師騰瑞，李　鴿，海春旭，秦緒軍1，，

叔丁基過氧化氫誘導(dǎo)人正常肝細(xì)胞系L02自噬模型的建立及其線粒體應(yīng)激機(jī)制

師騰瑞1，3，李鴿2，3，海春旭1，3，秦緒軍1，2，3，*

（1. 第 四軍醫(yī)大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)教研室，陜西西安710032；2. 第 四軍醫(yī)大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，陜西西安710032；3. 陜西省自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710032）

目的： 建立叔丁基過氧化氫(t-BHP)誘導(dǎo)的人正常肝細(xì)胞系L02自噬模型并探討其中的線粒體應(yīng)激機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)L02細(xì)胞，用不同濃度(100、200、400、800、1 000 μmol/L)t-BHP及線粒體靶向抗氧化劑MitoQ或p38/MAPK特異性抑制劑SB203580進(jìn)行處理，采用免疫熒光和Western blot檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3-II和p62蛋白水平，以及p38/MAPK信號通路的激活情況；Mito-SOX Red染色流式法檢測細(xì)胞線粒體活性氧(ROS)水平。結(jié)果：免疫熒光結(jié)果顯示t-BHP劑量≥800 μmol/L時可明顯誘導(dǎo)L02細(xì)胞內(nèi)LC3-II發(fā)生聚集。Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，800和1 000 μmol/L t-BHP處理可顯著增加LC3-II蛋白水平，并降低p62蛋白水平(P均＜0.05)。同時線粒體ROS水平在≥400 μmol/L t-BHP處理后明顯升高，在1 000 μmol/L t-BHP處理后p38蛋白磷酸化水平顯著增加(P均＜0.05)。給予線粒體靶向抗氧化劑MitoQ或p38/MAPK特異性抑制劑SB203580預(yù)處理后可有效拮抗t-BHP(1 000 μmol/L) 處理引起的LC3-II和p62蛋白水平改變。結(jié)論：我們成功建立了t-BHP誘導(dǎo)體外培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞系L02的自噬模型，證明線粒體ROS介導(dǎo)了此過程的發(fā)生，同時p38/MAPK通路在此過程中發(fā)揮了重要作用。

叔丁基過氧化氫；自噬；線粒體；活性氧；p38/MAPK

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To understand autophagy induction by tert-butyl hydroperoxide (t-BHP) in human hepatic cell line L02 and to explore the involvement of mitochondria. METHODS：L02 cells were treated with different concentrations of t-BHP (100，200，400，800，1 000 μmol/L) with or without specific inhibitors (mitochondria targeted antioxidant MitoQ or p38/MAPK inhibitor SB203580). Autophagy markers LC3-II and p62 as well as the p38/MAPK pathway proteins were detected by immunofluorescence and/or Western blot. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) were measured by flow cytometry with Mito-SOX Red kit. RESULTS：The high concentrations of t-BHP (≥800 μmol/L) induced the accumulation of LC3 fluorescence puncta，with LC3-II protein level increased and p62 protein level decreased significantly. These changes accompanied the elevated mitochondrial ROS and the activated p38/MAPK pathway. Pretreatment with mitochondria targeted antioxidant MitoQ or specific p38/MAPK inhibitor SB203580 attenuated these changes which were induced by t-BHP (1 000 μmol/L). CONCLUSIONS：We established the autophagy model induced by t-BHP in human hepatic cell line L02. Mitochondrial ROS and p38/MAPK pathway played critical roles in this process.

自噬(autophagy)是一種高度保守的自我消化過程，將各種細(xì)胞器或大分子蛋白進(jìn)行消化降解成為能夠被重新利用的營養(yǎng)成分，從而達(dá)到在清除受損細(xì)胞器或大分子的同時最大限度地有效利用自身營養(yǎng)成分的目的[1]。自噬是一種普遍存在的生命現(xiàn)象。正常細(xì)胞中自噬維持在一個相對較低的水平，營養(yǎng)缺乏、氧化應(yīng)激以及代謝應(yīng)激等多種應(yīng)激條件下可誘導(dǎo)自噬水平的增加[2]。其中氧化應(yīng)激是多種應(yīng)激損傷因素共有的機(jī)制之一。氧化應(yīng)激是指機(jī)體或細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生超過抗氧化防御體系所能清除的能力而引起的應(yīng)激損傷作用[3]。ROS與自噬的相關(guān)性已有很多文獻(xiàn)報道[4]，但具體機(jī)制仍然知之甚少。雖然在很多自噬研究中觀察到了ROS的變化，也通過抗氧化劑干預(yù)證明了ROS在自噬中的作用，而直接采用ROS誘導(dǎo)自噬的模型較少。本研究采用氧化劑叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide，t-BHP)建立了體外人正常肝細(xì)胞系L02自噬模型，進(jìn)一步觀察了線粒體氧化應(yīng)激及ROS相關(guān)信號通路p38/MAPK在其中的作用，為ROS與自噬的研究提供新的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蛿?shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑及儀器

人正常肝細(xì)胞系L02，由本實(shí)驗(yàn)室保存。MitoQ和t-BHP購自Sigma公司；Mito-SOX R ed購自Life T echnologies公司；RIPA裂解液購自碧云天生物科技有限公司；兔抗鼠tubulin單克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠P-p38、p38、p62和LC3-I/II單克隆抗體購自Cell Signaling公司；BCA蛋白定量分析試劑盒購自Thermo Fisher公司；p38/MAPK通路抑制劑SB203580購于Selleck公司；Universal Hood II凝膠成像系統(tǒng)為Bio-Rad公司產(chǎn)品；fluo FV10i激光共聚焦顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品；Infinite M200 PRO全波段酶標(biāo)儀為Tecan產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理人正常肝細(xì)胞系L02細(xì)胞，于MEM完全培養(yǎng)基(含青霉素G 100 U/L，鏈霉素100 mg/L，10%胎牛血清)，37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下常規(guī)培養(yǎng)。以2×105/mL接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿上，傳代24 h后，分別以100、200、400、800、1 000 μmol/L t-BHP處理L02細(xì)胞6 h后檢測自噬及ROS相關(guān)指標(biāo)。在干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，線粒體靶向抗氧化劑MitoQ(1和10 μmol/L)和針對p38/MAPK通路的特異性抑制劑SB203580(10 μmol/L)均在t-BHP處理前30 min加入。

1.2.2細(xì)胞免疫熒光染色細(xì)胞按1.2.1處理后，用4%多聚甲醛固定20 min，0.5% Triton X-100破膜5 min，充分洗滌，5% BSA室溫封閉1 h，滴加LC3-I/II抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜，充分洗滌，羊抗兔FITC二抗(1∶100)室溫孵育1 h，充分洗滌，用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.2.3細(xì)胞線粒體ROS水平檢測細(xì)胞接種于6孔板上，分組處理同1.2.1。以1∶1 000 Mito-SOX Red染色30 min，消化、收集細(xì)胞，充分洗滌后用流式細(xì)胞儀于510和580 nm波長處檢測熒光強(qiáng)度。

1.2.4蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)消化、收集處理的細(xì)胞，以每1×106個細(xì)胞加入100 μL RIPA細(xì)胞裂解液，裂解充分后以14 000 g、4 ℃離心20 min，取上清為細(xì)胞總蛋白，采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度定量后，加入等體積2×SDS上樣緩沖液(含0.1 mol/L DTT)，100 ℃煮沸5 min。根據(jù)BCA蛋白定量結(jié)果計算樣品的上樣量，每孔總蛋白25 μg，選用12% SDS-PAGE凝膠和Tris-甘氨酸電泳緩沖液電泳，室溫穩(wěn)壓150 V電泳60 min。采用半干轉(zhuǎn)裝置將蛋白轉(zhuǎn)于PVDF膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉搖床2 h，TBST洗膜，加入按要求稀釋的兔抗鼠tubulin、P-p38、p38、p62、LC3-I/II單克隆抗體，4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜，加入二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜后，發(fā)光、凝膠成像系統(tǒng)拍照，結(jié)果采用Quantity One軟件進(jìn)行量化分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 1 3.0軟件，結(jié)果用x±s表示，采用ANOVA單因素方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行各組間數(shù)據(jù)的比較。

2　結(jié)果

2.1t-BHP處理對L02細(xì)胞自噬水平的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，在不同濃度t-BHP處理?xiàng)l件下，綠色熒光點(diǎn)代表的自噬小體明顯隨劑量的加大而增多，如圖1所示。隨t-BHP濃度增加，蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3-II表達(dá)水平明也依次升高，與對照組相比，在800和1 000 μmol/L時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；且細(xì)胞內(nèi)p62蛋白水平降低，與對照組相比，在800和1 000 μmol/L時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，如圖2所示。這些結(jié)果均顯示，一定濃度t-BHP可誘導(dǎo)L02細(xì)胞發(fā)生自噬。

2.2t-BHP處理對L02細(xì)胞線粒體ROS的影響以及線粒體靶向抗氧化劑MitoQ的保護(hù)作用

采用線粒體ROS探針Mito-SOX Red染色方法測定L02細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS水平，結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS水平隨t-BHP濃度的增加而增加，與對照組相比，在t-BHP≥400 μmol/L時差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，如圖3所示。針對升高的線粒體ROS，我們采用經(jīng)典的線粒體靶向抗氧化劑MitoQ(1和10 μmol/L)進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與1 000 μmol/L t-BHP單獨(dú)處理組相比，MitoQ處理組自噬標(biāo)志蛋白LC3-II水平隨著MitoQ劑量增加而降低(P＜0.05)，同時p62蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，如圖4所示。以上結(jié)果顯示，t-BHP 可通過誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體ROS水平升高，誘導(dǎo)自噬發(fā)生。

圖1　不同濃度t-BHP處理L02細(xì)胞6 h后LC3免疫熒光檢測結(jié)果

圖2　不同濃度t-BHP處理L02細(xì)胞6 h后LC3-II及p62蛋白免疫印跡檢測結(jié)果

2.3p38/MAPK通路在t-BHP誘導(dǎo)自噬中的作用

以1 000 μmol/L t-BHP處理L02細(xì)胞6 h后，蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，與對照組相比P-p38蛋白水平顯著升高(P＜0.05)，如圖5所示。針對p38/MAPK通路，給予特異性抑制劑SB203580(10 μmol/L)預(yù)處理30 min后，再給予1 000 μmol/L t-BHP處理6 h，蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，與t-BHP單獨(dú)處理組相比，P-p38蛋白水平明顯減少(P＜0.05)，同時LC3-II蛋白水平也隨之下降(P＜0.05)，p62蛋白明顯升高(P＜0.05)，見圖6。以上結(jié)果表明，p38/MAPK通路參與了t-BHP誘導(dǎo)的自噬發(fā)生。

圖3　不同濃度t-BHP對L02細(xì)胞線粒體ROS水平的影響

圖4　 MitoQ對1 000 μmol/L t-BHP誘導(dǎo)L02細(xì)胞自噬標(biāo)志物變化的影響

圖5　t-BHP對L02細(xì)胞p38磷酸化水平的影響

3　討論

研究發(fā)現(xiàn)多種應(yīng)激因素誘導(dǎo)自噬均與誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生密切相關(guān)[4]，但多數(shù)研究中ROS氧化應(yīng)激同時復(fù)合了多種其他應(yīng)激損傷機(jī)制，單一ROS直接誘導(dǎo)自噬的研究報道并不多。建立ROS直接誘導(dǎo)的自噬模型，將進(jìn)一步確證ROS誘導(dǎo)自噬的獨(dú)立作用，同時也將為ROS誘導(dǎo)自噬的分子機(jī)制研究，以及針對ROS及相關(guān)靶點(diǎn)調(diào)控自噬的抗氧化劑篩選提供了合適的研究平臺和手段。

圖6　抑制劑SB203580對t-BHP誘導(dǎo)細(xì)胞自噬及p38磷酸化水平的影響

ROS是一類性質(zhì)活潑的含氧自由基及衍生物的統(tǒng)稱，代表性的有超氧陰離子()、羥自由基(·OH)、單線態(tài)氧)和過氧化氫(H2O2)等，其中H2O2由于半衰

22期較長而常被用于氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)劑。但在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，H2O2仍然很容易分解而不容易實(shí)現(xiàn)較穩(wěn)定的氧化應(yīng)激[5]。t-BHP分子結(jié)構(gòu)中一個-(CH3)，置換了H2O2中的-OH，其穩(wěn)定性加強(qiáng)，而體內(nèi)代謝后則可重新置換釋放H2O2，從而實(shí)現(xiàn)較長時間的氧化應(yīng)激，因此，t-BHP在許多研究中被作為高效、緩釋的氧化劑使用[6]。如我們實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用t-BHP建立氧化應(yīng)激復(fù)合高脂高糖誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗模型[7]。但尚未有報道將t-BHP作為自噬誘導(dǎo)劑的研究。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)中，分別檢測了1h、3h、6h、12h和24h不同處理時間條件下自噬各指標(biāo)變化，發(fā)現(xiàn)6h處理?xiàng)l件下各指標(biāo)變化明顯且細(xì)胞狀態(tài)良好，故在整個研究中均選擇6h作為統(tǒng)一的處理觀察時間。

自噬過程由一系列自噬相關(guān)蛋白協(xié)作共同完成，這些蛋白質(zhì)在自噬體形成的不同階段發(fā)揮作用。當(dāng)自噬體形成后，LC3-I和磷脂酰乙醇胺(phosphatidy lethano lamine，PE)偶聯(lián)形成LC3-II并定位于自噬體內(nèi)膜和外膜，并且LC3-II能始終穩(wěn)定地保留在自噬體膜上直至與溶酶體融合，因此被用來作為自噬體的標(biāo)記，LC3-II的水平在某種程度上反映了自噬體的數(shù)量[8]。在本研究中隨著t-BHP濃度的增加，LC3-II的免疫熒光聚集明顯增加，蛋白印跡雜交結(jié)果也證明了LC3-II的水平增加，這提示適量的t-BHP可以明顯誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。為了確證自噬的發(fā)生，我們進(jìn)一步檢測另一個重要自噬標(biāo)志物p62。p62是SQSTM1編碼的泛素結(jié)合蛋白，參與自噬蛋白降解過程。p62蛋白本身也是自噬的選擇性底物之一，當(dāng)自噬發(fā)生時，細(xì)胞內(nèi)p62被降解，p62蛋白含量降低[9]。在本研究中p62蛋白水平顯著降低，與升高的LC3-II的水平變化相對應(yīng)，進(jìn)一步證明t-BHP誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)的重要細(xì)胞器，線粒體氧化呼吸鏈也是正常情況下細(xì)胞內(nèi)源性ROS的最主要來源。大量研究表明，線粒體也是眾多內(nèi)外損傷因素的作用靶點(diǎn)，誘導(dǎo)線粒體大量產(chǎn)生ROS是其中重要的共有機(jī)制[10-11]。而最近有研究表明，外源性的氧化應(yīng)激也往往是通過多種信號通路刺激線粒體產(chǎn)生ROS而發(fā)揮作用，出現(xiàn)一種被稱之為“ROS誘導(dǎo)ROS釋放”的現(xiàn)象[12]，本研究中，我們采用線粒體ROS標(biāo)記探針Mito-SOX Red檢測線粒體內(nèi)的ROS水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，線粒體ROS水平隨著t-BHP的劑量增加而顯著升高，提示了線粒體ROS可能參與了t-BHP誘導(dǎo)的自噬。為了進(jìn)一步確證線粒體ROS在此過程中的作用，我們采用線粒體靶向抗氧化劑MitoQ進(jìn)行干預(yù)研究。MitoQ是目前研究最多和應(yīng)用最廣泛的線粒體靶向抗氧化劑，可以不斷地清除過氧化氫、過氧亞硝酸鹽、超氧化物，保護(hù)線粒體對抗脂質(zhì)過氧化[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MitoQ可以顯著拮抗t-BHP處理引起的LC3-II水平的增加以及p62蛋白的減少，表明線粒體ROS確實(shí)參與了t-BHP誘導(dǎo)的自噬的發(fā)生。

調(diào)控自噬的信號通路很多，主要包括兩類，即依賴mTOR(雷帕霉素靶點(diǎn))途徑的自噬，具體又包括PI3K/ AKT/mTOR和信號通路[14-15]，以及非依賴mTOR的信號通路。p38/MAPK通路是受氧化應(yīng)激調(diào)控的重要下游信號通路，已有許多報道認(rèn)為p38/MAPK通路可以調(diào)節(jié)依賴mTOR信號通路的自噬[16]。為了明確p38/MAPK通路在t-BHP誘導(dǎo)自噬過程中的作用，首先我們觀察了p38蛋白及其磷酸化激活情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)t-BHP處理可以顯著提高p38的磷酸化水平，提示p38/MAPK通路可能參與了t-BHP誘導(dǎo)的自噬的發(fā)生。為了進(jìn)一步確證，我們采用p38/MAPK特異性抑制劑SB203580進(jìn)行干預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制p38/MAPK通路后可以有效拮抗t-BHP處理引起的LC3-II蛋白水平的增加以及p62蛋白水平的減少，表明p38/MAPK通路參與了t-BHP誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。

綜上所述，本研究成功建立了t-BHP誘導(dǎo)的體外人正常肝細(xì)胞系L02的自噬模型，并且初步證明了線粒體ROS介導(dǎo)了該自噬過程的發(fā)生，在此過程中p38/MAPK通路發(fā)揮了重要作用。該模型將為ROS直接誘導(dǎo)自噬的研究提供了實(shí)驗(yàn)手段，同時也為將來進(jìn)一步針對線粒體為靶點(diǎn)的抗氧化調(diào)控自噬的研究提供了可靠的平臺。

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Involvement of mitochondria for induction of autophagy by tert-butyl hydroperoxide in human hepatic cell line L02

SHI Tengrui1，3，LI Ge2，3，HAI Chunxu1，3，QIN Xujun1，2，3，*
(1. Department of Toxicology, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032; 2. Department of Nutrition and Food Hygiene, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032; 3. The Key Laboratory of Free Radical Biology and Medicine of Shaanxi Province, School of Preventive Medicine, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi, China)

tert-butyl hydroperoxide；autophagy；mitochondria；reactive oxygen species；p38/MAPK

R114；R992

A

1004-616X(2016)02-0091-06

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.002

2015-12-15；

2016-01-19

國家自然科學(xué)基金(81270417，31070766，30300074)；陜西省青年科技新星人才基金(2010KJXX-06)

作者信息： 師騰瑞，E-mail：526611412@qq.com。*

，秦緒軍，E-mail：qinxujun@hotmail.com