趙凱麗，王　芳，林　牧，龔亞東（貴州航天醫(yī)院兒科，貴州遵義563000）

實時熒光定量PCR技術(shù)在手足口病病原體檢測中的臨床應(yīng)用

趙凱麗，王芳，林牧，龔亞東△（貴州航天醫(yī)院兒科，貴州遵義563000）

目的探討實時熒光定量PCR（FQ-PCR）技術(shù)在手足口?。℉FMD）病原體檢測中的應(yīng)用，了解遵義市HFMD流行特征。方法收集2015年5～7月該院兒科初步診斷為HFMD的85例患兒的咽拭子、皰疹液標本，采用FQPCR檢測標本中腸道通用型病毒（EV-U）、腸道病毒71型（EV71）及柯薩奇病毒A組16型（CoxA16），同時與酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測結(jié)果進行比較分析。結(jié)果85例HFMD患兒采用FQ-PCR法檢出65例EV-U陽性，陽性率為76.5%，其中2歲以下年齡段患兒陽性40例，陽性率為80.0%（40/50），2～5歲患兒陽性25例，陽性率為71.4%（25/35）。ELISA法檢測EV-U陽性52例，其中2歲以下年齡段患兒陽性31例，陽性率為62.0%（31/50），2～5歲年齡段患兒陽性21例，陽性率為60.0%（21/35）。2種方法檢測陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論FQ-PCR技術(shù)以其靈敏度高、特異性強、速率快等特點更適用于臨床檢測HFMD病原體。2015年遵義市HFMD病原體以EV71較多，其次是CoxA16。

手足口?。荒c道病毒屬；傳染病控制；感染；聚合酶鏈反應(yīng)

手足口?。╤and，foot and mouth disease，HFMD）是由腸道病毒引起的一種急性傳染病，其具有較強的流行能力、傳染性及復雜的傳播媒介方式等特點，多發(fā)于學齡前兒童，尤以5歲以下年齡段發(fā)病率最高，是危害兒童健康的主要疾病。HFMD典型的臨床表現(xiàn)為手、足、口腔等部位出現(xiàn)不同程度的皮膚黏膜皮疹、皰疹、潰瘍，甚至可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜炎等嚴重并發(fā)癥［1］，尤以重癥患兒病情發(fā)展快，易危及生命。有20多種（型）可引起HFMD的腸道病毒，其中以腸道病毒71型（EV71）和柯薩奇病毒A組16型（CoxA16）最為常見［2］，盡管這2種病毒的遺傳背景差異不大，但EV71感染引起重癥病例的概率較高。雖然多種腸道病毒均可引起HFMD，但不同類型的病毒引起的疾病過程也有很大差異。傳統(tǒng)的實驗室檢查一般采用病毒分離培養(yǎng)和血清學方法來確診HFMD病原體，病毒分離培養(yǎng)耗時較長，需要4～15 d，而常用的腸道病毒組合血清并不能包括D血清型，如CoxA16和EV71等，且對技術(shù)要求過于苛刻，很難保證在暴發(fā)疫情時及時確診。實時熒光定量PCR（FQ-PCR）是一種利用PCR法對核酸快速高效擴增的技術(shù)，具有操作方便、特異性強和靈敏度高等優(yōu)點，本文采用FQPCR技術(shù)對貴州航天醫(yī)院兒科住院的2～5歲初步診斷為HFMD的患兒進行病原體檢測，以評估該檢測方法在HFMD病原體檢測中的臨床應(yīng)用價值。

1　資料與方法

1.1一般資料參照第7版《實用兒科學》的診斷標準，選取2015年5～7月本院兒科初步診斷為HFMD的85例患兒作為研究對象。85例患兒中男45例，女40例；年齡7個月至5歲，其中2歲以下50例，2～5歲35例。在征得家長同意的情況下，分別采集入選患兒咽拭子標本85份，皰疹液標本25份。標本采集使用無菌拭子，采集完畢后立即將標本置于病毒保養(yǎng)液中，并于-20℃保存。

1.2儀器與試劑PCR核酸擴增檢測儀采用美國Applied Biosystems real time 7500（ABI 7500）；HFMD病原體檢測試劑有HERQ020124-3B EV71、CA16及通用型腸道病毒核酸檢測試劑盒，均由江蘇默樂生物科技有限公司提供，均通過國家食品藥品管理局（FDA）認證并注冊批準生產(chǎn)應(yīng)用于臨床檢測。診斷標準以該類相關(guān)試劑盒的核酸檢測陽性結(jié)果為準。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）所用EV71 IgG及CoxA16 IgG檢測試劑由北京萬泰生物技術(shù)有限公司提供。

1.3方法FQ-PCR法取原始樣本200 μL，采用固相提取法中的柱式提取法提取RNA，并用PCR核酸擴增檢測儀ABI 7500進行擴增，按照相關(guān)試劑說明書進行溫度條件及循環(huán)擴增參數(shù)配置，同時設(shè)置不同濃度梯度定量品及陰性、陽性對照。嚴格按照相關(guān)試劑盒說明書進行ELISA操作。

1.4統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)　果

2.12種方法檢測結(jié)果比較采用FQ-PCR法檢測85例初步診斷為HFMD患兒的咽拭子標本發(fā)現(xiàn)，腸道通用型病毒（EV-U）陽性 65例，陽性率 76.5%（65/85）；其中2歲以下年齡段患兒陽性40例，陽性率為80.0%（40/50），2～5歲年齡段患兒陽性25例，陽性率為71.4%（25/35）；2歲以下年齡段患兒EV-U陽性率高于2～5歲年齡段患兒，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。EV-U陽性的65例患兒中EV71陽性40例，陽性率為61.5%（40/65），CoxA16陽性25例，陽性率為38.5%（25/65）。在不同類型樣本的檢測比較中，咽拭子樣本陽性率為60.0%（51/85），皰疹樣本陽性率為72.0%（18/25）。ELISA檢測EV-U陽性52例，其中2歲以下年齡段患兒陽性31例，陽性率為62.0%（31/50），2～5歲年齡段患兒陽性21例，陽性率為60.0%（21/35）；其中EV71陽性20例，陽性率為38.5% （20/52），CoxA16陽性12例，陽性率為23.1%（12/52）。FQ-PCR法檢測EV-U的陽性率高于ELISA法，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2FQ-PCR檢測的標準曲線擴增曲線處（除未出現(xiàn)特異性擴增的陰性對照曲線外）大致分為3種形態(tài)：（1）循環(huán)閾值（Ct值）從12個循環(huán)開始上揚的曲線，形狀呈標準的“S”形，說明該樣本中含有的RNA病毒拷貝數(shù)很高；（2）Ct值從22～26個循環(huán)開始呈上揚的曲線，形狀基本呈“S”形，說明該樣本中含有的RNA病毒拷貝數(shù)較高；（3）Ct值從30個循環(huán)開始呈上揚的曲線，形狀暫無法看出呈“S”形，但若再經(jīng)過數(shù)個循環(huán)后便會呈現(xiàn)“S”形曲線，說明該樣本中含有一定拷貝數(shù)的RNA病毒，可診斷為HFMD陽性。見圖1。

圖1　Taq酶探針FQ-PCR檢測陽性標本的標準曲線

3　討　論

多種人腸道病毒引起的HFMD是一種全世界范圍內(nèi)嚴重危害兒童健康的傳染病，柯薩奇病毒是被新西蘭最早發(fā)現(xiàn)的HFMD病毒，Robinson和Rhodes 2位加拿大學者在1958年首次從患者中分離出柯薩奇病毒［3］，1972年EV71也被美國發(fā)現(xiàn)屬于HFMD病毒［4］。傳播速度快、較強的流行能力和傳染性及復雜的傳播方式能在較短的時間內(nèi)大規(guī)模流行，可通過消化道和呼吸道進行傳染［5］，一旦流行疫情難以控制。我國原衛(wèi)生部在2008年5月2日將HFMD列入《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的丙類傳染病。該病病原體為腸道病毒，主要是EV71及CoxA16。EV71感染患兒常伴嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，且EV71感染的危害性最大，致死率最高。自限性HFMD多因CoxA16感染所引起，一般預后較好，發(fā)生嚴重并發(fā)癥和死亡的概率極低［6］。

目前，HFMD病原體檢測一般采用病毒培養(yǎng)、血清學檢測和FQ-PCR檢測、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測等技術(shù)，其傳統(tǒng)的診斷以臨床表現(xiàn)為主要手段，早期檢測常為陰性。RT-PCR多次擴增的檢測方式易出現(xiàn)假陽性，交叉污染等存在操作繁瑣易污染等缺點，且對檢測CoxA16的靈敏度不夠高［7］。本研究選取85例本院兒科初步診斷為HFMD的患兒為研究對象，采用FQ-PCR技術(shù)對患兒85份咽拭子標本和25份皰疹液標本進行EV71及CoxA16檢測，結(jié)果顯示，EV-U檢出陽性率為76.5%，具有較好的檢測靈敏度，這可能與不同類型的標本有關(guān)［8］。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)Q-PCR較ELISA法的檢測靈敏度更高。陽性樣本患兒發(fā)病7d內(nèi)的傳染能力最強，7～14 d從咽部可檢測到病毒，21～35 d從糞便中可檢測到病毒，一般皰疹液中存有大量病毒，其中一些治愈的患兒在其排出的糞便中檢測出病毒的生存周期可達數(shù)月［9］。

本研究檢測為EV-U陽性的65例患兒中，EV71感染陽性40例，CoxA16陽性25例，說明在貴州省遵義地區(qū)HFMD的發(fā)病以EV71感染為主，這與文獻報道的貴州省流行病學特征相符合［10］。本研究中皰疹液標本陽性率為72.0%（18/25）高于咽拭子的60.0% （51/85），但因咽拭子采集操作步驟簡便、無創(chuàng)傷、不抽血等特點，患兒及家長均較易于接受，所以實驗室推薦采用咽拭子標本采集法。

通過對EV71、CoxA16感染病例的對比分析發(fā)現(xiàn)，EV71與CoxA16引起的HFMD在臨床表現(xiàn)等方面差異不大，但EV71易致腦干腦炎及神經(jīng)源性肺水腫，可能危及生命。因此，采用FQ-PCR技術(shù)進行HFMD病原體檢測顯得尤為重要，其具有不易污染、特異性好、操作簡單等優(yōu)點，能夠在HFMD疫情暴發(fā)和臨床患兒感染的早期做出高通量、快速診斷。此外，F(xiàn)Q-PCR技術(shù)在HFMD病原體潛伏期即能區(qū)分是否感染，對于HFMD的及時監(jiān)測和防控具有重要作用。

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Clinical application of real-time fluorescence quantification PCR technology in HFMD pathogen detection

Zhao Kaili，Wang Fang，Lin Mu，Gong Yadong△（Department of Pediatrics，Guizhou Aerospace Hospital，Zunyi，Guizhou 563000，China）

ObjectiveTo investigate the application of real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （FQ-PCR）technology in hand-foot and mouth disease（HFMD）pathogens detection，and to understand the HFMD epidemic characteristics in Zunyi City.MethodsThe throat swabs and herpes liquid samples were collected from 85 children patients with preliminarily diagnosed HFMD in the pediatric department of our hospital.EV-U，EV71 and coxsackievirus A 16（CoxA16）were detected by using the FQ-PCR technology，meanwhile the obtained results were compared with those detected by ELISA.Results

Among 85 cases of HFMD，65 cases of EV-U positive were detected by FQ-PCR，the positive rate was 76.5%，in which 40 cases were in the age group of less than 2 years old，the positive rate was 80.0%（40/50），25 cases were in the age group of 2-5 years，the positive rate was 71.4%（25/35）.Fifty-two cases of EV-U positive were detected by ELISA，in which 31 cases were the age group of under 2 years old，the positive rate was 62.0%（31/50），21 cases were in the age group of 2-5 years，the positive rate was 60.0%（21/35），the difference between these two kinds of method was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionThe FQ-PCR technology of HFMD pathogen detection is more suitable for the clinical application due to the characteristics of high sensitivity，strong specificity and high speed.The HFMD pathogens in Zunyi City during 2015 are mainly EV71，followed by CoxA 16.

Hand，foot and mouth disease；Enterovirus；Communicable disease control；Infection；Polymerase chain reaction

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.15.012

A

1009-5519（2016）15-2310-02

趙凱麗（1973-），副主任醫(yī)師，主要從事兒科臨床工作。

△，E-mail：747755680@qq.com。

（2016-03-24）