■ 周陽 胡先勤 周建軍 彭銀蘇 王超 羅一帆 陳潛雙

（武漢輕工大學 動物營養(yǎng)與飼料科學湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430023）

環(huán)孢素A對斑點叉尾鮰皰疹病毒增殖的影響

■ 周陽 胡先勤 周建軍 彭銀蘇 王超 羅一帆 陳潛雙

（武漢輕工大學 動物營養(yǎng)與飼料科學湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430023）

斑點叉尾鮰（Ietalurus Punetaus）是從國外引進的一種重要的特種水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類，深受消費者青睞。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大和集約化程度日益提高，養(yǎng)殖環(huán)境惡化，斑點叉尾鮰病害日趨嚴重，其中由斑點叉尾鮰皰疹病毒（channel catfish virus，CCV）引發(fā)的斑點叉尾鮰皰疹病毒?。╟hannel catfish virus disease，CCVD）危害最大。CCVD的暴發(fā)造成魚苗、魚種的死亡率高達90%以上，且無有效的治療方法，給斑點叉尾鮰的養(yǎng)殖生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟損失。大量研究表明，環(huán)孢素A（CsA）對多種病毒的增殖具有抑制作用，而關于CsA對CCV的作用尚未見報道。本研究通過體外實驗研究CsA對CCV增殖的影響，以期為防治斑點叉尾鮰皰疹病毒病提供重要的實驗依據(jù)和參考資料。

1 材料與方法

1.1 細胞與培養(yǎng)

斑點叉尾鮰卵巢細胞系（channel catfish ovary cell，CCO）由華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院提供。CCO細胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基在280C含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通常2～3d傳代1次，將細胞用PBS洗1次，在每個T25培養(yǎng)瓶中加入1ml的胰酶消化1min左右，隨后再將胰酶除去，最后再添加含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基15ml，將細胞吹散，搖勻分到3個T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.2 病毒與感染

CCV病毒由華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院提供。待CCO細胞生長狀態(tài)良好時，以適當比例傳代于大瓶中培養(yǎng)，24h內進行CCV的感染，首先吸去瓶中的細胞培養(yǎng)液，然后將細胞用無胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液清洗1遍，隨后吸去沒有用的廢液，然后向細胞內加入稀釋過107倍的CCV懸液0.5ml，使液體覆蓋細胞培養(yǎng)面，280C孵育1h，期間每隔20min輕搖晃1次使液體完全覆蓋細胞培養(yǎng)面，之后吸棄CCV懸液，加入含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于28℃培養(yǎng)、增殖，隨后在顯微鏡下觀察，當細胞完全病變后就放入-800C下保存。

1.3 抑制劑（CSA）的配制及其細胞毒性檢測

將CSA粉末溶入DMSO中配制成不同的濃度分開裝好后置于-200C冰箱中保存。在96孔板上接種CPB細胞，當細胞長到單層時，更換含有不同濃度CsA的培養(yǎng)液（0μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L），在培養(yǎng)12h、24h、36h、48h和72h后用MTS法分別檢測其細胞活性。

1.4 CSA對CCV病毒增殖的影響

在24孔細胞培養(yǎng)板上接種CCO，當細胞生長至55%左右融合時，就開始加入含不同濃度CSA培養(yǎng)基，同時設立DMSO為對照組，CsA作用12h后接種1 MOI 的CCV，吸附完成后換入含不同濃度CsA的培養(yǎng)基，CCV感染后72h收取樣品。用TCID50法檢測病毒滴度。

1.5 CsA對CCV誘導的細胞因子表達的影響

將CCO細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，等細胞長到50%～60%融合時，換入含有CsA的細胞培養(yǎng)液，同時設立DMSO為對照組。CsA作用12h后接種1 MOI 的CCV。另設一組接種無血清的DMEM培養(yǎng)基，作為正常細胞對照組。感染后12h、24h、36h和48h收取樣品，加入TRizol試劑裂解，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 實時熒光定量反轉錄PCR（qRT-PCR）

使用TRIzol試劑盒提取總RNA，按說明書進行。反轉錄使用PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser 試劑盒，每個樣品使用1μg總RNA進行反轉錄。使用SYBR染料法（Takara的SYBR Premix Ex Taq試劑盒）進行相對定量PCR，以斑點叉尾鮰的18s rRNA作為內參，用△△CT法計算，以全培養(yǎng)基組作為100%。使用ABI 7,500熒光定量PCR儀，反應條件為：首先95℃ 30s進行預變性；隨后進行40個循環(huán)，反應為95℃ 5s，60℃ 34s。擴增反應完成后，進行溶解曲線分析，以確定引物的特異性。實驗所用引物見表1。

2 結果與分析

2.1 不同濃度CSA對CCO細胞毒性檢測

從圖1中可以看出，當CsA的濃度小于等于10μmol/L的時候，在各個時間點對CCO細胞的活力均無顯著影響。因此，后續(xù)研究中使用CsA的最大濃度為10μmol/L。

表1 qRT-PCR引物

2.2 CSA對CCV病毒增殖的影響

從圖2中可以看出，CsA濃度在0～10μmol/L之間，隨著細胞中添加的CSA濃度的增加，細胞被病毒感染的感染率在不停降低，說明CsA對CCV的增殖起著抑制作用。

2.3 CsA對CCV誘導的細胞因子表達的影響

CCV的感染會誘導宿主的先天性免疫反應，導致宿主的一些細胞因子的表達發(fā)生變化，為研究CsA 對CCV感染后的細胞因子表達的影響，于感染后的6h、12h、24h、36h、48h和72h分別收樣，用qRT-PCR方法檢測CPB細胞中細胞因子的變化。結果表明，CsA對CCV感染后誘導的IL-8和TNF-α的表達均有抑制作用（圖3，圖4）。

3 討論

環(huán)孢素A（CsA），是一種使用廣泛、作用強效的免疫抑制劑，可以特異和可逆地作用于淋巴細胞，抑制淋巴細胞的激活和增殖，抑制某些細胞相關的炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，從而起到抑制細胞免疫的作用。CsA是由11個氨基酸組成的多肽。CsA進入細胞后先與CypA形成復合物（CypACsA），再與鈣調磷酸酶（calcineurin，CN）結合，抑制CN酶活性，從而使其底物——激活的T細胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NF-AT）不能去磷酸化，抑制了NF-AT從胞漿進入細胞核內形成轉錄復合體，進一步抑制IL-2、IL-4、γ-干擾素等細胞因子的轉錄。CsA通過在轉錄水平上通過阻斷T細胞的活化，從而實現(xiàn)免疫抑制效果。

關于CsA對病毒增殖的抑制作用已有很多的研究報道。Kim等對豬流行性腹瀉病毒（PEDV）研究發(fā)現(xiàn)，CsA能抑制PEDV誘導的細胞凋亡，進而抑制PEDV的增殖。CsA 對多種冠狀病毒的增殖都有抑制作用。CsA通過調節(jié)干擾素途徑的關鍵因子的表達，促進I型干擾素的先天性免疫功能，從而抑制輪狀病毒的復制。在對甲型流感病毒和丙型肝炎病毒等研究中，也有類似的結果[10,11]。胡先勤等研究表明，CsA可以顯著抑制鱖魚虹彩病毒（ISKNV）的增殖。本文的研究結果表明，CsA也能顯著抑制CCV的增殖，有關于其作用機理需要進行進一步研究。

病毒感染會誘導細胞產(chǎn)生炎癥反應，本文研究結果表明，CsA對CCV感染后誘導的IL-8和TNF-α的表達有抑制作用。提示CsA對CCV感染誘導的細胞因子的表達具有調節(jié)作用，可能在相關信號通路中發(fā)揮重要作用，有關其具體機制需要進一步研究。

由于CsA對CCV的增殖具有顯著的抑制作用，由此推測CsA及其衍生物將來可以作為防治CCV的候選藥物。

略）【基金項目：武漢輕工大學大學生科研項目（xsky2016026）；武漢輕工大學引進人才科研啟動項目（2016RZ10）】

圖1 MTS法檢測CsA對CCO細胞的毒性

圖2 不同濃度CsA對CCV增殖的影響

圖3 CsA對CCV感染后細胞中IL-8表達的影響

圖4 CsA對CCV感染后細胞中TNF-α表達的影響