楊陽

（黑龍江省野生動物研究所，哈爾濱　150081）

鹿茸活性肽的分離提純及成分測定

楊陽

（黑龍江省野生動物研究所，哈爾濱150081）

采用醇沉法、Sephadex G-25層析和TOYOPEARL Giga Cap s-650M層析法分離提純鹿茸活性肽，得到的鹿茸活性肽純度較高，為79.397%，分子量為3 000～3 200 Da，并含谷氨酸、丙氨酸、絲氨酸等14種氨基酸。

鹿茸；活性肽；分離；提純

鹿茸中含有很多活性物質(zhì)，傳統(tǒng)的加工方法易使鹿茸產(chǎn)品中的活性物質(zhì)遭到破壞而不能被充分利用，因此采用科學的方法分離提純鹿茸活性肽成分，并對其進行性質(zhì)分析，能夠提高鹿茸的利用率，促進我國珍貴藥材鹿茸的開發(fā)和利用。

1　試驗材料

梅花鹿二杠鮮茸（冷凍保存）；葡聚糖Sephadex G-25；TOYOPEARLGiga Cap s-650M；超低分子量Marker；乙酸—乙酸鈉（HAc-NaAc）；95%乙醇；醋酸—醋酸鈉緩沖溶液。

2　試驗方法

2.1鹿茸活性肽的粗提

取凍存（-18℃）的梅花鹿二杠鮮茸1 kg，冷凍切片，加入3000mL預先冷卻的200μmo1/L pH3.5的醋酸—醋酸鈉緩沖溶液，放置過夜。8 500 r/min離心20 min，取上清液，加入95%乙醇使其終濃度達到65%，4℃放置并攪拌，4 h后8 500 r/min離心20 min，取上清，在真空旋轉蒸發(fā)儀55℃中蒸發(fā)，回收乙醇，最終濃縮體積約為400 mL，得到鹿茸粗提物，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2鹿茸活性肽的精提

通過查閱資料、預試驗，確定通過SephadexG-25層析和TOYOPEARL Giga Cap s-650M層析進行提純。

2.2.1Sephadex G-25層析

將溶脹好的Sephadex G-25裝入處理好的層析柱中（20mm×32cm），選用pH4.0，2mmol/L HAc-NaAc作為流動相，流速為1.5 mL/min，加入鹿茸粗提物5 mL，根據(jù)核酸蛋白檢測儀顯示的數(shù)值收集各峰，進行生物活性檢測，將免疫活性強的組份進行下一步層析。

2.2.2TOYOPEARL Giga Cap s-650M層析

TOYOPEARL Giga Cap s-650M灌柱（20 mm ×32 cm）后，選用pH 3.6，5 mmol/L HAc-NaAc作為流動相，加入經(jīng)Sephadex G-25純化后活性肽，5 mL（經(jīng)分子量為1 200的透析袋透析濃縮），根據(jù)核酸蛋白檢測儀顯示的數(shù)值收集流穿峰，然后分別使用pH 4.0、濃度為0.5和1 mol/L HAc-NaAc溶液洗脫，并收集洗脫峰，進行生物活性檢測，收集免疫活性強的組份即為鹿茸活性肽的精提物。

2.3電泳檢測

進行SDS-PAGE分析，測定鹿茸活性肽的分子量。

2.4活性肽的氨基酸測定

采用氨基酸自動分析儀（柱后衍生法）測定活性肽的氨基酸組成。

2.5多肽純度的測定

采用haimagerTM2 200凝膠成像系統(tǒng)對電泳圖的條帶進行光密度掃描，測定純度。

3　試驗結果

3.1鹿茸活性肽的分離提純

經(jīng)粗提、Sephadex G-25層析和TOYOPEARL Giga Cap s-650M層析，及生物活性檢測，得出免疫活性強的組份即為鹿茸活性肽精提物。

3.2電泳檢測結果

使用TOYOPEARL Giga Cap s-650M陽離子交換填料的洗脫峰經(jīng)電泳檢測（圖1）顯示：鹿茸多肽的電泳圖譜為一條帶，表明分離得到的鹿茸多肽已較純，與相應的Marker做對照，其分子量約為3 000～3 200 Da。

圖1　電泳檢測結果

3.3活性肽的氨基酸測定

從鹿茸的活性多肽中檢測出14種氨基酸（表1），主要有谷氨酸、丙氨酸、絲氨酸、精氨酸、亮氨酸等。

表1　鹿茸多肽的氨基酸含量及組成　g/100g

3.4多肽純度測定

用AlphaimagerTM2 200凝膠成像系統(tǒng)對電泳檢測結果中泳道2的條帶進行光密度掃描（圖2）顯示：泳道2中鹿茸多肽的純度為79.397%。

圖2　凝膠成像掃描圖譜

4討　論

電泳檢測結果為一條蛋白區(qū)帶，表明分離得到的鹿茸多肽已較純，與相應的Marker做對照分子量為3 000～3 200 Da，經(jīng)AlphaimagerTM2 200凝膠成像系統(tǒng)掃描，純度為79.397%，從氨基酸組成成分看，提純的鹿茸多肽含谷氨酸、丙氨酸、絲氨酸等14種氨基酸。

［1］宗穎，劉侗，王志穎.鹿茸多肽成分及其藥理作用研究［J］.吉林中醫(yī)藥，2013（11）:1135-1137.

［2］張微，張振秋，李峰，等.馬鹿茸多肽提取工藝研究［J］.中華中醫(yī)藥刊，2006（3）:630-632.

［3］趙玉紅，張立剛，張睿.鹿茸水浴性蛋白提取條件的優(yōu)化及組分［J］.東北林業(yè)大學學報，2016（7）:120-124.

第1作者簡介：楊陽（1979-），女，碩士研究生，副研究員，主要從事野生動物藥理毒理及產(chǎn)品開發(fā)工作。

（責任編輯：李丹）

Antler Active Peptide Separation，Purification and Determination of Composition

YANGYang
（Wildlife Institute of Heilongjiang Province，Harbin150081）

By the methods of alcohol sink，Sephadex G-25 chromatography and TOYOPEARL Giga Cap s-650M chromatography separation and purification method of antlr Sexpeptide.；Antler active peptide was of high purity.Molecular weight is about 3 000-3 200 Da，The purity of 79.397%，lncluding 14 kinds of amino acids.

Antler；Active peptide；Separation；Purification

S825；Q516

C

1001-9499（2016）04-0077-02

2016-06-30