林　牧，龔亞東，高紹瑩，田　進(jìn)，何　健，馬慶慶（貴州航天醫(yī)院中心實驗室，貴州遵義563000）

實時定量聚合酶鏈反應(yīng)在肺結(jié)核早期診斷中的價值

林牧，龔亞東，高紹瑩，田進(jìn)，何健，馬慶慶△
（貴州航天醫(yī)院中心實驗室，貴州遵義563000）

目的探討實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RQ-PCR）在肺結(jié)核早期診斷中的價值及對結(jié)核分枝桿菌檢出率較抗酸染色的優(yōu)勢。方法收集2015年7～8月疑似結(jié)核患者痰液標(biāo)本191份，分別采用RQ-PCR和抗酸染色檢測標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌并進(jìn)行比較。結(jié)果RQ-PCR檢測陽性率［27.75%（53/191）］顯著高于抗酸染色［9.95%（19/191）］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.43，P＜0．01）；RQ-PCR檢測靈敏度、約登指數(shù)較抗酸染色高，抗酸染色檢測特異性較RQ-PCR高，綜合各項指標(biāo)以RQ-PCR較好。結(jié)論RQ-PCR對結(jié)核分枝桿菌的檢測具有高特異性、靈敏度及快速、簡便等特點，在肺結(jié)核早期診斷中具有很好的參考價值，可作為診斷肺結(jié)核的常規(guī)方法，適合在臨床推廣應(yīng)用。

聚合酶鏈反應(yīng)；結(jié)核，肺/診斷；染色與標(biāo)記；早期診斷

肺結(jié)核是因結(jié)核分枝桿菌侵入肺部所致的慢性傳染性疾病，在結(jié)核感染中最為常見［1］。世界衛(wèi)生組織評估結(jié)果顯示，目前我國結(jié)核病發(fā)病人數(shù)約為每年130萬人次，占全球總發(fā)病人數(shù)的14%左右，仍位居全球第2位［2］。檢查肺結(jié)核的手段較多，常見為痰結(jié)核分枝桿菌涂片、抗酸染色、結(jié)核菌素試驗、影像學(xué)檢查、改良羅氏痰培養(yǎng)鑒定等，其中以抗酸染色臨床應(yīng)用較普遍，但其靈敏度較低，故對臨床應(yīng)用產(chǎn)生較大影響［3］。實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（real time quantitative-polymerase chain reaction，RQ-PCR）20世紀(jì)90年代被應(yīng)用于臨床結(jié)核診斷，隨著分子診斷學(xué)的發(fā)展，RQ-PCR在結(jié)核早期診斷中具有較高靈敏度、特異性及簡便、快速等特點［4］。本研究采用RQ-PCR與痰涂片抗酸染色對191例疑似結(jié)核患者痰液標(biāo)本的診斷結(jié)果進(jìn)行了比較分析，旨在探究RQ-PCR在肺結(jié)核早期診斷中的價值和臨床應(yīng)用意義。

1　資料與方法

1．1資料

1.1.1標(biāo)本來源收集2015年7～8月送至本實驗室的191例疑似結(jié)核患者痰液標(biāo)本。所有標(biāo)本均用密封痰盒存放保存并在24 h內(nèi)檢測。

1.1.2儀器與試劑7500型RQ-PCR儀（美國ABI公司）、質(zhì)控品［廈門泰普生物科學(xué)（中國）有限公司］、結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒（RQ-PCR）等。

1．2方法對臨床送檢的同一例肺科疑似結(jié)核患者的合格標(biāo)本分別采用抗酸染色和RQ-PCR進(jìn)行檢測。

1.2.1抗酸染色依據(jù)中國結(jié)核病防治規(guī)劃，即《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》的要求進(jìn)行檢測。陽性結(jié)果為1+～4+。

1.2.2RQ-PCR（1）準(zhǔn)備八連管，每孔加入PCR反應(yīng)液44 μL、Taq酶1 μL，-20℃保存?zhèn)溆?。?）根據(jù)痰液標(biāo)本具體情況加入4%氫氧化鈉，一般為痰液體積的2～4倍；密閉后搖動混勻，室溫存放過夜以便痰液充分液化；次日取1 mL液化后痰液標(biāo)本至去酶的1．5 mL離心管內(nèi)，13 000 r/min離心10 min后棄上清液；沉淀中加無菌生理鹽水1 mL左右，混勻洗滌后13 000 r/min離心10 min，再用無菌生理鹽水重復(fù)洗滌1次并離心；向沉淀中加50 μL DNA提取液，混勻后瞬離；100℃金屬浴15 min后13 000 r/min離心10 min；取上清液5 μL加至預(yù)先分裝好反應(yīng)體系的八連管中（含反應(yīng)液及Taq酶共45 μL），配制為50 μL反應(yīng)體系，采用RQ-PCR儀進(jìn)行檢測。（3）取陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品各50μL，再加入等量DNA提取液，震蕩混勻后瞬離；100℃金屬浴10min后13000r/min離心10 min；取上清液5 μL加至預(yù)先分裝好反應(yīng)體系的八連管中（含反應(yīng)液及Taq酶共45 μL），配制為50 μL反應(yīng)體系，采用RQ-PCR儀進(jìn)行檢測。（4）PCR擴(kuò)增，以37℃2 min，94℃2 min，94℃15 s至55℃45 s擴(kuò)增40個循環(huán)，熒光信號收集設(shè)置為55℃。實驗結(jié)果根據(jù)檢測試劑盒說明書結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析。評價2種方法診斷早期肺結(jié)核的靈敏度、特異性及約登指數(shù)。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS17．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.12種方法檢測結(jié)果比較191例肺科疑似結(jié)核患者痰液標(biāo)本RQ-PCR檢測陽性率［27.75%（53/191）］顯著高于抗酸染色［9.95%（19/191）］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 1.43，P＜0．01）；2種方法檢測均為陽性19例，均為陰性138例，見表1。

表1　2種方法檢測結(jié)果比較（n）

2.2方法學(xué)評價結(jié)果RQ-PCR檢測靈敏度為100.00%、特異性為72.25%，抗酸染色檢測靈敏度為35.85%，特異性為100.00%；RQ-PCR檢測的約登指數(shù)為0.723，抗酸染色檢測的約登指數(shù)為0.358，見表2。

表2　方法學(xué)評價結(jié)果

2.3Taq酶探針RQ-PCR檢測陽性標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增曲線處除未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增的陰性對照曲線外大致分為3種形態(tài)：（1）Ct值從12開始上揚(yáng)的曲線，形狀呈標(biāo)準(zhǔn)的“S”形，說明該樣本中含有的結(jié)核分枝桿菌數(shù)量很多；（2）Ct值從22～26區(qū)間開始上揚(yáng)的曲線，形狀基本呈“S”形，說明該樣本中含有的結(jié)核分枝桿菌數(shù)量較多；（3）Ct值從30開始上揚(yáng)的曲線，形狀暫無法看出呈現(xiàn)“S”形，但若再經(jīng)過數(shù)個循環(huán)后便會出現(xiàn)“S”形曲線，說明該樣本中含有一定數(shù)量的結(jié)核分枝桿菌，能診斷為肺結(jié)核陽性，見圖1。

圖1　Taq酶探針RQ-PCR檢測陽性標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3　討　論

我國結(jié)核分枝桿菌感染率一直保持較高水平，其中以肺結(jié)核多見，是一種較為常見的傳染?。?］。隨抗生素的濫用結(jié)核呈現(xiàn)出多重耐藥性、高度傳染性及治療困難性等，導(dǎo)致肺結(jié)核成為全球性嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。肺結(jié)核傳統(tǒng)診斷方法為直接涂片抗酸染色檢查結(jié)核分枝桿菌；抗酸染色優(yōu)點是成本較低、簡便、快速，幾小時便可獲取檢測結(jié)果，尤其適于基層醫(yī)院的結(jié)核診斷；但其缺點也很多，如無法區(qū)別結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌；其中最大的缺點是靈敏度低，檢測結(jié)核分枝桿菌時需含菌量為5 000～10 000 cfu/mL才能檢出，對痰液中含菌量少的肺結(jié)核患者其靈敏度就更低，極易造成誤診，加大用藥錯誤的風(fēng)險［6-7］。RQ-PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光探針，利用熒光信號積累計算Ct值，從而測定核酸量；通過Taq酶5′～3′外切酶選取結(jié)核分枝桿菌的基因保守片段擴(kuò)增，因不受細(xì)胞表型影響而特異性較高［8］?；驍U(kuò)增后目標(biāo)核酸片段放大百萬倍，使其具有極高的靈敏度；整個過程在全封閉狀態(tài)下進(jìn)行，有效避免了擴(kuò)增產(chǎn)物污染導(dǎo)致的假陽性情況。同時高度的重復(fù)性和快速性使其具有一定的臨床應(yīng)用優(yōu)勢，只需2 h左右即可完成檢測，特別適合結(jié)核分枝桿菌這類生長緩慢細(xì)菌的檢測［9-10］。

本實驗采用RQ-PCR、抗酸染色對比分析了191例肺科疑似結(jié)核患者的痰標(biāo)本，結(jié)果表明，RQ-PCR檢測陽性率（27.75%）顯著高于抗酸染色（9.95%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）；RQ-PCR法檢測的靈敏度為100.00%、特異性為72.25%，抗酸染色檢測的靈敏度為35.85%、特異性為100.00%，說明RQ-PCR敏感度高，可提高結(jié)核分枝桿菌檢出率，與國外其他研究結(jié)果基本一致［10］。約登指數(shù)是評價篩查試驗真實性的方法，表示篩檢方法發(fā)現(xiàn)真正的患者與非患者的總能力，指數(shù)越大說明篩查實驗的效果越好，真實性越大［11］。本研究結(jié)果顯示，RQ-PCR檢測的約登指數(shù)為0.723，抗酸染色檢測的約登指數(shù)為0.358。本研究只用陰、陽性表示結(jié)果，實際上RQ-PCR可做到相對定量檢測（圖1），其定量檢測結(jié)果可指導(dǎo)臨床用藥、評估療效、提供診斷和篩選指標(biāo)。但由于使用4%氫氧化鈉對痰液標(biāo)本進(jìn)行液化時無固定的加入量，所得到的定量結(jié)果是不準(zhǔn)確的，故本研究只對定性結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計分析。

綜上所述，作者認(rèn)為，RQ-PCR具有較高的靈敏度和特異性，具有快速、敏感、操作簡便等特點，且RQ-PCR檢出陽性率更高，其定量結(jié)果可指導(dǎo)臨床用藥和評估療效，用于結(jié)核病的快速診治更具有積極意義，可作為肺結(jié)核診斷的常規(guī)方法。

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1009-5519（2016）06-0906-03

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（2015-11-12）