鄭志偉，趙樹林，楊鈺賢，朱輝德，朱志偉，陳 蕾

·基礎(chǔ)研究·

微小核糖核酸-21對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄富含半胱氨酸蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)研究

鄭志偉，趙樹林，楊鈺賢，朱輝德，朱志偉，陳 蕾

目的 探討乳腺癌MCF-7細(xì)胞中微小核糖核酸-21（microRNA-21，miR-21）對(duì)反轉(zhuǎn)錄富含半胱氨酸蛋白（reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs，RECK）表達(dá)的調(diào)控作用。方法 將miR-21模擬物、miR-21抑制物及模擬物陰性對(duì)照、抑制物陰性對(duì)照各組瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞中，48 h后通過熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)miR-21在細(xì)胞的表達(dá)情況，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后RECK表達(dá)水平變化。結(jié)果 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，miR-21抑制物組和miR-21模擬物組miR-21的表達(dá)分別與轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），轉(zhuǎn)染miR-21抑制物組miR-21的表達(dá)明顯下降，轉(zhuǎn)染miR-21模擬物組miR-21的表達(dá)明顯上調(diào)；細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21各組后RECK表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），miR-21抑制物組相對(duì)其陰性對(duì)照組，RECK表達(dá)明顯上升（P＜0.001）；miR-21模擬物組相對(duì)其陰性對(duì)照組，RECK表達(dá)明顯下降（P＜0.001）。結(jié)論miR-21可以抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞RECK表達(dá)，可能成為判斷乳腺癌患者預(yù)后的評(píng)價(jià)指標(biāo)及腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

乳腺癌；微小核糖核酸-21；反轉(zhuǎn)錄富含半胱氨酸蛋白

［Abstract］Objective To explore the effects of microRNA-21（miR-21）on the expression of reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs（RECK）in MCF-7 cells.Methods

MCF-7 cells were cultured in vitro and transfected with miR-21 mimics and miR-21 inhibitor by cationic-mediated transfected.The total RNA and protein were extracted from the culture cells after transfected forty-eight hours.The expression of miR-21 and RECK levels were detected by fluorescent quantitative PCR and Western blotting.Results The miR-21 expression was significantly changed after forty-eight hours transfected（P＜0.001），miR-21 expression decreased significantly in miR-21 inhibitor group while miR-21 expression increased significantly in miR-21 mimics group. The RECK was significantly changed after transfected（P＜0.001），RECK expression increased significantly in miR-21 inhibitor group（P＜0.001）while RECK expression decreased significantly in miR-21 mimics group（P＜0.001）.Conclusion miR-21 can inhibit the expression of RECK in breast cancer cells，and it may be a new target to judge the prognosis of breast cancer patients and the new target of tumor therapy.

［Key words］Breast cancer；MicroRNA-21（miR-21）；Reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs（RECK）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。城市地區(qū)女性乳腺癌每年新發(fā)病例約15.8萬，占全部女性癌癥發(fā)病的19.47%，發(fā)病率為46.74/10萬，位居女性腫瘤發(fā)病之首。2011年中國女性乳腺癌發(fā)病人數(shù)約24.9萬，發(fā)病率37.86/10萬，近10年乳腺癌病死率呈上升趨勢(shì)［1］。微小核糖核酸-21（microRNA-21，miR-21）是miRNAs家族成員之一，miR-21高表達(dá)與乳腺癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤等惡性行為具有正相關(guān)性，因而進(jìn)一步開展miR-21對(duì)乳腺癌分子生物學(xué)調(diào)控的研究。通過生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測(cè)，反轉(zhuǎn)錄富含半胱氨酸蛋白（reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs，RECK）基因有可能是其調(diào)節(jié)的靶基因之一。RECK基因是一種新型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)，RECK基因作為新型的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，能夠有效地抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移［2-3］。有臨床研究進(jìn)一步證明，RECK基因表達(dá)水平的高低與許多惡性腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)［4］。盡管生物信息學(xué)分析提示miR-21對(duì)RECK基因的表達(dá)可能有調(diào)控作用，但兩者間的明確關(guān)系目前尚鮮見報(bào)道。因此，本研究擬通過在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中上調(diào)和下調(diào)miR-21表達(dá)，觀察miR-21 對(duì)RECK表達(dá)的影響，明確miR-21對(duì)RECK表達(dá)的調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究miR-21調(diào)控的靶基因及其生物學(xué)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基［Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM，賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司］，胎牛血清（美國Invitrogen公司），胰酶（杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司），miR-21引物（蘇州吉瑪基因股份有限公司），Trizol試劑（美國 Invitrogen公司），Prime-Script反轉(zhuǎn)錄試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］，SYBR?Premix［天根生化科技（北京）有限公司］，胰蛋白酶乙二胺四乙酸溶液（0.05%胰蛋白酶+ 0.1 mmol/L乙二胺四乙酸，美國HyClone公司），Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen公司），聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠配置試劑盒（江蘇碧云天公司），蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（德國Thermo公司），牛血清白蛋白（美國Sigma-Aldrich公司），細(xì)胞總蛋白裂解試劑盒（德國Thermo公司），Bradford法蛋白定量試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］，miR-21抑制物、miR-21模擬物（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），RECK一抗（美國ProteinTech公司），β-肌動(dòng)蛋白一抗（美國Millipoer公司），異硫氰酸熒光素標(biāo)志二抗（抗兔，美國Immunology Consultants Laboratory，Inc），X線片顯影液、定影液（上海冠龍照相器材公司）。超凈工作臺(tái)（美國Nuaire公司），6孔板、培養(yǎng)瓶、凍存管（美國Corning Incorporated公司），倒置顯微鏡（日本Olympus公司），BP61電子天平（德國Sartorius），二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱（美國Thermo Electron Corporation），AvantiTM30低溫高速離心機(jī)（美國Beckman公司），普通聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（德國Eppendorf公司），Engine Opticon 2熒光定量儀（美國MJ Research公司），VE-180垂直電泳槽（上海天能科技有限公司），VE-186轉(zhuǎn)移電泳槽（上海天能科技有限公司），DY-B1脫色搖床（上海滬西儀器廠）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室凍存細(xì)胞庫中復(fù)蘇培養(yǎng)。細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞鋪滿瓶底80%～90%時(shí)進(jìn)行常規(guī)傳代。

磷酸鹽緩沖液漂洗后加入每瓶0.5 mL的0.25%胰酶，37℃孵育消化1min，用5mL沖洗培養(yǎng)基（DMEM 含5%胎牛血清）沖洗并終止消化，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，1 200 r/min，4℃離心5 min。細(xì)胞懸液按5× 105/mL置于6孔板中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到50%～70%融合時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1干擾序列設(shè)計(jì)合成 采用化學(xué)合成的miR-21抑制物和miR-21模擬物分別用于抑制和上調(diào)MCF-7細(xì)胞的miR-21的表達(dá)，觀察其對(duì)MCF-7細(xì)胞RECK的影響。RNA單鏈寡核苷酸由蘇州吉瑪基因股份有限公司化學(xué)合成。

miR-21抑制物序列:5′-UCAACAUCAGUCUGA UAAGCUA-3′；抑制物陰性對(duì)照序列:5′-CAGUACUU UUGUGUAGUACAA-3′；miR-21模擬物序列:正義鏈5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3′，反義鏈5′-AA CAUCAGUCUGAUAAGCUAUU-3′；模擬物陰性對(duì)照序列:正義鏈5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

1.2.2.2轉(zhuǎn)染效率檢測(cè) 轉(zhuǎn)染前1 d，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化，DMEM懸浮細(xì)胞至密度為1× 105/mL，鋪板于6孔板中，每孔1 mL，補(bǔ)加DMEM至2 mL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，6孔板換培養(yǎng)基，采用Lipofectamin2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染miR-21抑制物，按照表1進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，6 h后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并記錄。

表1　轉(zhuǎn)染劑量

1.2.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在熒光顯微鏡下觀察，20 pmol轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到70%以上，選擇20 pmol的miRNAs作為實(shí)驗(yàn)用量。分別將miR-21抑制物、抑制物陰性對(duì)照、miR-21模擬物、模擬物陰性對(duì)照各組轉(zhuǎn)染到6孔培養(yǎng)板MCF-7細(xì)胞中，未經(jīng)任何處理的為空白對(duì)照組。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后分別以Trizol試劑和蛋白裂解液提取細(xì)胞中總RNA和總蛋白。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)干擾后細(xì)胞miR-21的表達(dá)水平，采用參照基因△Ct法分析，以U6看家基因表達(dá)PCR的Ct值作為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，目的基因信使RNA（messenger RNA，mRNA）相對(duì)表達(dá)水平計(jì)算公式:2-Δ（目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct）。

1.2.2.4蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞內(nèi)RECK表達(dá)水平 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，在每孔細(xì)胞中加入全蛋白裂解液裂解細(xì)胞獲得蛋白，總蛋白樣品各20 μg和5×磷酸鹽緩沖液混勻后，100℃沸水煮5 min。裂解上清用二辛可寧酸試劑盒定量蛋白量，制備12%的分膠液，微量加樣器上樣20 μg總蛋白，300 mA轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂奶粉/含吐溫-20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液（Tris-buffered saline with Tween-20，TBST）室溫，搖床緩慢搖動(dòng)，封閉60 min，洗膜3次，用稀釋比例為1∶1 000的RECK一抗孵育，4℃過夜，TBST洗膜3次、每次10 min。用辣根過氧化物酶標(biāo)志的異硫氰酸熒光素標(biāo)志二抗（抗兔）1∶5 000孵育，搖床緩慢搖動(dòng)，室溫60 min。用TBST洗膜3次、每次10 min，暗室下電化學(xué)發(fā)光顯色、曝光，觀察結(jié)果。

將完成顯影的膠片掃描，以TIF格式儲(chǔ)存，F(xiàn)luor Chem 8900軟件分析印跡條帶灰度，記錄平均灰度值。以目的蛋白R(shí)ECK條帶平均灰度值/β-actin平均灰度值作為目的蛋白表達(dá)的相對(duì)高低值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間差異采用單因素方差分析，采用LSD進(jìn)行多重比較，若方差不齊則采用Brown-Forsythe近似方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1miR-21轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中帶綠色熒光標(biāo)志的miR-21抑制物在細(xì)胞質(zhì)中顯示綠色熒光，在用1 μL Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染20 pmol miR-21抑制物時(shí)，效率即可達(dá)到70%左右（圖1）。

圖1　熒光標(biāo)志檢測(cè)miR-21抑制物轉(zhuǎn)染效率（×200）

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR-21的表達(dá) 通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染，抑制和上調(diào)MCF-7細(xì)胞的miR-21表達(dá)，轉(zhuǎn)染48 h后，miR-21抑制物組和miR-21模擬物組miR-21的表達(dá)分別與轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為30.79、139.68，P＜0.001），轉(zhuǎn)染miR-21抑制物組miR-21的表達(dá)明顯下降，轉(zhuǎn)染miR-21模擬物組miR-21的表達(dá)明顯上調(diào)（表2）。

2.3蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后RECK的表達(dá)miR-21抑制物組與抑制物陰性對(duì)照組比較，RECK表達(dá)明顯上升（F=93.76，P＜0.01）；miR-21模擬物組與模擬物陰性對(duì)照組比較，RECK表達(dá)明顯下降（F=82.63，P＜0.01）。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)相對(duì)表達(dá)量和條帶分別見表2和圖2。

表2　細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR-21及RECK表達(dá)（±s）

表2　細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR-21及RECK表達(dá)（±s）

注:與抑制物陰性對(duì)照組比較，*P＜0.001；與模擬物陰性對(duì)照組比較，#P＜0.001

組 別　miR-21　RECK抑制物空白對(duì)照組　1.12±0.16　1.00±0.00模擬物空白對(duì)照組　1.21±0.15　1.00±0.00抑制物陰性對(duì)照組　1.03±0.25　0.80±0.03模擬物陰性對(duì)照組　1.14±0.61　1.02±0.33 miR-21抑制物組　0.02±0.01*　1.42±0.94*miR-21模擬物組　106.79±18.59#　0.74±0.03#

圖2　干擾miR-21表達(dá)后細(xì)胞RECK表達(dá)（±s，n=3）

3 討論

乳腺癌是女性高發(fā)的惡性腫瘤之一，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是患者致死的最重要原因。乳腺癌的轉(zhuǎn)移是一個(gè)多基因參與、通過多步驟完成的復(fù)雜過程，其具體機(jī)制尚未明確。miRNAs是近年發(fā)現(xiàn)的一類長度約22個(gè)核苷酸非編碼小分子RNA，通過靶mRNA降解或抑制其翻譯來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞的分化、增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移、個(gè)體發(fā)育、機(jī)體代謝，以及腫瘤、病毒感染多種疾病中都具有重要作用［5］。

RECK基因是新發(fā)現(xiàn)的一種膜表面糖蛋白，該基因位于9p13-p12。研究證實(shí)，RECK基因的表達(dá)與胃癌、食管癌、乳腺癌的預(yù)后具有相關(guān)性，RECK基因表達(dá)陰性的預(yù)后較差，反之RECK基因表達(dá)陽性的預(yù)后較好［6］。因此，RECK是一種抑癌基因，可負(fù)向調(diào)控腫瘤的轉(zhuǎn)移或侵襲。

miRNAs調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制之一是通過與靶基因mRNA的3′端非翻譯區(qū)相結(jié)合，通過降解靶基因mRNA起到生物學(xué)調(diào)節(jié)功能的作用。作者通過在線的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件，發(fā)現(xiàn)miR-21 5′端的種子序列可以與RECK 3′-非翻譯區(qū)靶向互補(bǔ)，因此推測(cè)RECK可能是miR-21調(diào)節(jié)的靶基因之一。有研究表明，RECK基因表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞侵襲力存在相關(guān)性，RECK基因的表達(dá)可以作為乳腺癌患者預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)［7］?；赗ECK基因在腫瘤組織的表達(dá)可以影響腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成，所以影響RECK基因的表達(dá)，有望成為在預(yù)防和治療腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)。

miR-21在多種實(shí)體腫瘤及非實(shí)體腫瘤中均呈現(xiàn)高表達(dá)，在乳腺癌中也不例外［8-9］。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21不僅在腫瘤發(fā)生中起類似癌基因的作用，更重要的是其參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。Yan等［10］發(fā)現(xiàn)乳腺癌中miR-21高表達(dá)，且與乳腺癌的臨床病理特征如分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。Petrovic′等［11］也發(fā)現(xiàn)高侵襲性乳腺癌患者miR-21呈現(xiàn)高表達(dá)，miR-21的高表達(dá)有可能成為乳腺癌高侵襲性的獨(dú)立分子標(biāo)志物，且miR-21高表達(dá)與乳腺癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤等惡性行為具有正相關(guān)性，因而進(jìn)一步研究miR-21如何通過分子調(diào)節(jié)機(jī)制來對(duì)乳腺癌的侵襲起預(yù)測(cè)作用。

欣喜的是在TargetScan中發(fā)現(xiàn)miR-21 5′端的種子序列可以與RECK 3′-非翻譯區(qū)靶向互補(bǔ)，RECK基因有可能是miR-21調(diào)節(jié)的靶基因之一。本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)計(jì)miR-21模擬物、miR-21抑制物、模擬物陰性對(duì)照、抑制物陰性對(duì)照各組瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞中，48 h后通過熒光定量PCR檢測(cè)miR-21在細(xì)胞的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-21抑制物組miR-21的表達(dá)明顯下降，轉(zhuǎn)染miR-21模擬物組miR-21的表達(dá)明顯上調(diào)。確認(rèn)細(xì)胞中miR-21干擾表達(dá)成功后，提取細(xì)胞蛋白，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后RECK的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-21抑制物組RECK表達(dá)有明顯上調(diào)趨勢(shì)，miR-21模擬物組RECK表達(dá)明顯下降趨勢(shì)。因此，有理由推斷，RECK基因有可能是miR-21調(diào)節(jié)的靶基因之一，miR-21可以作為乳腺癌診斷預(yù)后分析的標(biāo)志物，也可能成為治療的新靶點(diǎn)之一。

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MicroRNA-21 regulates expression of reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs in MCF-7 cells

ZHENG Zhiwei1，ZHAO Shulin1，YANG Yuxian2，ZHU Huide1，ZHU Zhiwei1，CHEN Lei2
（1.Department of Pharmacy，Cancer Hospital of Shantou University Medical College，Shantou Guangdong 515041，China；2.Department of Gastroenterology，Cancer Hospital of Shantou University Medical College，Shantou Guangdong 515041，China）

R737.9

A

2095-3097（2016）04-0198-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2016.04.002

汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院青年科研基金資助項(xiàng)目（2013A004）；廣東省乳腺癌診治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室種子基金資助項(xiàng)目（2012A061400018）；汕頭市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（汕市財(cái)教〔2013〕244號(hào)）

515041廣東汕頭，汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部（鄭志偉，趙樹林，朱輝德，朱志偉），消化腫瘤內(nèi)科（楊鈺賢，陳 蕾）

陳 蕾，E-mail:zhiweizheng@126.com

（2016-04-11 本文編輯:徐海琴）