楊 丹，朱旭江，徐旭坤，姚世霞，趙建邦

·眼科疾病·

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定黃疸茵陳顆粒中黃芩苷等6種成分含量

楊 丹，朱旭江，徐旭坤，姚世霞，趙建邦

目的 建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定黃疸茵陳顆粒中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A、千層紙素A苷6種成分。方法 采用梯度洗脫，色譜柱XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm；柱溫30℃。結(jié)果 6種成分在40 min內(nèi)達(dá)到基線分離，6種成分的含量和各自峰面積之間有著良好的線性關(guān)系，精密度、重復(fù)性及加樣回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3.0%。結(jié)論 該法快捷、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，能同時(shí)測(cè)定黃疸茵陳顆粒中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A、千層紙素A苷6種成分的含量。

黃疸茵陳顆粒；黃芩苷；黃芩素；高效液相色譜法

［Abstract］Objective To establish high performance liquid chromatography（HPLC）method for the simultaneous determination of baicalin，baicalei，wogonoside，wogonin，oroxylin A and oroxylin A-glucoronide in Huangdan Yinchen Keli by HPLC.Methods HPLC was adopted by using an XB-C18column（4.6 mm×250 mm，5 μm）with methanol-0.1%phosphoric acid as the mobile phase.The flow rate was 1.0 mL/min and the sample size was 10 μL.The determine wave length was 278 nm and the column temperature was kept at 30℃.Results The six components in Huangdan Yinchen Keli reached baseline separation within 40 minutes.Their relationship between the concentration and the peak areas was linear.The relative standard deviation（RSD）of repeatability，precision and recovery were all less than 3.0%.Conclusion This method is rapid，simple，reliable and it can simultaneously measure the content of baicalin，baicalei，wogonoside，wogonin，and oroxylin A，oroxylin A-glucoronide in Huangdan Yinchen Keli.

［Key words］Huangdan Yinchen Keli；Baicalin；Baicalei；High performance liquid chromatography（HPLC）

黃疸茵陳顆粒是由茵陳、黃芩、大黃、甘草4味中藥經(jīng)提取制成的顆粒制劑，具有清熱利濕、祛退黃疸的功效［1］，收載于藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第4冊(cè)［2］?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅有化學(xué)鑒別項(xiàng)，無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)，為了更有效地控制及綜合評(píng)價(jià)該制劑的質(zhì)量，作者采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對(duì)黃疸茵陳顆粒中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A、千層紙素A苷［3-8］6種成分的含量進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1儀器與試藥

1.1.1儀器 Waters Alliance e2695型高效液相色譜儀、2998 Dual λ Absorbance Detector和Empower色譜工作站（美國(guó)Waters公司），賽多利斯R200D型分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］，KH300SP型超聲波提取設(shè)備（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.1.2試劑與試藥 對(duì)照品:黃芩苷（批號(hào)110715-201117，含量91.7%），漢黃芩苷（含量98.94%），黃芩素（批號(hào)111595-200604），漢黃芩素（批號(hào)111514-201304），均來(lái)源于中國(guó)藥品生物制品檢定所；千層紙素A（批號(hào)MUST-15010914，含量98.75%）來(lái)源于成都曼斯特生物科技有限公司；千層紙素A苷（含量＞98%）來(lái)源于成都瑞芬思生物科技有限公司。樣品，黃疸茵陳顆粒分別來(lái)自于A、B、C、D 4家藥廠）。甲醇為色譜純，水為純化水，其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1色譜條件 色譜柱 XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸［9-11］。梯度洗脫:0～25 min，40%～60%甲醇；25～30 min，60%～70%甲醇；30～35 min，70%～80%甲醇；35～40 min，80%～60%甲醇；40～45 min，60%～40%甲醇；45～52 min，40%甲醇。流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm［12］，柱溫30℃。

1.2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷對(duì)照品12.60 mg，加甲醇溶解并稀釋至50 mL，制成黃芩苷對(duì)照品溶液；精密稱取漢黃芩苷對(duì)照品10.89 mg，加甲醇溶解并稀釋至25 mL，制成漢黃芩苷對(duì)照品溶液；精密稱取黃芩素對(duì)照品9.70 mg，加甲醇溶解并稀釋至25 mL，制成黃芩素對(duì)照品溶液；精密稱取漢黃芩素對(duì)照品6.59 mg，加甲醇溶解并稀釋至25 mL，制成漢黃芩素對(duì)照品溶液；精密稱取千層紙素A對(duì)照品7.96 mg，加甲醇溶解并稀釋至25 mL，制成千層紙素A對(duì)照品溶液；精密稱取千層紙素A苷對(duì)照品4.64 mg，加甲醇溶解并稀釋至25 mL，制成千層紙素A苷對(duì)照品溶液。分別取上述黃芩苷對(duì)照品溶液3 mL，漢黃芩苷對(duì)照品溶液1 mL，黃芩素對(duì)照品溶液1 mL，漢黃芩素對(duì)照品溶液1 mL，千層紙素A對(duì)照品溶液1 mL，千層紙素A苷對(duì)照品溶液1 mL，置于同一50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得混合對(duì)照品溶液。

1.2.3供試品溶液的制備 取本品裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，取1 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇 70 mL，超聲30 min（頻率 100 Hz），放冷至室溫，加甲醇，稀釋至刻度，搖勻，即得［13-16］。

1.2.4陰性樣品溶液制備 模擬黃疸茵陳顆粒的工藝制法，自制缺黃芩的陰性樣品溶液。

1.2.5線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 μL，按色譜條件，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。分別以各成分的色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A、千層紙素A苷的回歸方程。

1.2.6精密度實(shí)驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，測(cè)定，計(jì)算各成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按色譜條件，分別在0、4、8、12、18、24 h各進(jìn)樣1次，每次10 μL，測(cè)定各成分色譜峰峰面積積分值，計(jì)算各成分峰面積的RSD。

1.2.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)黃疸茵陳顆粒樣品（批號(hào)150401），平行操作制作6份供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積，計(jì)算黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A、千層紙素A苷的平均含量（n=6），計(jì)算各成分峰面積的RSD。

1.2.9加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液，黃芩苷2.2 mL、漢黃芩苷0.8 mL、黃芩素0.8 mL、漢黃芩素0.4 mL、千層紙素A 0.4 mL和千層紙素A 苷0.8 mL，采用氮吹儀吹干，再分別精密稱取已知含量同一批號(hào)的黃疸菌陳顆粒樣品（批號(hào)150401）0.5 g平行操作6份，制備供試品溶液。分別進(jìn)樣，測(cè)定，計(jì)算各成分回收率。

1.2.10樣品測(cè)定 取各批黃疸茵陳顆粒樣品，制備供試品溶液，進(jìn)樣，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算各樣品中各成分的含量。

2 結(jié)果

2.1黃疸茵陳顆粒的HPLC色譜圖 見(jiàn)圖1。

圖1　黃疸茵陳顆粒HPLC色譜圖

2.2線性關(guān)系考察各成分線性回歸方程 見(jiàn)表1。

表1　線性方程

2.3精密度與穩(wěn)定性 黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A、千層紙素A苷的精密度與穩(wěn)定性RSD值分別為0.28%、0.36%、0.72%、0.69%、0.25%、0.81%與 0.55%、0.75%、0.76%、1.15%、0.80%、1.39%。

2.4重復(fù)性 黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A、千層紙素A苷的平均含量分別為1.758、0.151、0.606、0.458、0.043、0.204 mg/g，其RSD值分別為1.02%、2.16%、1.11%、1.11%、2.13%、1.48%。

2.5加樣回收率 各成分回收率見(jiàn)表2。

表2　各成分回收率試驗(yàn)（n=6）

2.6各批黃疸茵陳顆粒樣品中6種成分的含量測(cè)定 見(jiàn)表3。

表3　各批黃疸茵陳顆粒中6種成分的含量

3 討論

黃芩作為黃疸茵陳顆粒中的臣藥，具有助主藥清肝利膽祛濕之效，黃芩主要有效成分為黃酮類化合物包括黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素［17］、黃芩新素、千層紙素A、千層紙素A苷、黃芩黃酮Ⅰ。黃酮類成分具有解熱、保肝利膽、鎮(zhèn)靜、降壓降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧自由基損傷功效［18］。漢黃芩苷、黃芩素具有抗菌、抗病毒之效。黃芩苷、漢黃芩素具有抗炎之效。因此，能建立一種方法同時(shí)測(cè)定黃疸茵陳顆粒制劑黃芩中多種有效成分的含量顯得尤為重要。

本實(shí)驗(yàn)建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定黃疸茵陳顆粒中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A、千層紙素A苷6種成分的含量，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示，本法精密度良好、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好，方法可行；且本法具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可作為黃疸茵陳顆粒質(zhì)量的控制指標(biāo)之一。本法的確立對(duì)于全面且綜合評(píng)價(jià)黃疸茵陳顆粒制劑的質(zhì)量具有重要意義。

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Simultaneous determination of six components such as baicalin in Huangdan Yinchen Keli by high performance liquid chromatography

YANG Dan1，ZHU Xujiang2，XU Xukun1，YAO Shixia2，ZHAO Jianbang2
（1.College of Pharmacy，Lanzhou University，Lanzhou Ganshu 730000，China；2.Gansu Institute for Drug Control，Lanzhou Ganshu 730070，China）

R282.5

A

2095-3097（2016）04-0206-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2016.04.004

2015年國(guó)家藥品計(jì)劃抽驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)完善專題（中成藥）第15號(hào)

730000甘肅蘭州，蘭州大學(xué)藥學(xué)院（楊 丹，徐旭坤）；730070甘肅 蘭州，甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院（朱旭江，姚世霞，趙建邦）

（2016-04-09 本文編輯:徐海琴）