高峰畏，雷澤華，陳　雷，蔣康怡，張英毅，王志旭（樂山市人民醫(yī)院普通外一科，四川614000）

基因檢測在結(jié)直腸癌患者術(shù)后化療中的臨床意義

高峰畏，雷澤華△，陳雷，蔣康怡，張英毅，王志旭（樂山市人民醫(yī)院普通外一科，四川614000）

目的探討結(jié)直腸惡性腫瘤組織的切除修復(fù)交叉互補基因1（ERCC1）、胸腺嘧啶合成酶（TS）mRNA表達水平及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1（UGT1A1）基因多態(tài)性檢測在結(jié)直腸癌患者術(shù)后化療中的臨床意義。方法選取該院2012年8月至2015年3月收治的進展期結(jié)直腸癌患者178例，分為研究組（93例）和對照組（85例）。對照組采用常規(guī)化療方法，研究組采用個體化化療方法，分別進行術(shù)后化療。研究組通過檢測UGT1A1基因多態(tài)性及ERCC1、TS mRNA表達水平，決定患者選用安全、有效的化療方案。比較兩組患者化療后不良反應(yīng)發(fā)生率、無病生存率（DFS）和無進展生存期（PFS）。結(jié)果研究組患者中位PFS長于對照組，化療后2年DFS高于對照組，肝功能損害、腹瀉、血液毒性和血尿素氮升高發(fā)生率較對照組低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而神經(jīng)毒性、心臟毒性和血肌酐升高發(fā)生率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論ERCC1、TS mRNA表達水平及AUGT1A1基因多態(tài)性檢測能使進展期結(jié)直腸癌患者在臨床個體化化療中獲益，延長PFS，提高DFS，降低部分毒性反應(yīng)發(fā)生率。

基因；多態(tài)現(xiàn)象，遺傳；結(jié)直腸腫瘤；手術(shù)后期間；抗腫瘤藥/毒性

盡管近年來結(jié)直腸癌發(fā)病率和致死率呈下降趨勢［1］，但在我國男、女性發(fā)病率分別居癌癥第5位和第3位，病死率分別居第5位和第6位［2］。手術(shù)、化療和靶向治療是目前治療結(jié)直腸癌的主要方法，其中化療作為局部根治術(shù)后輔助治療或姑息手術(shù)后的主要治療手段對提高患者生存率具有重要意義。如何選擇最佳化療方案，避免使用無效、不良反應(yīng)大的化療藥物一直長期困擾著臨床醫(yī)生。近年來，通過檢測癌特異性基因mRNA表達水平，可反映患者對化療藥物的敏感性和降低不良反應(yīng)風(fēng)險，從而實現(xiàn)結(jié)直腸癌化療用藥的個體化，提高療效，降低不良反應(yīng)發(fā)生率。本研究通過對93例結(jié)直腸腫瘤患者進行基因檢測，采用個體化化療方案，并與采用常規(guī)化療方法的85例結(jié)直腸癌患者進行比較，觀察相關(guān)指標(biāo)的差異，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取本院2012年8月至2015年3月收治的進展期結(jié)直腸癌患者93例作為研究組，其中男62例，女31例；年齡32～85歲；腫瘤分化程度：高分化21例，中分化61例（包含中-低分化、高-中分化），低分化11例；分期：Ⅱ期4例，Ⅲ期89例；部位：直腸癌55例，結(jié)腸癌38例。選取同期收治的進展期結(jié)直腸癌患者85例作為對照組，其中男49例，女36例；年齡36～78歲；分化程度：高分化12例，中分化65例，低分化8例；分期：Ⅱ期6例，Ⅲ期79例；類型：直腸癌46例，結(jié)腸癌39例。兩組患者一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。納入研究的Ⅱ期患者均伴不確定切緣陽性等高危因素，需進行術(shù)后化療［1］。

1.2材料與試劑

1.2.1DNA提取和定量患者的病理活檢組織。QIA-amp DNA Mini Kit（50）購自Qiagen公司，5424R臺式高速冷凍離心機購自Eppendorf公司，NanoDrop 2000超微量分光光度計購自Thermo Scientific公司，無RNA酶槍頭購自Axygen公司，無RNA酶1.5 mL的EP管購自Eppendorf公司。

1.2.2PCR反應(yīng)One-Step Real-Time RT-PCR Master Mixes購自ABI公司，TaqMan?Universal Master MixⅡ，withUNG購自ABI公司，96孔板和封口膜購自Axygen公司，針對目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因設(shè)計的特異性引物和探針購自ABI公司，ABI7500熒光定量PCR儀購自ABI公司。

1.3方法

1.3.1化療方法對照組患者采用常規(guī)化療方法。研究組患者采用個體化化療方法，通過檢測患者的切除修復(fù)交叉互補基因1（ERCC1）、胸腺嘧啶合成酶（TS）mRNA表達水平及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1（UGT1A1）多態(tài)性，指導(dǎo)臨床選擇最佳化療方案：（1）ERCC1 mRNA低表達者選用奧沙利鉑，TS mRNA低表達者選用氟尿嘧啶或卡培他濱類藥物；（2）UGT1A1基因多態(tài)性檢測無突變者選用伊立替康。

1.3.2檢測方法基因表達水平檢測采用熒光定量PCR進行相對定量檢查，以內(nèi)參基因GAPDH在體內(nèi)的表達量為基數(shù)，通過ΔCt（ΔCt=Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因）判斷目標(biāo)基因表達水平。

1.3.2.1基因表達水平檢測（1）RNA提取：參照試劑盒說明書進行RNA提取和定量；（2）RT-PCR：PCR的組分分別為RT-PCR反應(yīng)混合物（Mix），針對目標(biāo)基因設(shè)計的上、下游引物，針對目標(biāo)基因設(shè)計的熒光探針，針對內(nèi)參基因設(shè)計的上、下游引物，針對內(nèi)參基因設(shè)計的熒光探針、腫瘤組織RNA等（組分用量需參照《One-Step Real-Time RT-PCR Master Mixes使用手冊》優(yōu)化確定）。PCR反應(yīng)條件：50℃15 min、95℃2 min；95℃15s、60℃ 1 min 40循環(huán)；60℃1 min，其中60℃1 min的溫度需根據(jù)探針的解鏈溫度（TM）值進行優(yōu)化調(diào)整。

1.3.2.2基因突變檢測（1）DNA提?。簠⒄赵噭┖姓f明書進行DNA提取和定量；（2）熒光定量PCR：PCR的組分分別為PCR Mix，針對目標(biāo)基因設(shè)計的上、下游引物，針對目標(biāo)基因設(shè)計的熒光探針，針對內(nèi)參基因設(shè)計的上、下游引物，針對內(nèi)參基因設(shè)計的熒光探針、腫瘤組織DNA等（組分用量需參照《TaqMan?Universal Master MixⅡ，with UNG使用手冊》優(yōu)化確定，內(nèi)標(biāo)基因可選取一個管家基因）。PCR反應(yīng)條件：50℃2 min、95℃10min；95℃15 s、60℃1 min 40循環(huán)；60℃1 min，其中60℃1 min中的溫度需根據(jù)探針的TM值進行優(yōu)化調(diào)整。

1.3.2.3檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)以ΔCt為指標(biāo)進行結(jié)果判讀，ΔCt＜2.9為高表達，ΔCt＞6.05為低表達，ΔCt為2.9～6.05為中表達。

1.3.3觀察指標(biāo)觀察兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生情況、無病生存率（DFS）、無進展生存期（PFS）等。

1.3.4化療不良反應(yīng)分級根據(jù)世界衛(wèi)生組織2003年化療不良反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)分為0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級，見表1。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗、Fisher確切概率法，Kaplan-Meier法描繪生存曲線，Log-rank法進行相關(guān)性分析；采用Cox比例風(fēng)險回歸模型進行多因素分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1　化療不良反應(yīng)分級

2　結(jié)　果

2.1研究組患者ERCC1、TS mRNA表達情況研究組患者ERCC1、TS mRNA均以低表達為主，見表2。

表2　研究組患者ERCC1、TS mRNA表達情況［n（%），n=93］

2.2研究組患者UGT1A1多態(tài)性檢測結(jié)果93例患者中低度風(fēng)險（6/6 TA無突變）66例（71.0%），中度風(fēng)險（6/7 TA雜合突變）26例（28.0%），高度風(fēng)險（7/7 TA純合突變）1例（1.1%）。

2.3兩組患者化療方案比較研究組患者根據(jù)基因檢測結(jié)果選擇化療方案，對照組根據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）結(jié)直腸癌治療指南（2016年版）［1］選擇化療方案。兩組患者采用的化療方案見表3。

表3　兩組患者化療方案比較［n（%）］

2.4兩組患者化療后PFS比較研究組患者PFS長于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表4。兩組患者化療后無進展生存曲線圖見圖1。

表4　兩組患者化療后PFS比較

圖1　兩組患者化療后無進展生存曲線圖

2.5兩組患者化療后DFS比較研究組1年（包括1年內(nèi)）無病生存人數(shù)92例，DFS為98.9%；2年（包括2年內(nèi)）無病生存人數(shù)87例，DFS為93.5%；對照組對應(yīng)數(shù)據(jù)為80（94.1%）、73（85.9%）。兩組化療后2年DFS比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.420，P＜0.05）。

2.6兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生情況比較研究組患者腹瀉、白細胞減少、血尿素氮升高和肝功能損害發(fā)生率較對照組低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而血肌酐升高、心臟毒性和神經(jīng)毒性發(fā)生率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表5　兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生情況比較

3　討　論

高危Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌手術(shù)聯(lián)合輔助化療可使患者在長期生存方面獲益［1］。對該類結(jié)直腸癌患者的術(shù)后化療，2015版NCCN指南明確提出，不具有高危因素的Ⅱ期患者可選擇臨床觀察或考慮給予卡培他濱或氟尿嘧啶/甲酰四氫葉酸治療；高危Ⅱ、Ⅲ期患者考慮給予輔助化療方案包括氟尿嘧啶/甲酰四氫葉酸、卡培他濱、FOLFOX（Ⅲ期優(yōu)選）、CapeOX（卡培他濱方案，Ⅲ期優(yōu)選）或FLOX（5-氟尿嘧啶、亞葉酸鈣，奧沙利鉑方案）［1］。但對患者而言，選擇哪種化療方案更安全、有效，最大限度地減少對生活質(zhì)量的影響，避免不斷調(diào)整方案，降低治療成本，是應(yīng)該被關(guān)注的問題［3］。由表3可見，研究組患者中直接選擇FOLFOX方案35例（ERCC1 mRNA低表達），選擇FOLFIRI方案49例（UGT1A1基因多態(tài)性檢測為低風(fēng)險），選擇XELOX方案9例（TS mRNA低表達）。對照組患者中選擇FOLFIRI方案29例（因腫瘤分期相對較晚），常規(guī)選擇FOLFOX方案49例，選擇XELOX方案5例（因患者年齡大、其余方案不良反應(yīng)大或其他原因而選用）。

經(jīng)驗性化療中只有30%～40%患者受益明顯［4］，原因在于這些與化療療效相關(guān)的基因表達在不同個體中存在很大差異［5］，按基因檢測結(jié)果可選擇安全、有效、不良反應(yīng)最小的化療方案，從而使患者在術(shù)后化療中更加獲益。

DNA修復(fù)是鉑類藥物耐藥性產(chǎn)生的主要原因［6-8］。ERCC1參與修復(fù)鉑類化療藥物而導(dǎo)致腫瘤細胞DNA損傷。臨床研究已證實，其表達水平與多種癌癥鉑類化療療效和患者生存期呈負相關(guān)，即ERCC1低表達患者對鉑類藥物更敏感［9-11］。

TS在正常細胞代謝情況下催化脫氧尿苷酸轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣剀账?，?dāng)氟尿嘧啶進入體內(nèi)即活化為氟尿嘧啶脫氧核苷酸，氟尿嘧啶脫氧核苷酸代替脫氧尿苷酸與TS結(jié)合，使TS失活，不能合成脫氧胸苷酸，從而影響DNA合成，該途徑也是氟尿嘧啶發(fā)揮抗癌作用的主要途徑［12-13］。TS基因多態(tài)性使TS蛋白功能和表達存在差異，造成不同患者應(yīng)用氟尿嘧啶治療的療效差別很大［14-16］。

有研究發(fā)現(xiàn)，位于UGT1A1基因啟動子區(qū)的插入缺失多態(tài)與伊立替康引起的中性粒細胞減少或腹瀉具有明顯相關(guān)性；插入多態(tài)UGT1A1*28（7 TA）可降低轉(zhuǎn)移酶活性，攜帶UGT1A1*28（7 TA）的結(jié)直腸癌患者對伊立替康產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)［17］。對中國人群的研究顯示，攜帶該遺傳多態(tài)7/7 TA基因型的個體較少，攜帶6/7TA基因型的患者較6/6 TA患者在接受伊立替康一線化療后易出現(xiàn)不良反應(yīng)，該研究建議雜合基因型患者接受治療時應(yīng)減少伊立替康用量［18］；另一項以伊立替康為基礎(chǔ)的二線聯(lián)合化療治療進展期結(jié)直腸癌患者的研究也得出了類似結(jié)論［19］。

本研究選擇178例進展期結(jié)直腸癌患者進行分析，對其中93例患者ERCC1、TS mRNA表達水平及UGT1A1基因啟動子多態(tài)性進行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果選擇安全、有效、不良反應(yīng)低的化療方案，與另外85例患者比較，肝功能損害、腹瀉、血液毒性和血尿素氮升高發(fā)生率較低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。因隨訪時間較短，本研究無法統(tǒng)計總生存期和總生存率，研究組患者PFS長于對照組，化療后2年DFS高于對照組，在隨訪期內(nèi)雖然差異不太明顯，但均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），不良反應(yīng)發(fā)生率明顯改善，患者在個體化化療中獲益。

隨著腫瘤基因相關(guān)科學(xué)領(lǐng)域的交融、轉(zhuǎn)化，腫瘤患者個體化差異正逐漸被了解，從而使特異性靶點檢測和靶向治療在腫瘤治療方面有所突破。通過基因檢測可指導(dǎo)制定治療計劃。如UGT1A1基因多態(tài)性檢測及胸苷酸合成酶基因（TYMS）、乳腺癌1號基因（BRCA1）、微管蛋白β3［17-18］、ERCC1、微管解聚蛋白1、TS mRNA表達水平檢測［20］，以此反映結(jié)直腸癌化療方案的安全性、有效性及不良反應(yīng)風(fēng)險。NCCN結(jié)直腸癌治療指南（2015年版）明確建議［1］：應(yīng)用鉑類藥物化療方案前進行ERCC1 mRNA檢測，根據(jù)檢測結(jié)果決定是否采用該方案化療可提高化療效果。這已成為腫瘤個體化化療的風(fēng)向標(biāo)，促使包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的腫瘤化療更趨向個體化治療。

綜上所述，對高危險因素的Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌患者實施UGT1A1基因多態(tài)性檢測和ERCC1、TS mRNA表達水平檢測，根據(jù)檢測結(jié)果制定化療方案能延長患者生存時間，有效提高化療效果，降低化療不良反應(yīng)發(fā)生率，使患者獲益。但更為確切的效果尚需更長時間的隨訪和更多的多中心大樣本量隨機對照研究證實。

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Clinical significance of gene detection in postoperative chemotherapy in patients with advanced colorectal cancer

Gao Fengwei，Lei Zehua△，Chen Lei，Jiang Kangyi，Zhang Yingyi，Wang Zhixu（First Department of General Surgery，Leshan Municipal People′s Hospital，Leshan，Sichuan 614000，China）

ObjectiveToinvestigatetheclinicalsignificanceofdetectionofexcisionrepaircrosscomplementing1（ERCC1）gene，thymidylatesynthetase（TS）mRNAexpressionlevelsandgene polymorphism ofuridine diphosphate glucuronyltransferase1A1 （UGT1A1）of colorectal malignant tumor tissue in postoperative chemotherapy of the patients with advanced colorectal cancer. MethodsTotally 178 patients with advanced colorectal cancer in our hospital from August 2012 to March 2015 were selected and divided into the study group（n=93）and the control group（n=83）according to different chemotherapy schemes.The control group adopted the routine chemotherapy and the study group adopted the individualized chemotherapy.The two groups were respectively given postoperative chemotherapy.The study group determined to select safe and effective chemotherapy scheme by detecting the UGT1A1 gene polymorphism and the expression levels of ERCC1 and TS mRNA.the incidence rate of adverse reactions，disease free survival（DFS）and progression free survival（PFS）after chemotherapy were compared between the two groups. ResultsThe median PFS in the study group was longer than that in the control group，DFS after 2 years of chemotherapy in the study group was higher than that in the control group，and the incidence rates of liver function damage，diarrhea，hematotoxicity and increase of blood urea nitrogen in the study group were significantly higher than those in the control group，the differences were statistically significant（P＜0.01），while the incidence rates of neurovirulence，cardiotoxicity and increase of serum creatinine had no statistically significant difference between the two groups（P＞0.05）.ConclusionThe detection of expression levels of ERCC1 and TS mRNA，and UGT1A1 gene polymorphism benefits the patients with advanced colorectal cancer in clinical individualized chemotherapy，prolongs PFS，enhances DFS and reduces the incidence rate of partial toxic reactions.

Genes； Polymorphism，genetic； Rectal neoplasms；Postoperative period；Antineoplastic agents/toxicity

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.13.011

A

1009-5519（2016）13-1985-04

高峰畏（1985-），碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤相關(guān)研究。

△，E-mail：707850255@qq.com。

（2016-02-17）