陳兵兵，羅桂林，徐龍龍，楊金會

(1 寧夏理工學(xué)院文理學(xué)院，寧夏　石嘴山　753000；2 寧夏大學(xué) 天然氣轉(zhuǎn)化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，寧夏　銀川　750021)

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寧夏紫花苜?？傸S酮提取工藝的研究*

陳兵兵1，羅桂林1，徐龍龍1，楊金會2

(1 寧夏理工學(xué)院文理學(xué)院，寧夏石嘴山753000；2 寧夏大學(xué) 天然氣轉(zhuǎn)化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，寧夏銀川750021)

研究了寧夏石嘴山市鹽堿地種植的紫花苜蓿中總黃酮的提取方法，通過醇提取法對乙醇濃度、提取時間、固液比和提取溫度等進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)最佳提取工藝為回流時間6 h、固液比為1:40、乙醇濃度為50%、溫度為70℃，在此條件下紫花苜?？傸S酮單次提取量為8.7813 mg/g。

紫花苜蓿；總黃酮；提取

苜蓿主要種植在我國青海、新疆、寧夏、甘肅、內(nèi)蒙古等地，苜蓿中含有多種生物活性成分，黃酮化合物是其主要活性成分之一[1]，這些化合物大部分具有護(hù)肝、解毒、抗真菌及抗自由基和抗氧化作用[2-4]。黃酮化合物還具有植物雌激素樣的作用，在畜牧業(yè)動物生產(chǎn)上能顯著提高動物生產(chǎn)性能和動物機(jī)體抗病力[5-6]。

國內(nèi)對不同地區(qū)和不同產(chǎn)地的紫花苜蓿中總黃酮提取工藝報道的很多，但從寧夏石嘴山市鹽堿地種植的紫花苜蓿中提取總黃酮的研究方面未見報道。本實(shí)驗(yàn)以寧夏石嘴山市大武口區(qū)鹽堿地種植的苜蓿為研究對象，通過單因素的影響進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選出最佳提取工藝條件，為寧夏石嘴山地區(qū)苜蓿的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論參考。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1材料

紫花苜蓿采集于寧夏理工學(xué)院園林區(qū)，于2014年6月采集，經(jīng)曬烘干、粉碎備用。

1.2儀器及藥品

101-3型電鼓風(fēng)干燥箱，天津市通利信達(dá)科技有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵，陜西太康生物科技有限公司；紫外分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司，DF-101Z集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，山東菏澤祥龍電子科技有限公司；電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1檢測波長的選擇

對照品溶液和樣品溶液在200～700 nm之間進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在380 nm附近有最大吸光度，實(shí)驗(yàn)中選擇測定波長為380 nm。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取已經(jīng)在100℃下干燥恒重的蘆丁對照品35.7 mg，用30%的乙醇定容到250mL的容量瓶中，再吸取25mL的標(biāo)準(zhǔn)液，用30%的乙醇定容到50mL的容量瓶中，準(zhǔn)確移去上述溶液0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL于10mL的容量瓶中，用30%的定容測定吸光度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：A=0.0046+20.7918C0，R2=0.99987(圖1)。

圖1　標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2　結(jié)果與討論

2.1固液比對總黃酮提取量的影響

準(zhǔn)確稱取1.00 g的苜蓿5份，分別用固液比為1:10、1:20、1:30、1:40、1:50的30%的乙醇溶液侵泡24 h，然后在60℃的條件下加熱回流1 h，冷卻后用活性炭脫色24 h后減壓過濾收集濾液，用30%的乙醇溶液定容于100mL容量瓶中，搖勻后取2mL溶液定容于10mL容量瓶，分別測定吸光度，分析固液比對總黃酮提取量的影響。

表1　固液比對總黃酮提取量的影響

2.2乙醇濃度對總黃酮提取量的影響

準(zhǔn)確稱取1.00 g的苜蓿6份，以固液比為1:30，分別用濃度為30%、40%、50%、60%、80%和100%的乙醇溶液侵泡24 h，然后在60℃的條件下加熱回流1 h，冷卻后用活性炭脫色24 h后減壓過濾收集濾液，用30%的乙醇溶液定容于50mL 容量瓶中，測定吸光度分析乙醇濃度對總黃酮提取量的影響。

表2　乙醇濃度對總黃酮提取量的影響

2.3溫度對總黃酮提取量的影響

準(zhǔn)確稱取1.00 g的苜蓿7份，以固液比為1:30的30%的乙醇溶液浸泡24 h，然后在溫度為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃的條件下加熱回流1 h，冷卻后用活性炭脫色24 h后減壓過濾收集濾液，用30%的乙醇溶液定容于50mL 容量瓶中，測定吸光度分析溫度對總黃酮提取量的影響。

表3　溫度對總黃酮提取量的影響

2.4時間對總黃酮提取的影響

準(zhǔn)確稱取1.00 g的苜蓿6份，以固液比為1:30的30%的乙醇溶液浸泡24 h，然后在60℃的條件下加熱回流1 h、2 h、3 h、4 h、5 h和6 h，冷卻后用活性炭脫色24 h后減壓過濾收集濾液，用30%的乙醇溶液定容于50mL容量瓶中，測定吸光度分析時間對總黃酮提取量的影響。

表4　時間對總黃酮提取量的影響

2.5提取次數(shù)對總黃酮提取量的影響

準(zhǔn)確稱取1.00 g的苜蓿1份，以固液比為1:30的30%的乙醇溶液浸泡24 h，然后在60℃條件下加熱回流1 h，測定總黃酮的含量，殘?jiān)蒙鲜鱿嗤姆椒ㄖ貜?fù)提取4次，分別測定總黃酮的含量如表5所示。

表5　取次數(shù)對總黃酮提取量的影響

2.6正交實(shí)驗(yàn)

由于苜蓿的提取量受到時間、溫度、固液比和濃度4個因素的綜合影響，為了全面研究4個因素對黃酮提取的影響，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以苜蓿的提取量為考察指標(biāo)，設(shè)計L9(34)正交試驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計表6，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。

表6　正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計表

表7　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過正交實(shí)驗(yàn)的分析，反應(yīng)時間、固液比、乙醇濃度和溫度4因素均對苜?？傸S酮的提取量具有極顯著的影響，且4因素的影響主次分別為乙醇濃度>時間>溫度>固液比；從而得出最佳提取工藝為反應(yīng)時間6 h、固液比為1:40、乙醇濃度為50%、溫度為70℃，在此條件下，紫花苜?？傸S酮提取量為8.7813 mg/g。

2.7穩(wěn)定性測定

準(zhǔn)確稱取1.00 g 備用的苜蓿5份，用固液比為1:40的50%乙醇溶液浸泡24 h，在溫度70℃條件下回流6 h，用活性炭脫色24 h后減壓過濾收集濾液，用50%的乙醇溶液定容于100mL容量瓶中，搖勻后取2mL溶液定容于10mL容量瓶，測量吸光度。

表8　穩(wěn)定性測定

3　結(jié)　論

通過實(shí)驗(yàn)探究，我們已經(jīng)得到了苜?？傸S酮提取工藝的最佳條件，即回流時間6 h、固液比為1:40、乙醇濃度為50%、溫度為70℃時苜蓿總黃酮提取量最高量為8.7813 mg/g；若按照提取5次得到總黃酮(5次提取量的總和為15.5589 mg/g)的含量分析，單次總黃酮的最高提取率為56.4%。通過對提取工藝穩(wěn)定性考察發(fā)現(xiàn)，苜蓿總黃酮提取總量在8.5501～9.2041 mg/g之間，單次提取率在54.9%～59.2%之間，工藝穩(wěn)定。

[1]盧成,曾昭海,張濤,等.紫花苜蓿生物活性成分研究進(jìn)展[J].草業(yè)科學(xué),2005,22(9):28-31.

[2]Meragelman T L,Tucker K D,McClord T G,et al.Antifungal flavonoids from Hildegardia barteri [J].J Nat Prod,2005,68:1790-1792.

[3]Rahman M M,Gray A I.Antibacterial and antifungal activities of the constituents of Flemingia paniculata [J].Pharm Biol,2008,46:356-359.

[4]Hirpara K V,Aggarwal P,Mukherjee A J,et al.Quercetin and its derivatives:synthesis,pharmacological uses with special emphasis on antitumor properties and prodrug with enhanced bioavailability [J].Curr Med Chem,2009,9(2):138-161.

[5]謝棒祥,張敏紅,杜榮,等.類黃酮對肉仔雞生產(chǎn)性能及脂質(zhì)代謝的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2002,14(4):49-53.

[6]陶勝宏,韓正康,王國杰.伊普異黃酮對不同生長階段肉雞生長性能和有關(guān)血清生化指標(biāo)的影響[J].畜牧獸醫(yī),2007,39(2):18-21.

Study on Extraction of Flavonoids in Medicago Saliva L from Nningxia*

CHEN Bing-bing1,LUO Gui-lin1,XU Long-long1,YANG Jin-hui2

(1 Wenli College,Ningxi Institute of Science and Technology,Ningxia Shizuishan 753000;2 State Key Laboratory Cultivation Base of Natural Gas Conversion,Ningxia University,Ningxia Yinchuan 750021,China)

The technology for extraction of total flavonoid of Medicago saliva L(alfalfa) plant originated to Saline-alkali from Ningxia was studied.Taking ethanol as extraction,one-factor experiment of ethanol concentration,extraction times,ratio of solid to liquid,and extraction temperature and the orthogonal experiment were studied.The results showed that the optimal extraction technics were as follows:ratio of solid to liquid was at 1:40,extraction time was 6 h,ethanol concentration was at 50%,and extraction temperature was 70℃.Under this condition,the ethanol extracted rate of total flavonoid in alfalfa was 8.7813 mg/g.

Medicago saliva L; total flavonoid; extraction

寧夏理工學(xué)院大學(xué)生質(zhì)量工程項(xiàng)目(No.20130502)。

陳兵兵(1987-)，男，助教，主要從事天然產(chǎn)物全合成及有機(jī)反應(yīng)研究。

O69

A

1001-9677(2016)011-0087-03