謝大澤，黃利興，劉東升，朱　俊，謝　勇，周南進(jìn),△

(1.江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，南昌 330006；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，南昌 330046；3.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江西贛州 341000；4.南昌大學(xué)免疫與生物治療研究所，南昌 330006)

?

·論著·

脂氧素對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的抗炎實(shí)驗(yàn)研究*

謝大澤1，黃利興2,3，劉東升2，朱俊4，謝勇2，周南進(jìn)1,4△

(1.江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，南昌 330006；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，南昌 330046；3.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江西贛州 341000；4.南昌大學(xué)免疫與生物治療研究所，南昌 330006)

目的研究脂氧素(LX)A4和叔丁氧羥基-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(BOC-2)對(duì)LPS作用巨噬細(xì)胞RAW264.7存活的影響。方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的巨噬細(xì)胞RAW264.7為研究載體，實(shí)驗(yàn)用不同濃度的脂多糖(LPS)在不同時(shí)間點(diǎn)處理細(xì)胞，觀(guān)察LX A4和BOC-2對(duì)LPS作用巨噬細(xì)胞RAW264.7后的存活率。CCK-8法觀(guān)察LPS對(duì)各組巨噬細(xì)胞RAW264.7的不良反應(yīng)，Western blot法檢測(cè)LX A4和BOC-2對(duì)LPS處理后巨噬細(xì)胞RAW264.7的Toll樣受體4(TLR4)和pNF-κB p65蛋白水平，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)LX A4和BOC-2對(duì)LPS處理后巨噬細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)上清液中白細(xì)胞介素6(IL-6)水平。結(jié)果在1 000 ng/mL濃度LPS組，作用時(shí)間6 h，巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)TLR4蛋白水平和pNF-κB p65 蛋白水平顯著高于其余各組(P<0.05)。在LPS作用下，LX A4組細(xì)胞存活率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；BOC-2組在LPS作用后巨噬細(xì)胞RAW264.7的存活率顯著低于無(wú)LPS作用(P<0.05)。在LPS作用下，LX A4組pNF-κB p65 蛋白水平低于對(duì)照組及BOC-2組(P<0.05)，BOC-2組pNF-κB p65蛋白水平高于其余各組(P<0.05)。在LPS作用下，LX A4組IL-6的水平低于對(duì)照組及BOC-2組(P<0.05)。結(jié)論LX A4能夠抑制LPS對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的作用及TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活，有助減輕炎性反應(yīng)。

脂多糖類(lèi)；脂氧素類(lèi)；脂氧素A4；RAW264.7；核轉(zhuǎn)錄因子

脂氧素(lipoxin，LX)是繼前列腺素之后的又一重要花生四烯酸代謝產(chǎn)物，在炎癥疾病的組織中廣泛表達(dá)，LX A4最具抗炎作用，其主要通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B(NF-κB)的活性及促炎因子的釋放發(fā)揮抗炎作用[1]。LX除了抑制促炎細(xì)胞因子外，也可促進(jìn)抗炎因子如白細(xì)胞介素(IL-4)、白細(xì)胞介素10(IL-10)等的產(chǎn)生[2]，這種協(xié)調(diào)作用能產(chǎn)生強(qiáng)效的抗炎效應(yīng)。叔丁氧羥基-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(BOC-2)是脂氧素受體的拮抗劑，與LX競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合于脂氧素受體，從而阻礙LX與其受體的結(jié)合，對(duì)LX與其受體的結(jié)合起拮抗性作用。本文以巨噬細(xì)胞RAW264.7為研究載體，研究LX A4和BOC-2對(duì)脂多糖(LPS)作用巨噬細(xì)胞的存活、信號(hào)通路及細(xì)胞因子分泌的影響，旨在為L(zhǎng)X A4抗炎作用及機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料巨噬細(xì)胞RAW264.7，由南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化研究所保存；DMEM購(gòu)于HyClone公司；LX A4購(gòu)于Cayman公司；BOC-2購(gòu)于US Biological公司；LPS購(gòu)于Sigmal公司；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)于北京索萊寶有限公司；CCK-8購(gòu)于上海貝博生物有限公司；Toll樣受體4(TLR4)抗體購(gòu)于A(yíng)bcam公司；pNF-κB p65抗體購(gòu)于Santacruz公司；細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子 2(SOCS2)抗體購(gòu)于A(yíng)bcam公司；酶聯(lián)免疫試劑(ELISA)試劑盒購(gòu)于上海點(diǎn)亮生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)巨噬細(xì)胞RAW264.7用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)。將10 μL細(xì)胞懸液加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板內(nèi)，靜置后顯微鏡下計(jì)數(shù)。細(xì)胞密度(/mL)=(4個(gè)方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)/4)×稀釋倍數(shù)×104。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組(1)LPS作用巨噬細(xì)胞RAW264.7實(shí)驗(yàn)分為4組。①實(shí)驗(yàn)1組：用10 ng/mL LPS處理巨噬細(xì)胞RAW264.7；②實(shí)驗(yàn)2組：用100 ng/mL LPS處理巨噬細(xì)胞RAW264.7；③實(shí)驗(yàn)3組：用1 000 ng/mL LPS處理巨噬細(xì)胞RAW264.7；④實(shí)驗(yàn)4組：用10 000 ng/mL LPS處理巨噬細(xì)胞RAW264.7。并設(shè)立對(duì)照組：無(wú)任何藥物處理巨噬細(xì)胞RAW264.7。分別在LPS作用2、4、6 h后提取細(xì)胞蛋白。(2)LX A4和BOC-2對(duì)LPS作用巨噬細(xì)胞RAW264.7存活的影響。①對(duì)照組：不加任何藥物處理巨噬細(xì)胞RAW264.7；②LX A4組：用300 nmol/L LX A4處理巨噬細(xì)胞；③BOC-2組：用10 μmol/L BOC-2處理RAW264.7細(xì)胞。

1.2.3CCK-8法檢測(cè)巨噬細(xì)胞RAW264.7毒性取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)期巨噬細(xì)胞RAW264.7，按5×104/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液，按上述實(shí)驗(yàn)分組分別加入含有LX A4和BOC-2的培養(yǎng)液預(yù)處理15 min；同時(shí)設(shè)定空白孔，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。按要求加LPS作用，每孔200 μL，培養(yǎng)6 h后，加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。按CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.4ELISA法檢測(cè)IL-6水平采用多因子蛋白生物標(biāo)志物檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6水平，根據(jù)多因子分析試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.5Western blot法檢測(cè)TLR4、pNF-κB p65蛋白水平根據(jù)巨噬細(xì)胞RAW264.7計(jì)數(shù)結(jié)果，將3組實(shí)驗(yàn)按1×106/孔細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，搖勻后置37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，Western blot檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)TLR4、pNF-κB p65蛋白水平。

2　結(jié)　　果

2.1LPS對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)TLR4蛋白水平的影響不同濃度LPS作用巨噬細(xì)胞2 h后，實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組和實(shí)驗(yàn)3組TLR4蛋白水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；作用4 h，實(shí)驗(yàn)3組顯著高于其余各組(P<0.05)；作用6 h，在一定濃度范圍內(nèi)巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)TLR4 蛋白水平隨LPS濃度增加而增加，其中實(shí)驗(yàn)3組顯著高于其余各組(P<0.05)。同一濃度LPS作用巨噬細(xì)胞RAW264.7不同時(shí)間，實(shí)驗(yàn)3組的TLR4 蛋白水平在4、6 h顯著高于2 h(P<0.05)，同時(shí)6 h顯著高于4 h(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1　　各組巨噬細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)RAW264.7TLR4

a：P<0.05,與對(duì)照組比較；b：P<0.05,與實(shí)驗(yàn)1組比較；c：P<0.05,與實(shí)驗(yàn)2組比較；d：P<0.05,與實(shí)驗(yàn)4組比較；e：P<0.05,與同組2 h比較；f：P<0.05,與同組4 h比較。

2.2LPS對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)pNF-κB p65蛋白水平的影響不同濃度LPS作用巨噬細(xì)胞RAW264.72 h，實(shí)驗(yàn)3組pNF-κB p65蛋白水平顯著高于其余各組(P<0.05)；作用4 h，實(shí)驗(yàn)3組pNF-κB p65蛋白水平顯著高于其余各組(P<0.05)；作用6 h，在一定濃度范圍內(nèi)，巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)pNF-κB p65 蛋白水平隨LPS濃度增加而增加，其中實(shí)驗(yàn)3組顯著高于其余各組(P<0.05)。同一濃度LPS作用巨噬細(xì)胞RAW264.7不同時(shí)間，實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組的pNF-κB p65 蛋白水平在6 h顯著高于2 h(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2　　各組巨噬細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)RAW264.7pNF-κB p65

a：P<0.05,與實(shí)驗(yàn)3組比較；b：P<0.05,與同組2 h比較。

2.3LX A4和BOC-2對(duì)LPS作用巨噬細(xì)胞RAW264.7存活的影響在無(wú)LPS作用下，LX A4組對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的存活率無(wú)影響(P>0.05)；在LPS作用下，LX A4組(108.76±5.66)的巨噬細(xì)胞RAW264.7存活率顯著高于對(duì)照組(84.40±4.46)及BOC-2組(83.10±7.69)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而同時(shí)在對(duì)照組及BOC-2組，LPS作用后巨噬細(xì)胞RAW264.7的存活率顯著低于無(wú)LPS作用后的存活率(P<0.05)。

2.4LX A4和BOC-2對(duì)LPS作用巨噬細(xì)胞RAW264.7 TLR4蛋白水平的影響無(wú)論有無(wú)LPS作用，巨噬細(xì)胞RAW264.7的蛋白水平在各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而在LPS作用下，巨噬細(xì)胞RAW264.7的TLR4蛋白水平顯著高于相對(duì)應(yīng)的無(wú)LPS作用的蛋白水平(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3　　LX A4對(duì)TLR4蛋白水平的影響

a:P<0.05，與無(wú)LPS比較。

2.5LX A4和BOC-2對(duì)LPS作用巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)pNF-κB p65蛋白水平的影響在無(wú)LPS作用下，各組巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)的pNF-κB p65蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在LPS作用下，LX A4組(0.64±0.08)pNF-κB p65 蛋白水平低于對(duì)照組(0.86±0.06)及BOC-2組(1.07±0.16)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；BOC-2組pNF-κB p65蛋白水平高于其余各組(P<0.05)，同時(shí)對(duì)照組及BOC-2組高于相對(duì)應(yīng)的無(wú)LPS組(P<0.05)；而LX A4組，無(wú)論有無(wú)LPS作用，pNF-κB p65蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6LX A4和BOC-2對(duì)LPS作用巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌IL-6水平的影響在無(wú)LPS作用下，各組巨噬細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)上清液中IL-6的水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在LPS作用下，LX A4組(78.20±11.06)IL-6的水平低于對(duì)照組(154.56±47.70)及BOC-2組(148.03±29.65)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；無(wú)論有無(wú)LX A4和BOC-2處理，LPS作用巨噬細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)上清液中IL-6的水平顯著高于相應(yīng)的無(wú)LPS作用的IL-6水平(P<0.05)。

3　討　　論

LX是重要的內(nèi)源性抗炎介質(zhì)，對(duì)多種炎性細(xì)胞和炎性反應(yīng)起負(fù)性調(diào)節(jié)，具有廣泛的抗炎及促炎癥消退作用，在發(fā)揮抗炎活性時(shí)通過(guò)不同方式調(diào)控多種炎癥信號(hào)通路，被譽(yù)為是中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的組織損傷的“停止信號(hào)”或“剎車(chē)信號(hào)”[3]。

TLRs蛋白家族是一組能夠識(shí)別病原微生物及內(nèi)源性組織損傷信號(hào)的高度保守的跨膜蛋白家族。在組織受損或炎癥浸潤(rùn)狀態(tài)下，TLRs與病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)結(jié)合后啟動(dòng)一系列胞內(nèi)級(jí)聯(lián)信號(hào)通路的活化，從而調(diào)控固有免疫與獲得性免疫，以及組織細(xì)胞的損傷與修復(fù)。TLR4/NF-κB信號(hào)通路是聯(lián)系機(jī)體固有免疫與獲得性免疫的橋梁，在調(diào)節(jié)腸道炎癥、防御病原體入侵及維持腸腔內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起重要作用[4]。

LPS是TLR4的天然配體，在髓樣分化蛋白2(MD-2)及CD14分子的參與下，LPS與TLR4結(jié)合后能夠通過(guò)髓樣分化因子(MyD88)依賴(lài)和MyD88非依賴(lài)途徑激活下游信號(hào)通路，其中MyD88依賴(lài)途徑進(jìn)一步募集并活化下游的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)，活化的TRAF6經(jīng)由MAPK信號(hào)通路及NF-κB信號(hào)通路，最終引起一系列的免疫和炎性反應(yīng)[5]。正常腸黏膜TLR4蛋白低表達(dá)，而黏膜固有層巨噬細(xì)胞不表達(dá)CD14分子，在炎癥性腸病(IBD)中TLR4及CD14的表達(dá)上調(diào)，并伴有炎癥細(xì)胞因子的分泌增加[6]，提示TLR4信號(hào)通路的異常激活在IBD的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

王艷艷等[7]應(yīng)用內(nèi)化抑制劑構(gòu)建內(nèi)化障礙的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7模型，發(fā)現(xiàn)LPS-TLR4 復(fù)合物內(nèi)化與LPS 介導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化密切相關(guān),內(nèi)化障礙條件下,由LPS 介導(dǎo)的細(xì)胞活化表現(xiàn)為對(duì)IL-6 的釋放受到顯著抑制,而對(duì)腫瘤壞死因子α(TNF-α)的釋放則抑制不顯著。本研究發(fā)現(xiàn)，相同濃度LPS作用巨噬細(xì)胞RAW264.7不同時(shí)間，細(xì)胞內(nèi)pNF-κB p65蛋白水平呈時(shí)間依賴(lài)性，且在6 h時(shí)作用最為明顯；提示巨噬細(xì)胞RAW264.7對(duì)外界適宜的刺激需要一定的反應(yīng)時(shí)間，激活NF-κB信號(hào)通路后需要經(jīng)過(guò)一系列的胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終才引起炎性反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，在無(wú)LPS作用下，LX A4對(duì)pNF-κB蛋白水平無(wú)影響，提示在生理情況下不起作用有關(guān)；在LPS作用下，LX A4作用的同時(shí)，與對(duì)照組相比，pNF-κB p65蛋白水平下降。Mcberry等[8]發(fā)現(xiàn)，LX的作用機(jī)制是通過(guò)上調(diào)SOCS-2的表達(dá)、加速TRAF6的降解，進(jìn)而抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，防止炎癥擴(kuò)散。本研究表明，LX A4能夠減輕LPS所致巨噬細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)上清液中IL-6的水平。由此可見(jiàn)，抗炎因子與LX A4之間的正反饋?zhàn)饔?，?duì)炎癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸起著作用。

綜上所述，LX A4能夠抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7中NF-κB的激活，有減輕炎性反應(yīng)的作用，因此有望成為炎性腸病(IBD)治療的新的契機(jī)。本實(shí)驗(yàn)還有需進(jìn)一步完善，為L(zhǎng)X A4及LX在IBD中的作用機(jī)制提供更為強(qiáng)有力的證據(jù)。

[1]Romano M.Lipoxin and aspirin-triggered lipoxins[J].Sci World J,2010,10(1):1048-1064.

[2]Zhou XL,Yang QS,Ni SZ,et al.Protective effects of lipoxin a4 in testis injury following testicular torsion and detorsion in rats[J].Mediators Inflamm,2014:898056.

[3]周游，蔣興亮．脂氧素調(diào)控炎癥信號(hào)通路的研究進(jìn)展[J]．中華臨床醫(yī)師雜志，2015，9(6)：989-993．

[4]Garcia-Rodriguez S,Arias-Santiago S,Perandres-Lopez RA,et al.Increased gene expression of toll-like receptor 4 on peripheral blood mononuclear cells in patients with psoriasis[J].J Eur Acad Dermatol Venereol,2013,27(2):242-250.

[5]Yu ZH,Huang F,Xu N,et al.Expression of toll-like receptor 4,CD14,and NF-kappaB in Chinese patients with ulcerative colitis[J].J Immunoassay Immunochem,2011,32(1):47-56.

[6]Campos N,Magro F,Castro AR,et al.Macrophages from IBD patients exhibit defective tumour necrosis factor-alpha secretion but otherwise normal or augmented pro-inflammatory responses to infection[J].Immunobiology,2011,216(8):961-970.

[7]王艷艷，鄭江．LPS-TLR4復(fù)合物內(nèi)化障礙與LPS介導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化的實(shí)驗(yàn)研究[J]．重慶醫(yī)學(xué)，2011，40(23)：2291-2293．

[8]Mcberry C,Gonzalez RM,Shryock N,et al.SOCS2-induced proteasome-dependent TRAF6 degradation:a common anti-inflammatory pathway for control of innate immune responses[J].PLoS One,2012,7(6):e38384.

The preliminary study of LX A4 on the LPS-induced RAW264.7 cell line*

XieDaze1,HuangLixing2,3,LiuDongsheng2,ZhuJun4,XieYong2,ZhouNanjin1,4△

(1.DepartmentofGastroenterology，JiangxiAcademyofMedicalSciences,Nanchang,Jiangxi330046，China;2.DepartmentofGastroenterology，theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330046，China;3.DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,Ganzhou,Jiangxi341000，China;4.InstituteofImmunomodulationandImmunotherapy,NanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006，China)

ObjectiveTo examine the effect of lipoxins (LX) A4 and its antagonist (BOC-2) on the survival rate of RAW264.7 macrophage.MethodsRAW264.7 were treated with different concentrations of LPS,and the cells were collected after 2,4,6 h respectively,then we observed the effect of LX A4 and BOC-2 on the survival rate of those cells.Cytotoxicity were detected by CCK-8 method.The expression of TLR4 and pNF-κB p65 in RAW264.7 were detected by Western blot.The expression of IL-6 in cell supernatant was measured by ELISA.ResultsThe protein expression of TLR4 and pNF-κB p65 treated with LPS for 6 h in 1 000 ng/mL of LPS group were higher than those of other groups(P<0.05).In the present of LPS,the survival rate of macrophage in the LX A4 group was significantly higher than that of the control group (P<0.05).Meanwhile,in the BOC-2 group,the survival rate of macrophage stimulated with LPS was significantly lower than the that of corresponding non-LPS group(P<0.05).Stimulated with LPS,the protein expression of pNF-κB p65 in the LX A4 group was significantly lower than those of the control group and the BOC-2 group (P<0.05),and the protein expression of pNF-κB p65 in the BOC-2 group was significantly higher than those of other groups(P<0.05).In the present of LPS,the concentration of IL-6 in the LX A4 group was significantly lower than those of the control group and the BOC-2 group (P<0.05).ConclusionLX A4 could inhibit the cytotoxicity of LPS and the activation of TLR4/NF-κB signaling pathway,then reduce the inflammation.

lipopolysaccharides；lipoxins；lipoxin A4；RAW264.7；nuclear factor kappa

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.14.002

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160056)；江西省教育廳項(xiàng)目(2012，2014)。作者簡(jiǎn)介：謝大澤(1962-)，副主任技師，本科，主要從事免疫學(xué)研究?！?/p>

，E-mail：jxznj@163.com。

R573.2

A

1671-8348(2016)14-1876-03

2015-11-15

2015-12-28)