郭向華，黎華輝，周　聯(lián)，羅　霞，典靈輝，郭潤華（.廣東醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，廣東 東莞53808；.廣州中醫(yī)藥大學藥學院，廣東廣州50006；3.解放軍第四一一醫(yī)院干部病房科，上海0008）

HMGB1表達水平對實驗性結腸炎小鼠Th1/Tc1細胞反應的影響*

郭向華1，黎華輝1，周聯(lián)2，羅霞2，典靈輝1，郭潤華3△（1.廣東醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，廣東 東莞523808；2.廣州中醫(yī)藥大學藥學院，廣東廣州510006；3.解放軍第四一一醫(yī)院干部病房科，上海200081）

目的觀察高遷移率族蛋白B1（HMGB1）的表達水平對實驗性結腸炎小鼠輔助性T細胞1/細胞毒性T細胞1（Th1/Tc1）細胞反應的影響。方法將BALB/C小鼠分為乙醇對照組、模型組和丙酮酸乙酯（EP）干預組，后兩組采用2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）灌腸建立小鼠結腸炎模型。每天進行疾病活動指數(shù)（DAI）評分，于造模后第7天處死小鼠，觀察結腸組織病理學損傷情況；流式細胞術分析脾臟、腸系膜淋巴結Th1/Tc1細胞比例的變化，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測血清和結腸組織中HMGB1、干擾素γ（IFN-γ）的表達水平。結果與乙醇對照組比較，模型組小鼠DAI評分、鏡下組織病理學損傷評分均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；同時，外周血和結腸組織中HMGB1、IFN-γ水平，脾臟、腸系膜淋巴結中Th1/Tc1細胞比例也明顯高于乙醇對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，EP干預治療1周后，EP干預組小鼠血清和結腸組織HMGB1水平明顯降低，DAI評分下降，鏡下組織病理損傷明顯減輕，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；伴隨脾臟、腸系膜淋巴結Th1/Tc1細胞比例的下降，血清和結腸組織中IFN-γ水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P0.01）。結論HMGB1可作為內(nèi)源性免疫刺激劑誘導促進Th1/Tc1細胞反應亢進，進而參與實驗性結腸炎小鼠的致病。

結腸炎；HMGB1蛋白質(zhì)；Th1細胞；T淋巴細胞，細胞毒性；干擾素Ⅱ型；三硝基苯磺酸；小鼠

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）與克羅恩?。–rohn′s disease，CD）同屬于炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD），為一組病因未明、發(fā)病機制尚不清楚的慢性復發(fā)性腸道炎癥疾病，現(xiàn)已證實其容易誘發(fā)結直腸癌［1-2］。該病近年在我國呈高發(fā)趨勢，但目前臨床尚缺乏有效的治療手段。因此，深入研究其發(fā)病機制并尋求更有效的治療途徑是目前最緊迫的任務。

盡管IBD的發(fā)病機制不十分明了，但免疫機制紊亂一直是該病的研究熱點［1］，輔助性T細胞1/輔助性T細胞2（Th1/Th2）細胞比例失衡已是被廣泛認可的發(fā)病機制之一。通常認為，CD是以Th1細胞介導的免疫損傷為主，而UC是Th2細胞介導的炎癥性疾?。?-2］。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，炎性細胞因子——高遷移率族蛋白B1 （high mobility group box-1 protein，HMGB1）可通過激活抗原呈遞細胞（antigen presenting cell，APC）表面的相應受體，參與Th1、Treg CD4+T細胞的分化調(diào)控［3-4］。既往的研究結果顯示，HMGB1與IBD的發(fā)病過程密切相關［5-6］，但具體機制尚不清楚。HMGB1、Th1細胞均參與了IBD的致病，而HMGB1是否通過調(diào)控Th1細胞的活化增殖參與IBD致病目前尚鮮見相關報道，因而值得深入研究。本研究以2，4，6-三硝基苯磺酸 （trinitrobenzenesul fonic acide，TNBS）誘導的小鼠結腸炎為基礎，應用HMGB1的高效抑制劑——丙酮酸乙酯（ethyl pyruvate，EP）進行體內(nèi)干預，探討IBD發(fā)病中HMGB1對Th1/Tc1（細胞毒性T細胞1）的調(diào)控作用及其分子機制，為進一步揭示IBD的發(fā)病機制及新型藥物的研發(fā)提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1動物、藥品及試劑無特定病原體級（SPF級）BALB/C小鼠30只，均為雌性，6～8周齡，體質(zhì)量18～22g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心；2.5%TNBS（美國Sigma公司產(chǎn)品），用無水乙醇1∶1混勻稀釋而成；EP（美國Sigma公司）以乳酸林格液配置成所需濃度；乳酸鈉林格注射液購自安徽雙鶴有限公司；小鼠干擾素γ（interfer on-γ，IFN-γ）、小鼠HMGB1 ELISA試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術有限公司；單克隆抗體PE-Cy7抗小鼠CD3、APC抗小鼠CD8a、PE抗小鼠CD69、PE-Isotype Control、PE抗小鼠IFN-γ購自美國eBioscience公司；BD FACSCanto流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1造模、給藥及標本采集將30只BALB/C小鼠分為乙醇對照組、模型組和EP干預組，每組10只。各組動物禁食24 h，水合氯醛麻醉后，用灌胃針從肛門插入至腸內(nèi)4 cm，除乙醇對照組灌注50%乙醇100 μL外，其余動物注入2.5%TNBS 100 μL灌腸造模，注入藥液后均倒置60 s，然后放回籠中飼養(yǎng)。造模8 h后開始給藥，EP干預組每天按100 mg/kg腹腔注射EP溶液，乙醇對照組和模型組每天腹腔注射等量乳酸林格液。造模后第7天處死動物，收集血清及結腸標本以備檢測。

1.2.2疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分按Okayasu等［7］方法，觀察小鼠每天大便性狀（是否成形）、體質(zhì)量變化（較實驗開始時小鼠體質(zhì)量變化百分比）及血便情況，對小鼠進行DAI評分。

1.2.3結腸黏膜病理改變及組織學損傷指數(shù)（tissues damage index，TDI）評分動物處死后，迅速剖開腹腔，截取病變明顯處結腸，進行蘇木精-伊紅（hematoxylineosinstaining，HE）常規(guī)染色。鏡下觀察組織學病理變化，分別觀察炎癥細胞浸潤情況及黏膜受累范圍、程度等組織學改變，參照文獻［8］評分標準，采用雙盲法進行TDI評分。

1.2.4外周血IFN-γ及HMGB1測定采集外周血分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosor bent assay，ELISA）法檢測血清HMGB1、IFN-γ水平，按照試劑盒說明操作。

1.2.5腸組織勻漿上清液中IFN-γ及HMGB1檢測將新鮮結腸用冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗干凈并稱質(zhì)量，然后迅速轉(zhuǎn)入液氮保存。切取200 mg結腸剪碎后用冰冷生理鹽水制成10%結腸組織勻漿，離心后提取上清液，ELISA檢測上清液中IFN-γ及HMGB1水平。

1.2.6Th1/Tc1細胞亞群檢測采用流式細胞術標本處理方法［9］制備脾臟（spleen，SP）和腸系膜淋巴結（mesenteric lymph node，MLN）單細胞懸液，每組各取5只小鼠進行測定；使用膜抗體CD3、CD8和內(nèi)標抗體IFN-γ界定Th1/Tc1細胞，即CD3+CD8-IFN-γ+（Th1）/CD3+CD8+IFN-γ+（Tc1）細胞。數(shù)據(jù)經(jīng)BD FACSCanto流式細胞儀獲取、處理及分析。

1.3統(tǒng)計學處理應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　果

2.1各組小鼠DAI評分及體質(zhì)量變化比較模型組小鼠于造模后第1天出現(xiàn)少動、厭食、大便稀軟，多數(shù)動物出現(xiàn)黏液血便，體質(zhì)量較乙醇對照組明顯下降，而DAI評分則顯著高于乙醇對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。EP干預組小鼠造模后也出現(xiàn)不同程度的少動，精神、食欲不佳，稀便或軟便，體質(zhì)量減輕等表現(xiàn)，但在給藥第3天癥狀開始減輕，大便逐漸成形，與模型組比較，體質(zhì)量回升迅速，DAI評分明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2各組小鼠結腸黏膜病理改變及TDI評分比較光鏡下見模型組小鼠結腸黏膜明顯充血、水腫、糜爛及潰瘍，黏膜和黏膜下層有大量淋巴細胞、單核細胞浸潤，腺體破壞且結構紊亂，杯狀細胞減少，其TDI評分顯著高于乙醇對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。而EP干預組小鼠結腸黏膜病理損傷明顯改善，表現(xiàn)為黏膜及黏膜下炎癥細胞浸潤減少，腺體破壞及黏膜充血、水腫減輕，TDI評分較模型組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1　各組小鼠DAI、TDI評分及體質(zhì)量變化比較（±s）

表1　各組小鼠DAI、TDI評分及體質(zhì)量變化比較（±s）

注：與乙醇對照組比較，aP＜0.01，bP＜0.05；與模型組比較，cP＜0.05。

組別乙醇對照組模型組EP干預組n　DAI評分（分）　TDI評分（分）　體質(zhì)量（g）10 10 10 0.00±0.00 3.13±0.89a1.02±0.57bc0.00±0.00 9.00±2.11a6.00±1.41bc22.57±1.50 16.85±1.67b19.20±1.37ac

圖1　各組小鼠結腸黏膜病理改變（HE染色，100×）

2.3各組小鼠血清IFN-γ及HMGB1檢測結果比較模型組小鼠血清IFN-γ及HMGB1水平較乙醇對照組顯著升高（分別升高3倍之多），差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；應用EP干預治療1周后，EP干預組血清HMGB1水平較模型組下降50%左右，血清IFN-γ水平也較模型組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2　各組小鼠血清IFN-γ及HMGB1檢測結果比較（±s）

表2　各組小鼠血清IFN-γ及HMGB1檢測結果比較（±s）

注：與乙醇對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01。

組別乙醇對照組模型組EP干預組n　IFN-γ（pg/mL）　HMGB1（ng/mL）10 10 10 97.17±15.12 312.37±27.64a176.54±31.89ab1.87±1.05 6.72±1.24a3.24±0.47ab

2.4各組小鼠SP及MLN單細胞懸液中Th1/Tc1細胞亞群檢測結果比較與乙醇對照組比較，模型組小鼠SP 及MLN單細胞懸液中Th1/Tc1細胞亞群均有所增加，其中Th1細胞在SP中升高明顯，Tc1細胞在MLN中變化突出，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，EP干預組小鼠SP及MLN單細胞懸液中 Th1/Tc1細胞亞群呈同步降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3　各組小鼠SP及MLN單細胞懸液中Th1/Tc1細胞亞群檢測結果比較（±s，%）

表3　各組小鼠SP及MLN單細胞懸液中Th1/Tc1細胞亞群檢測結果比較（±s，%）

注：與乙醇對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01。

組別n SP Th1細胞　Tc1細胞MLN Th1細胞　Tc1細胞乙醇對照組模型組EP干預組1.07±0.35 4.42±0.62a2.42±0.25c5 5 5 1.83±0.48 5.54±0.79a3.15±0.56c1.21±0.25 3.47±0.51a1.82±0.25b0.81±0.25 2.66±0.36a1.23±0.23b

2.5各組小鼠結腸組織勻漿上清液中HMGB1及IFN-γ水平比較與乙醇對照組比較，模型組小鼠結腸組織勻漿上清液中HMGB1及IFN-γ水平均顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，EP干預組小鼠結腸組織勻漿上清液中HMGB1及IFN-γ水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4　各組小鼠結腸組織勻漿上清液中HMGB1及IFN-γ水平比較（±s）

表4　各組小鼠結腸組織勻漿上清液中HMGB1及IFN-γ水平比較（±s）

注：與乙醇對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05。

組別乙醇對照組模型組EP干預組n IFN-γ（pg/mL）HMGB1（ng/mL）5 5 5 115.94±23.58 388.62±24.72a254.20±36.43b0.18±0.02 0.41±0.05a0.23±0.03b

3　討　論

HMGB1是20世紀70年代在小牛胸腺中鑒定得到的一種核內(nèi)非組蛋白染色體結合蛋白，因其在凝膠電泳中遷移率快而得名［10］。HMGB1通常主要位于細胞核內(nèi)，但在一些免疫細胞活化或?qū)嵸|(zhì)細胞損傷、死亡時，核內(nèi)的HMGB1即可主動或被動釋放至細胞質(zhì)乃至細胞外，一旦進入細胞外即可作為一種重要的炎性細胞因子，在膿毒癥、急性胰腺炎、類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等重癥炎癥及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用［11-12］。有研究發(fā)現(xiàn)，IBD小鼠血清及結腸組織中HMGB1明顯升高，結腸黏膜病理損傷嚴重；而HMGB1中和抗體或其抑制劑——EP的應用可以明顯減輕腸道炎性反應［5-6］。提示HMGB1與IBD的發(fā)病密切相關，HMGB1可能成為IBD治療的新靶點。

根據(jù)T淋巴細胞表面分化抗原的不同，可將其分為CD4+細胞和CD8+細胞亞群。前者又稱為Th細胞，后者又稱為Tc細胞。Th1細胞屬于CD4+細胞的一個亞群，以分泌IFN-γ為特征，Th1細胞過度反應可導致遲發(fā)性超敏反應和多種自身免疫性疾病。與Th細胞分化相似，1995年Sad等［13］將能分泌Th1型細胞因子的CD8+T細胞命名為Tc1。在很多情況下，由于Tc1和Th1功能相關，因而常會把Tc1細胞也稱為Th1樣細胞。有研究表明，Tc1亞群可通過分泌Th1型細胞因子在某些炎癥及自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［14］。本研究采用TNBS/乙醇誘導的小鼠結腸炎模型，其腸道組織學變化趨向于人類的CD，引發(fā)以Th1型為主的免疫炎性反應［1］?，F(xiàn)已基本明確，HMGB1可作為內(nèi)源性免疫佐劑通過與APC表面的受體結合，參與Th1 CD4+T細胞的分化調(diào)控［3］。然而，HMGB1調(diào)控Th1/Tc1細胞反應是否參與了TNBS結腸炎小鼠的致病，目前仍鮮見相關報道。因此，本研究以TNBS灌腸誘導小鼠結腸炎為模型，應用HMGB1抑制劑——EP進行體內(nèi)干預，探索CD發(fā)病中HMGB1對Th1/Tc1細胞的調(diào)控作用。結果發(fā)現(xiàn)，TNBS灌腸1周后，模型組小鼠結腸組織病理損傷嚴重，其DAI評分、TDI評分均顯著高于乙醇對照組；ELISA法檢測結果顯示，血清及結腸組織中HMGB1、Th1型細胞因子——IFN-γ表達水平均明顯升高；SP和MLN中Th1/Tc1細胞也同比升高，提示HMGB1與Th1/Tc1細胞反應均參與介導了CD小鼠的發(fā)病過程，與文獻報道一致［15-16］。為了驗證HMGB1可能是通過調(diào)控Th1/Tc1細胞反應參與TNBS結腸炎小鼠致病，本研究進一步應用HMGB1抑制劑——EP進行體內(nèi)干預，結果發(fā)現(xiàn)，結腸炎小鼠血清和結腸組織中HMGB1水平降低的同時，還伴隨結腸病理損傷的明顯減輕，SP、MLN中Th1/Tc1細胞下調(diào)，以及血清和結腸組織中IFN-γ水平降低。表明HMGB1確實能夠通過促進Th1/Tc1細胞反應參與TNBS結腸炎小鼠的致病。

綜上所述，本研究結果證實，HMGB1能夠通過促進Th1/Tc1細胞反應參與CD小鼠的發(fā)病過程。其具體機制可能是：IBD小鼠由于腸道免疫細胞過度活化，組織細胞損傷、壞死，使HMGB1主動或被動釋放增加，HMGB1可作為內(nèi)源性免疫激活劑通過活化APC并促使其分泌Th1/Tc1細胞的誘導因子——IFN-γ或白介素-12等，在其作用下，Th1/Tc1細胞大量活化、功能亢進，進而通過介導炎癥瀑布反應直接參與IBD的致病。

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Effects of HMGB1 expression level on Th1//Tc1 cellular response in experimental colitis mice*

Guo Xianghua1，Li Huahui1，Zhou Lian2，Luo Xia2，Dian Linghui1，Guo Runhua3△（1.College of Basic Medicine，Guangdong Medical University，Dongguan，Guangdong 523808，China；2.School of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou，Guangdong 510006，China；3.Department of Cadre′s Ward，411 Hospital of PLA，Shanghai 200081，China）

ObjectiveTo investigate the expression level of high-mobility group box 1 protein（HMGB1）on helper T1/ cytotoxic T cell 1（Th1/Tc1）in experimental colitis mice.MethodsThe BALB/c mice were randomly divided into ethanol control group，model group and ethyl pyruvate（EP）intervention group.The colitis model in the latter two groups was induced by the enema of 2，4，6-trinitro-benzene sulfonic acid（TNBS）.The disease activity index（DAI）score was daily evaluated.Mice were killed on 7 d after model construction.The colonic tissue pathological damage situation was observed.The flow cytometry was applied to examine the percentages of Th1//Tc1 cells in spleen as well as in mesenteric lymph nodes（MLN）.The blood and colonic tissue expression levels of HMGB1 and IFN-γ were measured by ELISA.ResultsThe DAI and microscopic histopathological damage score in the model group were significantly increased compared with the ethanol control group（P＜0.01）；meanwhile the levels of HMGB1 and IFN-γ in peripheral blood and colonic tissue and the percentages of Th1//Tc1 cells in spleen and MLN were significantly higher than those in the ethanol control group，the differences were statistically significant（P＜0.01）.After 1 week EP intervention，the HMGB1 level in serum and colonic tissue in the EP intervention group was significantly decreased，the DAI score was declined and microscopic histopathologic damage was obviously alleviated，the differences were statistically significant（P＜0.05）；with the percentage decrease of Th1/Tci cells in spleen and MLN，serum and colonic tissue IFN-γ expression was decreased，the difference was statistically significant（P＜0.01）.ConclusionHMGB1 may serve as the endogenous immunologic stimulant to induce and promote Th1/Tc1 cell hyperreaction，thus involves in pathogenesis of experimental colitis mice.

Colitis；HMGB1 protein；Th1 cells；T-lymphocytes，cytotoxic；Interferon typeⅡ；Trinitrobenzenesulfonic acid；Mice

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.13.007

A

1009-5519（2016）13-1973-03

中央財政支持地方高校發(fā)展專項資金資助項目［276（2014）］；廣東省科技計劃項目（2014A020212457）；廣東省中醫(yī)藥局科研基金資助項目（20132209）；廣東醫(yī)科大學博士啟動基金資助項目（2XB13094）。

郭向華（1972-），博士研究生，講師，主要從事炎癥免疫性疾病的免疫藥理研究。

△，E-mail：370291797@qq.com。

（2016-04-13）