林　牧，龔亞?wèn)|，高紹瑩，田　進(jìn)，何　健，馬慶慶（貴州航天醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義563000）

實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)在肺結(jié)核早期診斷中的價(jià)值

林牧，龔亞?wèn)|，高紹瑩，田進(jìn)，何健，馬慶慶△
（貴州航天醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義563000）

目的探討實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RQ-PCR）在肺結(jié)核早期診斷中的價(jià)值及對(duì)結(jié)核分枝桿菌檢出率較抗酸染色的優(yōu)勢(shì)。方法收集2015年7～8月疑似結(jié)核患者痰液標(biāo)本191份，分別采用RQ-PCR和抗酸染色檢測(cè)標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌并進(jìn)行比較。結(jié)果RQ-PCR檢測(cè)陽(yáng)性率［27.75%（53/191）］顯著高于抗酸染色［9.95%（19/191）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.43，P＜0．01）；RQ-PCR檢測(cè)靈敏度、約登指數(shù)較抗酸染色高，抗酸染色檢測(cè)特異性較RQ-PCR高，綜合各項(xiàng)指標(biāo)以RQ-PCR較好。結(jié)論RQ-PCR對(duì)結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)具有高特異性、靈敏度及快速、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，在肺結(jié)核早期診斷中具有很好的參考價(jià)值，可作為診斷肺結(jié)核的常規(guī)方法，適合在臨床推廣應(yīng)用。

聚合酶鏈反應(yīng)；結(jié)核，肺/診斷；染色與標(biāo)記；早期診斷

肺結(jié)核是因結(jié)核分枝桿菌侵入肺部所致的慢性傳染性疾病，在結(jié)核感染中最為常見(jiàn)［1］。世界衛(wèi)生組織評(píng)估結(jié)果顯示，目前我國(guó)結(jié)核病發(fā)病人數(shù)約為每年130萬(wàn)人次，占全球總發(fā)病人數(shù)的14%左右，仍位居全球第2位［2］。檢查肺結(jié)核的手段較多，常見(jiàn)為痰結(jié)核分枝桿菌涂片、抗酸染色、結(jié)核菌素試驗(yàn)、影像學(xué)檢查、改良羅氏痰培養(yǎng)鑒定等，其中以抗酸染色臨床應(yīng)用較普遍，但其靈敏度較低，故對(duì)臨床應(yīng)用產(chǎn)生較大影響［3］。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real time quantitative-polymerase chain reaction，RQ-PCR）20世紀(jì)90年代被應(yīng)用于臨床結(jié)核診斷，隨著分子診斷學(xué)的發(fā)展，RQ-PCR在結(jié)核早期診斷中具有較高靈敏度、特異性及簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)［4］。本研究采用RQ-PCR與痰涂片抗酸染色對(duì)191例疑似結(jié)核患者痰液標(biāo)本的診斷結(jié)果進(jìn)行了比較分析，旨在探究RQ-PCR在肺結(jié)核早期診斷中的價(jià)值和臨床應(yīng)用意義。

1　資料與方法

1．1資料

1.1.1標(biāo)本來(lái)源收集2015年7～8月送至本實(shí)驗(yàn)室的191例疑似結(jié)核患者痰液標(biāo)本。所有標(biāo)本均用密封痰盒存放保存并在24 h內(nèi)檢測(cè)。

1.1.2儀器與試劑7500型RQ-PCR儀（美國(guó)ABI公司）、質(zhì)控品［廈門泰普生物科學(xué)（中國(guó)）有限公司］、結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒（RQ-PCR）等。

1．2方法對(duì)臨床送檢的同一例肺科疑似結(jié)核患者的合格標(biāo)本分別采用抗酸染色和RQ-PCR進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.1抗酸染色依據(jù)中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃，即《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》的要求進(jìn)行檢測(cè)。陽(yáng)性結(jié)果為1+～4+。

1.2.2RQ-PCR（1）準(zhǔn)備八連管，每孔加入PCR反應(yīng)液44 μL、Taq酶1 μL，-20℃保存?zhèn)溆?。?）根據(jù)痰液標(biāo)本具體情況加入4%氫氧化鈉，一般為痰液體積的2～4倍；密閉后搖動(dòng)混勻，室溫存放過(guò)夜以便痰液充分液化；次日取1 mL液化后痰液標(biāo)本至去酶的1．5 mL離心管內(nèi)，13 000 r/min離心10 min后棄上清液；沉淀中加無(wú)菌生理鹽水1 mL左右，混勻洗滌后13 000 r/min離心10 min，再用無(wú)菌生理鹽水重復(fù)洗滌1次并離心；向沉淀中加50 μL DNA提取液，混勻后瞬離；100℃金屬浴15 min后13 000 r/min離心10 min；取上清液5 μL加至預(yù)先分裝好反應(yīng)體系的八連管中（含反應(yīng)液及Taq酶共45 μL），配制為50 μL反應(yīng)體系，采用RQ-PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。（3）取陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品各50μL，再加入等量DNA提取液，震蕩混勻后瞬離；100℃金屬浴10min后13000r/min離心10 min；取上清液5 μL加至預(yù)先分裝好反應(yīng)體系的八連管中（含反應(yīng)液及Taq酶共45 μL），配制為50 μL反應(yīng)體系，采用RQ-PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。（4）PCR擴(kuò)增，以37℃2 min，94℃2 min，94℃15 s至55℃45 s擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)收集設(shè)置為55℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析。評(píng)價(jià)2種方法診斷早期肺結(jié)核的靈敏度、特異性及約登指數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.12種方法檢測(cè)結(jié)果比較191例肺科疑似結(jié)核患者痰液標(biāo)本RQ-PCR檢測(cè)陽(yáng)性率［27.75%（53/191）］顯著高于抗酸染色［9.95%（19/191）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 1.43，P＜0．01）；2種方法檢測(cè)均為陽(yáng)性19例，均為陰性138例，見(jiàn)表1。

表1　2種方法檢測(cè)結(jié)果比較（n）

2.2方法學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果RQ-PCR檢測(cè)靈敏度為100.00%、特異性為72.25%，抗酸染色檢測(cè)靈敏度為35.85%，特異性為100.00%；RQ-PCR檢測(cè)的約登指數(shù)為0.723，抗酸染色檢測(cè)的約登指數(shù)為0.358，見(jiàn)表2。

表2　方法學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3Taq酶探針RQ-PCR檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增曲線處除未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增的陰性對(duì)照曲線外大致分為3種形態(tài)：（1）Ct值從12開(kāi)始上揚(yáng)的曲線，形狀呈標(biāo)準(zhǔn)的“S”形，說(shuō)明該樣本中含有的結(jié)核分枝桿菌數(shù)量很多；（2）Ct值從22～26區(qū)間開(kāi)始上揚(yáng)的曲線，形狀基本呈“S”形，說(shuō)明該樣本中含有的結(jié)核分枝桿菌數(shù)量較多；（3）Ct值從30開(kāi)始上揚(yáng)的曲線，形狀暫無(wú)法看出呈現(xiàn)“S”形，但若再經(jīng)過(guò)數(shù)個(gè)循環(huán)后便會(huì)出現(xiàn)“S”形曲線，說(shuō)明該樣本中含有一定數(shù)量的結(jié)核分枝桿菌，能診斷為肺結(jié)核陽(yáng)性，見(jiàn)圖1。

圖1　Taq酶探針RQ-PCR檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3　討　論

我國(guó)結(jié)核分枝桿菌感染率一直保持較高水平，其中以肺結(jié)核多見(jiàn)，是一種較為常見(jiàn)的傳染?。?］。隨抗生素的濫用結(jié)核呈現(xiàn)出多重耐藥性、高度傳染性及治療困難性等，導(dǎo)致肺結(jié)核成為全球性嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題。肺結(jié)核傳統(tǒng)診斷方法為直接涂片抗酸染色檢查結(jié)核分枝桿菌；抗酸染色優(yōu)點(diǎn)是成本較低、簡(jiǎn)便、快速，幾小時(shí)便可獲取檢測(cè)結(jié)果，尤其適于基層醫(yī)院的結(jié)核診斷；但其缺點(diǎn)也很多，如無(wú)法區(qū)別結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌；其中最大的缺點(diǎn)是靈敏度低，檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌時(shí)需含菌量為5 000～10 000 cfu/mL才能檢出，對(duì)痰液中含菌量少的肺結(jié)核患者其靈敏度就更低，極易造成誤診，加大用藥錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)［6-7］。RQ-PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光探針，利用熒光信號(hào)積累計(jì)算Ct值，從而測(cè)定核酸量；通過(guò)Taq酶5′～3′外切酶選取結(jié)核分枝桿菌的基因保守片段擴(kuò)增，因不受細(xì)胞表型影響而特異性較高［8］?；驍U(kuò)增后目標(biāo)核酸片段放大百萬(wàn)倍，使其具有極高的靈敏度；整個(gè)過(guò)程在全封閉狀態(tài)下進(jìn)行，有效避免了擴(kuò)增產(chǎn)物污染導(dǎo)致的假陽(yáng)性情況。同時(shí)高度的重復(fù)性和快速性使其具有一定的臨床應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，只需2 h左右即可完成檢測(cè)，特別適合結(jié)核分枝桿菌這類生長(zhǎng)緩慢細(xì)菌的檢測(cè)［9-10］。

本實(shí)驗(yàn)采用RQ-PCR、抗酸染色對(duì)比分析了191例肺科疑似結(jié)核患者的痰標(biāo)本，結(jié)果表明，RQ-PCR檢測(cè)陽(yáng)性率（27.75%）顯著高于抗酸染色（9.95%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）；RQ-PCR法檢測(cè)的靈敏度為100.00%、特異性為72.25%，抗酸染色檢測(cè)的靈敏度為35.85%、特異性為100.00%，說(shuō)明RQ-PCR敏感度高，可提高結(jié)核分枝桿菌檢出率，與國(guó)外其他研究結(jié)果基本一致［10］。約登指數(shù)是評(píng)價(jià)篩查試驗(yàn)真實(shí)性的方法，表示篩檢方法發(fā)現(xiàn)真正的患者與非患者的總能力，指數(shù)越大說(shuō)明篩查實(shí)驗(yàn)的效果越好，真實(shí)性越大［11］。本研究結(jié)果顯示，RQ-PCR檢測(cè)的約登指數(shù)為0.723，抗酸染色檢測(cè)的約登指數(shù)為0.358。本研究只用陰、陽(yáng)性表示結(jié)果，實(shí)際上RQ-PCR可做到相對(duì)定量檢測(cè)（圖1），其定量檢測(cè)結(jié)果可指導(dǎo)臨床用藥、評(píng)估療效、提供診斷和篩選指標(biāo)。但由于使用4%氫氧化鈉對(duì)痰液標(biāo)本進(jìn)行液化時(shí)無(wú)固定的加入量，所得到的定量結(jié)果是不準(zhǔn)確的，故本研究只對(duì)定性結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。

綜上所述，作者認(rèn)為，RQ-PCR具有較高的靈敏度和特異性，具有快速、敏感、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，且RQ-PCR檢出陽(yáng)性率更高，其定量結(jié)果可指導(dǎo)臨床用藥和評(píng)估療效，用于結(jié)核病的快速診治更具有積極意義，可作為肺結(jié)核診斷的常規(guī)方法。

［1］張梅，焦祖?zhèn)?，聶渝瓊．我?guó)結(jié)核病診斷方法現(xiàn)狀與進(jìn)展［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011，21（12）：3018-3020．

［2］黃澤亮，桂福.FQ-PCR檢查痰中結(jié)核分枝桿菌對(duì)肺結(jié)核診斷的臨床價(jià)值［J］.中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志，2013，41（4）：389-391.

［3］桂靜，李金莉，王峰．熒光染色法與萋-尼氏抗酸染色法檢測(cè)痰液中抗酸桿菌的對(duì)比觀察［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2010，20（11）：3836-2837．

［4］Centers for Disease Control and Prevention（CDC）．Emergence of new norovirus strain GII.4 Sydney--United States，2012［J］.MMWR Morb Mortal Wkly Rep，2013，62（3）：55．

［5］曹冉冉，劉邦英，周子人，等.分子信標(biāo)熒光定量PCR在肺結(jié)核早期診斷及療效評(píng)價(jià)中的初步應(yīng)用［J］.中國(guó)防癆雜志，2012，34（2）：103-106.

［6］王成勇，吳河，王偉，等.PCT、HS-CRP和FIB檢測(cè)在肺結(jié)核治療中的意義［J］.臨床肺科雜志，2015，20（9）：1608-1610.

［7］童建林，饒常紅，黃渤.FQ-PCR檢測(cè)BALF中結(jié)核分枝桿菌-DNA對(duì)肺結(jié)核診斷的應(yīng)用研究［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2015，12（26）：66-67.

［8］李新旭，周曉農(nóng)，王黎霞．結(jié)核病空間分布特征及影響因素研究進(jìn)展［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2014，30（1）：102-106．

［9］Bennett S，MacLean A，Miller RS，et al．Increased norovirus activity in Scotland in 2012 is associated with the emergence of a new norovirus GII. 4 variant［J］.Euro Surveill，2013，18（2）：20349．

［10］Imani FA，Iman ID，Hosseini DR，et al．Design of a multiplex PCR method for detection of toxigenic-pathogenic in Vibrio cholerae［J］.Asian Pac J Trop Med，2013，6（2）：115-118．

［11］Tsao CH，Chen CC，Tsai SJ，et al．Seasonality，clinical types and prognostic factors of Vibrio vulnificus infection［J］.J Infect Dev Ctries，2013，7（7）：533-540．

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.06.040

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1009-5519（2016）06-0906-03

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（2015-11-12）