地堿蓬Ss HAK 2的表達(dá)分析

將合成的鹽地堿蓬cDNA用特異性表達(dá)引物P7和P8、A1和A2進(jìn)行實(shí)時(shí)定量qPCR，得到Ss HAK 2和SsACTIN的qPCR反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)電泳檢測(cè)，條帶單一，無引物二聚體（圖6），表明引物的特異性較高，反應(yīng)條件較好，可用于Ss HAK 2的表達(dá)模式分析。

組織特異性分析結(jié)果表明，Ss HAK 2在鹽地堿蓬根和葉中均有高豐度表達(dá)，在不同濃度K+條件下，葉中的表達(dá)量顯著高于根中（圖7）。此外，不同濃度K+（0.01和2.5 mmol/L）處理均誘導(dǎo)Ss HAK 2的表達(dá)，但2.5 mmol/L K+處理下Ss HAK 2的表達(dá)顯著高于低K處理（0.01 mmol/L）（圖7）。

圖1　鹽地堿蓬SsHAK2基因RT—PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖Fig.1　Agarose gel electrophoresis analysis of RT—PCR products of Ss HAK 2 in S.salsa

圖2　鹽地堿蓬K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SsHAK2的c DNA核酸序列及其推測(cè)的氨基酸序列Fig.2　Nucleotide sequences and deduced amino acid residues of SsHAK2 in S.salsa

圖3　SsHAK2的跨膜區(qū)預(yù)測(cè)Fig.3　Transmembrane domains prediction of SsHAK2 in S.salsa

圖4　鹽地堿蓬Ss HAK2與其他植物HAK2類氨基酸的多重比較Fig.4　Sequence alignment of SsHAK2 in S.salsa with HAK2-like proteins from higher plants

圖5　鹽地堿蓬SsHAK2與擬南芥和水稻KT/HAK/KUP家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.5　Phylogenetic analysis of SsHAK2 in S.salsa and members of KT/HAK/KUP family from Arabidopsis thaliana and Oryza sativa

圖6　實(shí)時(shí)定量qPCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖Fig.6　Agarose gel electrophoresis analysis of real-time qPCR products

圖7　SsHAK2的組織特異性分析Fig.7　Tissue specificity of Ss HAK2 expression in S.salsa

進(jìn)一步分析不同濃度K+下添加NaCl對(duì)Ss HAK 2表達(dá)的影響，結(jié)果見圖8。在含有2.5 mmol/L K+的介質(zhì)中，根和葉中Ss HAK 2的表達(dá)受25 mmol/L NaCl處理的顯著誘導(dǎo)，且隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，分別在24和6 h處表達(dá)量達(dá)到最高，較各自對(duì)照（0 h）增加了25%和169%；高Na+（150 mmol/L）處理對(duì)根中Ss HAK 2的表達(dá)無影響，但抑制了葉中的表達(dá)（圖8 A和B）。0.01 mmol/L K+條件下，25和150 mmol/L NaCl的加入均抑制根中Ss HAK 2的表達(dá)，且隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，在24 h處表達(dá)量較對(duì)照（0 h）分別降低38%和58%；然而，25和150 mmol/L NaCl的加入使葉中Ss HAK 2的表達(dá)顯著增加，且在處理6 h后，較對(duì)照（0 h）分別增加了80%和51%（圖8C和D）。以上結(jié)果表明，Ss HAK 2的表達(dá)受介質(zhì)中K+和Na+的共同調(diào)節(jié)。

圖8　不同濃度K+和Na+處理0、6和24 h后Ss HAK 2的相對(duì)表達(dá)量Fig.8　Expression analysis of Ss HAK2 in S.salsa under different K+plus different Na+concentrations for 0，6 and 24 h

3　討論

迄今為止，已經(jīng)從很多植物如大麥［14］、玉米（Zea mays）［19］、胡椒（Piper nigrum）［20］、冰葉日中花［21］、葡萄［22］、番茄（Solanum lycopersicum）［23］等中克隆到KT/HAK/KUP家族部分成員基因，然而，該家族的結(jié)構(gòu)仍未研究清楚。雖然KT/HAK/KUP家族并不具備完全相同的功能保守域，但在氨基酸序列上都含有1個(gè)明顯的特征G VVY GD LGT SPLY（加粗字母為在所有基因中都十分保守）［24］。本研究得到的Ss HAK2氨基酸序列中同樣包含這一保守序列（圖4）。此外，Gupta等［25］的研究發(fā)現(xiàn)，水稻KT/HAK/KUP家族成員（除Os HAK22外）中都含有3個(gè)很保守的區(qū)域，經(jīng)過對(duì)比，在鹽地堿蓬中，同樣有這樣的保守區(qū)域存在（圖2），表明Ss HAK2與水稻中這些蛋白的結(jié)構(gòu)和功能可能存在相似之處。研究表明，高等植物中KT/HAK/KUP家族蛋白成員含有10～14個(gè)跨膜區(qū)域［26］。經(jīng)過TMH MM在線軟件分析可見，Ss HAK2含有12個(gè)跨膜區(qū)（圖3），與大麥和水稻等中的研究結(jié)果一致。KT/HAK/KUP家族根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生分析可劃分為4個(gè)亞族：亞族Ⅰ包括擬南芥At HAK5、水稻Os HAK1和大麥Hv HAK1等，主要介導(dǎo)高親和性K+轉(zhuǎn)運(yùn)過程；大麥Hv HAK2、擬南芥At KUP1和At KUP2屬于亞族Ⅱ成員，在單子葉植物中經(jīng)常轉(zhuǎn)運(yùn)低親和性K+吸收，而在雙子葉植物中表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)運(yùn)活性［24］；亞族Ⅲ和Ⅳ成員的研究相對(duì)較少。本研究中，我們將擬南芥13個(gè)和水稻27個(gè)KT/HAK/KUP家族成員與鹽地堿蓬Ss HAK2進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖5），結(jié)果顯示，Ss HAK2屬于亞族Ⅱ成員，與擬南芥At KUP2、水稻Os-HAK8和Os HAK9位于同一進(jìn)化分枝，表明Ss HAK2可能具有與At KUP2等類似的K+轉(zhuǎn)運(yùn)功能和特征。以上結(jié)果均表明，本研究克隆到的Ss H AK 2編碼KT/HAK/KUP家族K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

Ahn等［27］對(duì)擬南芥KT/HAK/KUP家族13個(gè)成員進(jìn)行組織表達(dá)特異性分析發(fā)現(xiàn)，亞族Ⅱ基因成員At KUP 1、At KUP 2、At KUP 4、At KUP 6和At KUP 8在根和葉中均有高豐度表達(dá)。Su等［21］發(fā)現(xiàn)，亞族Ⅱ基因成員Mc HAK 1和Mc HAK 4在冰葉日中花根、莖葉中有高豐度表達(dá)。與這些結(jié)果相一致，本研究中，Ss HAK 2在鹽地堿蓬的根和葉中均表達(dá)（圖7），表明其可能在根和葉中發(fā)揮重要的作用。研究表明，KT/HAK/KUP家族的亞族Ⅱ成員在不同的雙子葉植物中表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。Rigas等［28］發(fā)現(xiàn)，At KUP4介導(dǎo)擬南芥高親和性K+吸收過程。然而，At KUP6和At KUP2則被證實(shí)介導(dǎo)擬南芥低親和性K+吸收過程［27，29］。更有趣的是，At KUP1介導(dǎo)兼性K+吸收過程，在酵母K+吸收缺陷突變株中表達(dá)時(shí)，于不同K+濃度條件下均增加菌株的K+吸收能力，當(dāng)外部K+濃度在100～200μmol/L之間時(shí)發(fā)生從高親和性到低親和性K+吸收的相變［30］。然而，Osakabe等［31］對(duì)擬南芥三突變體atkup 2/6/8的研究發(fā)現(xiàn)，KT/HAK/KUP家族的亞族Ⅱ成員At KUP2、At KUP6和At-KUP8可能參與擬南芥的K+外流過程。本研究中，0.01和2.50 mmol/L K+處理均誘導(dǎo)根和葉中Ss HAK 2的表達(dá)（圖7），表明Ss HAK2在鹽地堿蓬體內(nèi)K+吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)過程中可能發(fā)揮重要作用。

Li等［32］在研究K+營(yíng)養(yǎng)對(duì)鹽脅迫下鹽地堿蓬幼苗生長(zhǎng)影響的過程中，發(fā)現(xiàn)100和400 mmol/L NaCl處理下，提高介質(zhì)中K+濃度可明顯增加植株的水分、干鮮重、生長(zhǎng)速率，表明K+對(duì)鹽地堿蓬的耐鹽性至關(guān)重要。本研究初步分析了不同濃度K+和Na+處理下鹽地堿蓬Ss HAK 2表達(dá)模式的變化（圖8）。不同濃度Na+處理對(duì)鹽地堿蓬Ss HAK 2表達(dá)的影響受介質(zhì)中K+濃度的調(diào)節(jié)（圖8），表明Ss HAK2可能參與鹽處理下的鹽地堿蓬體內(nèi)K+吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)過程。Rubio等［33］對(duì)擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)，K+缺失引起根中At H AK 5的表達(dá)下調(diào)，卻顯著增加其在葉中的表達(dá)，可見，At HAK5可能在不同的組織部位中發(fā)揮不同的作用，但是具體的原因尚不清楚。Su等［21］研究發(fā)現(xiàn)，高鹽處理（400 mmol/L Na+）顯著誘導(dǎo)冰葉日中花Mc HAK 1和Mc HAK 4的表達(dá)，利用原位雜交在成熟根和葉的脈管組織中觀測(cè)到極強(qiáng)的McHAK1和Mc HAK4的雜交信號(hào)，推測(cè)它們可能會(huì)通過脈管組織中的裝載/卸載影響植物K+的長(zhǎng)距離運(yùn)輸，從而調(diào)節(jié)根中的K+吸收過程。本研究中，低K+（0.01 mmol/L）條件下，不同濃度Na+（25和150 mmol/L）的添加抑制鹽地堿蓬根中Ss HAK 2的表達(dá)，卻顯著誘導(dǎo)葉中Ss HAK 2的表達(dá)；2.5 mmol/L K+處理下，不同濃度Na+（25和150 mmol/L）的添加也引起根和葉中Ss HAK 2表達(dá)的變化不同。我們推測(cè)，鹽處理下，Ss H AK 2在鹽地堿蓬根和葉中發(fā)揮不同的功能，且可能在葉中發(fā)揮的作用更大，具體機(jī)制有待更深一步研究。

綜上所述，Ss HAK 2編碼KT/HAK/KUP家族K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在根和葉中均有高豐度表達(dá)，轉(zhuǎn)錄豐度受外界K+和Na+濃度的調(diào)節(jié)，可能參與鹽地堿蓬體內(nèi)K+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過程，且根和葉中可能發(fā)揮不同的功能。該研究為進(jìn)一步分析Ss HAK2在鹽地堿蓬中的功能提供了分子基礎(chǔ)。

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Cloning and expression analysis of a high-affinity K+transporter gene SsHAK2 in Suaeda salsa

DUAN Hui-Rong，WANG Suo-Min*
State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems，College of Pastoral Agriculture Science and Technology，Lanzhou University，Lanzhou 730020，China

Suaeda salsa，a typical salt-accumulating halophyte，is capable of absorbing K+with high efficiency，and thus maintains a relatively sTableK+level in cells，and grows well，even in highly saline soil.Members of the KT/HAK/KUP gene family have an important role in K+uptake in plants.In this study，we cloned Ss HAK 2 in S.salsa and analyzed the expression patterns of Ss HAK 2 when the plants were exposed to different concentrations of KCl and NaCl.Results revealed that Ss HAK 2 coded for 788 amino acid residues and shared a high homology（80%-92%）with the identified members of KT/HAK/KUP family from other plants.Phylogenetic analysis showed that Ss HAK 2 belonged to a sub-group of the family known as group II，and formed a clade with At KUP2 of Arabidopsis thaliana，indicating close relationship.Ss HAK 2 was highly expressed in roots and leaves，and was induced by widely differing K+concentrations（2.5 and 0.01 mmol/L）. Under 2.5 mmol/L K+conditions，the expression of Ss HAK 2 in roots and leaves was induced by 25 mmol/L Na+application.However，in the medium containing 0.01 mmol/L K+，the expression of Ss HAK 2 in roots was down-regulated by Na+（25 and 150 mmol/L）application，but up-regulated in leaves.The results therefore indicate that Ss HAK 2 might mediate K+uptake and transport in S.salsa，and functioned differently in roots and leaves.

Suaeda salsa；Ss HAK 2；clone；expression analysis

10.11686/cyxb2015182

2015-04-08；改回日期：2015-05-20

教育部博士點(diǎn)基金優(yōu)先發(fā)展領(lǐng)域項(xiàng)目（20130211130001）和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31072073）資助。

段慧榮（1987-），女，山西長(zhǎng)治人，在讀博士。E-mail：duanhuirong514@163.com

Corresponding author.E-mail：smwang@lzu.edu.cn