王友德，張麗穎

(河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北　承德　067000)

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一種天然五環(huán)三萜化合物的合成及抑制活性研究*

王友德，張麗穎

(河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德067000)

以積雪草酸為原料首次利用化學(xué)方法對(duì)2α,23-二乙酰氧基積雪草酸進(jìn)行了化學(xué)合成研究，所有化合物均經(jīng)IR、1H-NMR、13C-NMR和MS測(cè)試確認(rèn)結(jié)構(gòu)。對(duì)所有化合物的糖原磷酸化酶抑制活性的研究結(jié)果表明，所合成的衍生物顯示出了一定的糖原磷酸化酶抑制活性,其中積雪草酸芐酯5(IC50=3.81μM)的糖原磷酸化酶抑制活性優(yōu)于其先導(dǎo)化合物積雪草酸(IC50=17μM)。

五環(huán)三萜；2α,23-二乙酰氧基積雪草酸；糖原磷酸化酶

乙酰五環(huán)三萜是天然五環(huán)三萜化合物中的一類重要化合物，存在于多種植物中。大量研究表明，該類化合物具有廣泛的生物活性，如降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗炎以及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等[1-4]。如3-O-乙?；R墩果酸 (1)是刺枝豆屬植物Eysenhardtia platycarpa樹干的主要活性成分，可以顯著降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的血糖[5]。3-O-乙酰基-16-羥基白樺酸(2)是古夷蘇木(Fagara tessmannii)中的重要成分，具有顯著的α-糖苷酶的抑制活性[6]。α-乙酰乳香酸(3)是中藥乳香的有效成分，對(duì)拓樸異構(gòu)酶I和II有較強(qiáng)的抑制活性[7]。

1971年，Gupta A S等從龍腦香科植物樹干分泌的樹脂中分離得到的一個(gè)天然五環(huán)三萜化合物，2α,23-二乙酰氧基積雪草酸(4)，該化合物也是一個(gè)天然乙酰五環(huán)三萜化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有兩個(gè)乙酰氧基的結(jié)構(gòu)單元[8]。但是，由于該化合物在自然界中含量很少，只靠提取對(duì)其進(jìn)行制備很難得到足夠的量對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的藥學(xué)研究。因此需要一種有效的合成方法對(duì)這類化合物的深入藥學(xué)研究提供原料保證。因此，我們以積雪草酸為原料，巧妙的利用轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，對(duì)2α,23-二乙酰氧基積雪草酸進(jìn)行了首次化學(xué)合成研究，具體合成路線見圖2，并對(duì)合成中所涉及到的所有化合物進(jìn)行了初步的糖原磷酸化酶抑制活性研究。

圖1　天然乙酰五環(huán)三萜的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖2　2α,23-二乙酰氧基積雪草酸的合成路線

1　儀器與材料

AVANCE-300MHz型核磁共振儀,德國Bruker；SHIMADZU FTIR-8400S傅里葉變換紅外光譜儀,德國Bruker；HP1100LC/MSD,美國PE；maXis impact-HRMS,德國Bruker；RY-1熔點(diǎn)儀,天津市分析儀器廠；酶標(biāo)儀,美國BIO-RAD公司。試劑均為化學(xué)純或分析純?cè)噭?/p>

2　方法與結(jié)果

2.1化合物的合成與表征

2.1.12α,3β-二羥基-23-叔丁基二甲基硅氧基熊果烷-12-烯-28-羧酸芐酯(6)

將3β-羥基齊墩果烷-12-烯-28-羧酸-6-[4-(4-氨基苯甲?；?苯甲酰氧基]己基酯(0.49 g,0.85 mmol)溶于DMF(5mL)中，緩慢加入咪唑(0.13 g,1.91 mmol)，叔丁基二甲基氯硅烷(0.13 g,0.85 mmol)，室溫?cái)嚢柽^夜，反應(yīng)液傾入冰水(20mL)中、乙酸乙酯(30mL×3)萃取。然后依次以水和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥后蒸去溶劑?？焖僦鶎游?石油醚/乙酸乙酯=8/1,V/V)，得淡黃色固體(0.13 g,22%)。IR (KBr,cm-1):3409,2924,1724,1454。1H-NMR (300 MHz):0.06 (6H,s),0.63 (3H,s),0.84 (6H,s),0.86 (3H,s),0.90 (6H,s),0.91,0.94,0.99,1.06 (each 3H,s),2.26(1H,d,J=11.3 Hz),3.31-3.40 (2H,m),3.59 (1H,d,J=9.4 Hz),3.70～3.78 (1H,m),4.97 (1H,dd,J=12.5,34.7 Hz),5.09 (1H,dd,J=12.5,34.7 Hz),5.24 (1H,t),7.29～7.37 (5H,m)。13C-NMR (75 MHz):177.2; 138.1; 136.4; 128.4; 128.1; 127.9; 125.6; 80.5; 71.3; 68.6; 66.0; 52.9; 49.1; 48.1; 47.5; 45.9; 42.2; 42.1; 39.5; 39.1; 38.8; 37.9; 36.6; 32.6; 30.7; 27.9; 25.8; 24.2; 23.4; 23.3; 21.1; 18.4; 17.1; 17.0; 12.9; -5.6; -5.7。ESI-MS:691.5[M-H]-。

2.1.22α,3β-二乙酰氧基-23-叔丁基二甲基硅氧基熊果烷-12-烯-28-羧酸芐酯(7)

將科羅索酸(0.10 g,0.14 mmol)溶于吡啶(5mL)，緩慢加入乙酸酐(0.03mL,0.31 mmol)，室溫?cái)嚢柽^夜。減壓蒸去吡啶，殘留物以乙酸乙酯溶解后依次以1 N鹽酸、飽和碳酸氫鈉溶液和水洗滌，無水硫酸鈉干燥。除去干燥劑，母液蒸去溶劑后快速柱層析(石油醚/乙酸乙酯=8/1，V/V)得白色固體(0.08 g,74%)。m.p.159～161℃。IR (KBr,cm-1):2927,2857,1743,1250。1H-NMR (300 MHz):0.05 (6H,s),0.63,0.74 (each 3H,s),0.91 (15H,s),1.05 (9H,s),1.99,19.6 (each 3H,s),2.26(1H,d,J=11.5 Hz),2.98 (1H,dd,J=10.1 Hz),3.20 (1H,dd,J=10.2 Hz),4.97 (1H,dd,J=12.4,37.1 Hz),5.10 (1H,dd,J=12.4,37.1 Hz),5.13～5.15 (2H,m),5.22 (1H,t),7.29～7.35 (5H,m).13C-NMR (75 MHz):177.2; 171.0; 170.7; 170.1; 169.8; 138.4; 138.2; 136.4; 128.4; 128.4; 128.2; 128.1; 128.0; 125.4; 125.2; 77.7; 74.8; 70.6; 67.4; 66.0; 65.6; 64.2; 53.0; 52.9; 48.2; 48.1; 48.0; 47.5; 46.1; 43.9; 43.2; 42.2; 42.1; 41.8; 39.6; 39.4; 39.1; 38.8; 37.7; 37.6; 36.6; 32.6; 32.3; 30.7; 29.7; 27.9; 25.8; 25.7; 24.2; 23.4; 23.3; 22.7; 22.6; 21.2; 21.1; 20.9; 20.7; 18.0; 17.7; 17.2; 17.1; 17.0; 17.0; 16.9; 16.9; 14.1; 14.0; 14.0; -4.3; -4.8; -5.8; -5.9。ESI-MS:777.5[M+H]+。

2.1.32α,23-二乙酰氧基-3β-羥基熊果烷-12-烯-28-羧酸芐酯(8)

將2α,3β-二乙酰氧基-23-叔丁基二甲基硅氧基熊果烷-12-烯-28-羧酸芐酯(0.1 g,0.13 mmol)溶于四氫呋喃(2mL)中，冰浴下加入四丁基氟化胺(40 mg,0.15 mmol)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜。反應(yīng)液以乙酸乙酯稀釋后，飽和食鹽水洗滌，無水Na2SO4干燥。過濾，濃縮，快速柱層析 (石油醚/乙酸乙酯=1/1,V/V)，得白色固體(48 mg,56%)。m.p.198～200℃。IR(KBr,cm-1):2923,2870,1727,1240。1H-NMR(300 MHz):0.62 (3H,s),0.83 (3H,d,J=5.5 Hz),0.96,1.05,1.06 (each 3H,s),2.06,2.07 (each 3H,s),2.26(1H,d,J=11.4 Hz),3.49 (1H,d,J=10.0 Hz),3.92 (1H,dd,J=11.3,43.3 Hz),4.07 (1H,dd,J=11.3,43.3 Hz),4.92～5.06 (2H,m),5.10 (1H,d,J=12.5 Hz),5.22 (1H,t),7.28～7.37 (5H,m)。13C-NMR (75 MHz):177.2; 171.4; 170.9; 138.3; 128.4; 128.3; 128.0; 125.3; 74.7; 72.8; 66.1; 66.0; 53.0; 48.2; 47.8; 47.6; 43.7; 42.8; 42.1; 39.6; 39.1; 38.9; 38.0; 36.6; 32.6; 30.7; 27.9; 24.2; 23.5; 23.4; 21.3; 21.2; 20.9; 18.1; 17.0; 17.0; 13.1.ESI-MS:685.4[M+Na]+。

2.1.42α,23-二乙酰氧基-3β-羥基熊果烷-12-烯-28-羧酸 (2α,23-二乙酰氧基積雪草酸)(4)

將3β-棕櫚?；R墩果烷-12-烯-28-羧酸芐酯(0.30 g,0.45 mmol)溶于四氫呋喃(10mL)中，加入催化量的10%Pd/C，室溫常壓氫化24 h。常壓過濾除去Pd/C，濾液蒸干得到粘稠狀液體。柱層析(石油醚/乙酸乙酯=20:1,V/V)分離，得到白色固體(0.21 g,82%)。m.p.160～162℃。IR (KBr,cm-1):2924,2870,1729,1240。1H-NMR (300 MHz):0.77 (3H,s),0.83 (3H,d,J=4.9 Hz),0.95 (3H,s),1.08 (9H,s),2.07,2.08 (each 3H,s),2.19 (1H,d,J=11.2 Hz),3.49 (1H,d,J=10.1 Hz),3.93 (1H,d,J=11.4 Hz),4.09 (1H,d,J=11.4 Hz),5.00～5.06 (1H，m),5.24 (1H,t)。13C-NMR (75 MHz):182.9; 171.4; 170.9; 138.1; 125.4; 76.6; 72.7; 66.1; 52.6; 48.0; 47.7; 47.6; 43.7; 42.8; 42.0; 39.6; 39.1; 38.8; 38.0; 36.7; 32.6; 30.6; 29.7; 28.0; 24.1; 23.5; 23.4; 21.3; 21.2; 20.9; 18.1; 17.1; 16.9; 13.1。ESI-MS:595.5[M+Na]+。

2.2化合物對(duì)糖原磷酸化酶的抑制活性測(cè)試

參照文獻(xiàn)[9]方法，對(duì)本文合成的4個(gè)化合物，以咖啡因?yàn)殛栃詫?duì)照，進(jìn)行了抑制兔肌肉糖原磷酸化酶(RMGPa)活性測(cè)試。操作流程如下：在微孔板中加入反應(yīng)緩沖液，加入待測(cè)化合物及RMGPa，室溫溫孵20 min，加入顯色液(鉬酸銨和孔雀綠)，用BIORAD多功能酶標(biāo)儀測(cè)定(檢測(cè)波長：655 nm)。

2.3糖原磷酸化酶抑制活性結(jié)果與討論

表1　4個(gè)新化合物對(duì)RMGPa的抑制活性

a每個(gè)結(jié)果都是三組實(shí)驗(yàn)的平均值;bNI 為無抑制活性;c以咖啡因?yàn)殛栃詫?duì)照。

本文測(cè)定了4個(gè)新化合物對(duì)RMGPa的抑制活性，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示：所合成的衍生物顯示出了一定的糖原磷酸化酶抑制活性，其中積雪草酸芐酯(5)(IC50=3.81μM)的抑制活性優(yōu)于其先導(dǎo)化合物積雪草酸(IC50=17μM)。遺憾的是，所合成的天然產(chǎn)物2α,23-二乙酰氧基積雪草酸(4)并未顯示出GP抑制活性，這點(diǎn)之前文獻(xiàn)報(bào)道的三乙酰氧基積雪草酸活性類似，提示3位羥基應(yīng)為GP抑制活性必須基團(tuán)。關(guān)于該天然產(chǎn)物的其他藥理活性正在進(jìn)一步研究中。

3　結(jié)　論

以積雪草酸為母核，共合成3個(gè)新的未見文獻(xiàn)報(bào)道的積雪草酸衍生物，對(duì)實(shí)驗(yàn)中涉及到的米而文芳基化反應(yīng)條件進(jìn)行了摸索及討論，使得反應(yīng)副產(chǎn)物相對(duì)減少，提高了產(chǎn)率。對(duì)所合成的3個(gè)衍生物進(jìn)行了糖原磷酸化酶抑制活性測(cè)試?；钚詼y(cè)試結(jié)果顯示3個(gè)化合物均顯示出一定的糖原磷酸化酶抑制活性。后續(xù)工作中，我們將繼續(xù)系統(tǒng)的開展不同取代基類別對(duì)酶抑制活性的構(gòu)效關(guān)系研究。

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Synthesis and Evaluation of Natural Compounds of Pentacyclic Triterterpenes as Inhibitors of Glycogen Phosphorylase*

WANG You-de,ZHANG Li-ying

(Key Laboratory of Research and Exploiture for New Drugs of Chinese Materia Medicine,Institute of Chinese Materia Medica,Chengde Medical College,Hebei Chengde 067000,China)

For the first time,we did research into 2α,23-diacetoxy asiatic acid by chemical process from asiatic acid and all compounds were confirmed by IR,1H-NMR,13C-NMR and MS.They also have been tested biological inhibitory activity of all compounds by using glycogen phosphorylase.The research results indicated that asiatic acid benzyl ester 7 showed optimal inhibition with the IC50of 3.81μM.

Pentacyclic Triterterpenes; 2α,23-diacetoxy asiatic acid; Glycogen Phosphorylase

河北省教育廳資助項(xiàng)目(No.Y2012026)。

張麗穎(1981-)，女，副教授，主要從事藥物設(shè)計(jì)與合成研究。

R914.5

A

1001-9677(2016)011-0059-03