芮海云，張興興，莊　凱，沈振國，張芬琴

(1 泰州學(xué)院，江蘇泰州 225300；2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，南京210095；3 河西學(xué)院，甘肅張掖734000)

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箭舌豌豆根系抗壞血酸及相關(guān)酶對鎘脅迫的響應(yīng)

芮海云1,2，張興興2，莊凱2，沈振國2，張芬琴3

(1 泰州學(xué)院，江蘇泰州 225300；2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，南京210095；3 河西學(xué)院，甘肅張掖734000)

以箭舌豌豆(ViciasativaL.)品種L3(耐鎘)和ZM(鎘敏感)為材料，研究了不同程度鎘脅迫下箭舌豌豆幼苗根系抗壞血酸(AsA)含量、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)同工酶活性、抗壞血酸過氧化物酶(APX)同工酶活性以及APX基因表達(dá)的變化。結(jié)果顯示：(1)2個箭舌豌豆品種根系A(chǔ)sA和脫氫抗壞血酸(DHA)含量在鎘脅迫下顯著升高；AsA/DHA比值在鎘耐性品種L3中顯著升高，在敏感品種ZM中顯著下降；相同鎘處理濃度下，L3根系A(chǔ)sA含量和AsA/DHA比值顯著大于ZM。(2)2個品種根系DHAR的活性電泳共顯示4條同工酶條帶，它們的活性均隨鎘處理濃度的升高而升高；其中DHAR1只在L3顯示，DHAR4只在ZM顯示；相同鎘處理濃度下，品種L3 的DHAR的總活性大于品種ZM。(3)2個品種根系A(chǔ)PX的活性電泳共顯示11條同工酶條帶，其中的APX1、2、4僅在敏感品種ZM中受鎘脅迫誘導(dǎo)，APX 8在耐性品種L3中受到比敏感品種ZM更顯著的誘導(dǎo)；克隆得到1個箭舌豌豆APX基因，熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示該基因的轉(zhuǎn)錄在L3和ZM根系均受鎘處理誘導(dǎo)。研究表明，鎘脅迫下2個箭舌豌豆品種根系A(chǔ)sA含量，AsA代謝相關(guān)酶DHAR和APX的活性以及APX的轉(zhuǎn)錄水平均顯著升高；鎘耐性品種L3較敏感品種ZM能更有效地促進AsA循環(huán)，維持更高的AsA水平，從而更有效地緩解鎘脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化脅迫，這可能是L3較ZM具有更高鎘耐性的重要機制之一。

箭舌豌豆；鎘耐性；抗壞血酸；抗壞血酸過氧化物酶；脫氫抗壞血酸還原酶

鎘是毒性最強的重金屬之一，因其易被植物吸收，并進一步通過食物鏈危害人體健康，因此受到特別的關(guān)注。鎘不具有氧化還原活性，不能引起Fenton和Haber-Weiss反應(yīng)，但鎘脅迫常導(dǎo)致植物產(chǎn)生和積累大量的活性氧(ROS)[1-2]，ROS會誘導(dǎo)膜脂過氧化、產(chǎn)生質(zhì)膜損傷，因此氧化損傷被認(rèn)為是植物鎘毒害的主要原因之一[3]。許多研究報道了鎘處理下植物氧化脅迫的產(chǎn)生[4-5]?？箟难?AsA)是植物體內(nèi)高豐度小分子抗氧化物質(zhì)，是抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，被認(rèn)為是氧化還原的中心，在植物抵抗氧化脅迫中具有重要作用。AsA存在于植物細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、線粒體和質(zhì)外體中，可以通過抗壞血酸過氧化物酶APX的催化作用或者本身直接與H2O2反應(yīng)，將H2O2還原為H2O，降低植物細(xì)胞的H2O2積累，減輕植物的氧化脅迫傷害。AsA本身被氧化為脫氫抗壞血酸( DHA)，DHA通過脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)還原為AsA。據(jù)報道，AsA含量升高能提高植物對各種脅迫，如鹽、紫外線和冷脅迫的抵抗能力[6-7]。Burkey等[8]發(fā)現(xiàn)，臭氧脅迫下耐性品種菜豆葉中AsA的含量比敏感品種高，耐性品種能維持相對較高的AsA庫水平。Sharma和Dubey[9]報道鋁脅迫誘導(dǎo)水稻幼苗APX活性升高，同時其同工酶的組成也發(fā)生改變。也有報道AsA能提高植物對鎘脅迫的抵抗能力，如外源添加AsA合成的前體L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯，硬粒小麥 (Triticumdurumcv Creso) AsA 合成增加, 鎘脅迫產(chǎn)生的氧化脅迫得到緩解[10]。

本實驗以中國西北地區(qū)廣泛種植的耐寒旱、食飼兼用的作物箭舌豌豆(ViciasativaL.)為實驗材料，研究2個不同鎘耐性的箭舌豌豆品種在鎘脅迫下根系A(chǔ)sA含量、APX同工酶譜和基因表達(dá)以及DHAR同工酶譜的變化，進一步探討植物抗壞血酸代謝響應(yīng)鎘脅迫的機理。

1　材料和方法

1.1材料培養(yǎng)及處理

實驗材料箭舌豌豆包括1個鎘耐性品種L3和1個鎘敏感品種ZM。種子經(jīng)3%的H2O2消毒15 min，用去離子水徹底沖洗后，浸種16 h，轉(zhuǎn)移至蛭石中20 ℃～25 ℃萌發(fā)。3 d后，挑選長勢良好且一致的幼苗轉(zhuǎn)移至含2.5 L Hoagland營養(yǎng)液的培養(yǎng)缽中培養(yǎng)，每培養(yǎng)缽移苗10棵。培養(yǎng)條件如下：晝/夜溫度25 ℃/20 ℃，相對濕度60%～80% ，光照時間12 h，光照強度400 μmoL· m-2·s-1。每3 d 換1次營養(yǎng)液，營養(yǎng)液pH控制在5.5 左右。

實驗一：2個箭舌豌豆品種移苗7 d后，用25 μmol·L-1鎘處理(鎘以CdCl2·2.5 H2O的形式加入)。每個處理3次重復(fù)，處理液每3 d換1次。分別在處理0、2、4、6、8、10、12、14 d取樣用于根系生長指標(biāo)測定。

實驗二：0(Control)、10、25、50 μmol·L-1鎘處理(處理方法同實驗一)，處理 7 d 后收獲根部，立即用于實驗，或于液氮中冷凍后，-80 ℃保存供生理指標(biāo)的測定。

實驗三：移苗3 d后，轉(zhuǎn)移至加入25 μmol·L-1CdCl2的營養(yǎng)液中處理(處理方法同實驗一)，每個處理重復(fù)3次，處理96 h內(nèi)根系取樣，每個樣品為4株苗的混合樣，取樣時間為0、12、24、48、96 h。所取樣品立即于液氮中速凍，-80 ℃保存用于根系總RNA的提取。

1.2測定項目及方法

1.2.1根系生長指標(biāo)分別在25 μmol·L-1鎘處理0、2、4、6、8、10、12、14 d，測量幼苗主根長后，收獲根部，吸去表面水分稱取鮮重。

1.2.2質(zhì)膜完整性質(zhì)膜完整性的測定參照Schützendübel等[11]的伊文思藍(lán)(Evans blue)吸收法。取10株新鮮植物1 cm主根根尖，于0.025%(W/V)伊文思藍(lán)溶液中染色30 min, 去離子水沖洗15 min徹底清除浮色后，于1% SDS(W/V)50%(V/V)甲醇中研磨成勻漿，50 ℃水浴15 min后，14 000×g 離心15 min，取上清測600 nm下吸光值。

1.2.3膜脂過氧化的組織化學(xué)檢測膜脂過氧化的組織化學(xué)檢測參照Yamamoto等[12]的方法。將2 cm主根根尖浸入Schiff 試劑 (0.5 g堿性品紅，0.5 g K2S2O5，100 mL 1 mol·L-1HCl，100 mL H2O)中染色60 min，然后用0.5% (W/V) 的K2S2O5溶液 (溶于0.05 mol·L-1的HCl) 沖洗，置于配有數(shù)碼相機的體視顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.4AsA和DHA含量AsA含量測定參照Kampfenkel等[13]的方法。取1 g新鮮植物根系，加入預(yù)冷的5 mL 6% TCA冰浴研磨，4 ℃離心(12 000×g，20 min)，上清液為待測液。總AsA含量的測定：取0.2 mL待測液(對照取0.2 mL 6% TCA)，加0.2 mL 10 mmol·L-1DTT和0.4 mL 0.2 mol·L-1PBS(pH 7.4)，充分混勻，42 ℃反應(yīng)15 min后向其中加入0.2 mL 0.5% N-乙基馬來酰亞胺 (NEM)、1 mL 10%TCA、0.8 mL 42% H3PO4、0.8 mL 4%聯(lián)吡啶、0.4 mL 3% FeCl3，迅速劇烈震蕩混勻，42 ℃反應(yīng)40 min，測定525 nm處吸光值。還原型AsA測定時以0.2 mL H2O和0.2 mL PBS分別代替DTT和NEM，其他同上?？侫sA含量減去還原型AsA含量即為氧化型AsA，即脫氫抗壞血酸(DHA)含量。AsA溶解于6% TCA，同法作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5DHAR和APX的活性電泳蛋白提取及不連續(xù)活性聚丙烯酰胺凝膠電泳(native PAGE)參照Laemmli[14]的方法在4 ℃下進行。分離膠和濃縮膠(不含SDS)鋪進電泳槽，電泳槽各孔加入等量的蛋白質(zhì)，電泳緩沖液為pH 8.3的Tris-HCl，恒定電流30 mA。電泳完畢，進行酶的活性染色。

DHAR的native PAGE采用4%的濃縮膠和10%的分離膠。DHAR的活性染色參照Aravind等[15]的方法。將電泳后的凝膠浸入含4 mmol·L-1GSH，2 mmol·L-1DHA的0.1 mol·L PBS (pH 6.2)中，于搖床上溫育20 min。水洗后，于含0.1% FeCl3和0.1% K3[Fe(CN)6] 的0.1 mol·L-1HCl溶液中孵育，在淺藍(lán)色背景上出現(xiàn)深藍(lán)色的條帶。蒸餾水漂洗，圖像掃描。

APX的native PAGE采用4%的濃縮膠和8%的分離膠。APX的活性染色采用Rao等[16]的方法。凝膠先在含2 mmol·L-1AsA的50 mmol·L-1PBS中孵育30 min，再在含4 mmol·L-1AsA和2 mmol·L-1H2O2的50 mmol·L-1PBS(pH 7.0)中孵育20 min。緩沖液沖洗1 min后，在含28 mmol·L-1TEMED和2.45 mmol·L-1NBT的PBS(pH 7.8)中，輕輕搖動，染色10～15 min。水洗，終止反應(yīng)。圖像掃描。

1.2.6APX基因表達(dá)的熒光定量PCR分析于NCBI網(wǎng)站查尋箭舌豌豆所在豆科植物APX的基因序列。利用DNAMAN6.0軟件進行核酸序列比對，根據(jù)3種豆科植物：豌豆(Pisumsativum)、大豆(Glycinemax)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)的高度保守序列，設(shè)計引物進行PCR擴增，得到了箭舌豌豆APX全序列。測序結(jié)果表明它與豌豆細(xì)胞質(zhì)PsAPX01基因(序列號為X62077.1)的核苷酸序列一致性為94%。實時熒光定量PCR反應(yīng)液使用SYBR Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus, Takara)試劑盒，使用7500 Real-Time PCR系統(tǒng) (Applied Biosystems, USA)檢測基因表達(dá)量的變化。PCR所用APX特異性引物為，正向：5′-GCTGGTGTTGTTGCTGTTG-3′；反向：5′- CCCTCTGGTGGTGGATGG-3′。Actin 作為內(nèi)參，Actin(序列號GU946218.1)特異性引物：正向：5′-TCTGGTGATGGTGTGAGTC-3′；反向：5′-ACAGCAACATAGGCAAGC-3′。PCR條件：95 ℃，30 s解鏈；隨后95 ℃，5 s ；60 ℃，34 s，共40個循環(huán)。各處理的基因表達(dá)量與對照相比，以Actin為內(nèi)參，對照表達(dá)量為1，得到處理后各目的基因的相對表達(dá)量。

1.3數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, U.S.A.)數(shù)據(jù)處理軟件包進行方差分析和LSD多重比較，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。使用Quantity One (Bio-Rad)軟件進行凝膠條帶強度的定量分析。

2　結(jié)果與分析

2.1鎘脅迫對2個箭舌豌豆品種根系生長的影響

2個箭舌豌豆品種L3和ZM根在25 μmol·L-1鎘處理下的生長情況如圖1所示。在實驗記錄的1～14 d內(nèi)，ZM主根的伸長生長量和根系鮮重增長量均始終小于L3，品種間差異在處理4 d以后即達(dá)到顯著水平，且這種差異表現(xiàn)出隨著處理時間延長而逐漸增加的趨勢，并以主根伸長表現(xiàn)得更突出，如在處理14 d時，品種ZM主根伸長量和根系鮮重增長量分別比同期L3顯著降低63%和41%?？梢?，在中度鎘脅迫條件下，鎘敏感品種ZM根系的生長較耐鎘品種L3受到更顯著的抑制。

不同字母表示處理時間之間或者品種間在0.05水平存在顯著性差異；數(shù)值為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；下同圖1　25 μmol·L-1 Cd處理下2個箭舌豌豆品種L3和ZM主根的伸長和根鮮重的增長The different normal letters indicated significant difference among cultivars or treatment times at 0.05 level;Data are means±SD (n=3)；The same as belowFig. 1　Effects of 25 μmol·L-1 Cd treatment on root elongation and increase of root fresh weight in two V. sativa varieties, L3 and ZM

2.2鎘脅迫下2個箭舌豌豆品種根尖的膜脂過氧化和質(zhì)膜損傷

使用Schiff試劑對鎘處理7 d的2個箭舌豌豆品種根尖膜脂過氧化程度進行了組織化學(xué)檢測，Schiff試劑與膜脂過氧化產(chǎn)生的醛類化合物反應(yīng)生成粉紅色物質(zhì)，結(jié)果如圖2所示。其中，在對照(0 μmol·L-1Cd)條件下，2個箭舌豌豆品種的根尖幾乎觀察不到粉紅色；在10～50 μmol·L-1鎘處理條件下，L3和ZM根尖都出現(xiàn)粉紅色，且隨鎘處理濃度的增加根尖粉紅色逐漸明顯，顯示膜脂過氧化程度逐漸加深；在相同鎘處理濃度下，ZM較L3根尖染色更深。說明鎘脅迫下ZM根尖膜脂過氧化程度更嚴(yán)重，它受到了比L3更嚴(yán)重的氧化脅迫。

Evans blue(伊文思藍(lán))是非滲透性染料，若根尖能被Evans blue染成藍(lán)色，說明根尖細(xì)胞對Evans blue通透，其質(zhì)膜完整性受到破壞，且染色越深表示根尖細(xì)胞質(zhì)膜損傷的程度越大。鎘處理下2個箭舌豌豆品種根尖Evans blue 吸收量的分析表明(圖3)， 10～50 μmol·L-1鎘處理7 d后，2個箭舌豌豆品種根尖質(zhì)膜均受到明顯損傷，損傷程度隨鎘處理濃度的增加而顯著增加；在相同鎘處理濃度下，ZM根尖的質(zhì)膜損傷程度顯著大于L3。

2.3鎘脅迫對2個箭舌豌豆品種根系A(chǔ)sA、DHA含量和AsA/DHA比值的影響

表1結(jié)果顯示，各濃度鎘處理7 d后2個箭舌豌豆品種根系A(chǔ)sA和DHA含量都較對照(0 μmol·L-1Cd)顯著升高；L3根系的AsA/DHA比值較對照顯著升高，而ZM根系的AsA/DHA比值較對照顯著降低。在相同鎘處理濃度下，L3根系的AsA含量和AsA/DHA比值均顯著大于ZM。以上結(jié)果說明，鎘脅迫下耐性品種L3具有較敏感品種ZM更強的產(chǎn)生AsA和維持氧化還原穩(wěn)態(tài)的能力。

圖2　不同濃度鎘脅迫下2個箭舌豌豆品種L3和ZM根尖膜脂過氧化的Schiff染色Fig. 2　Histochemical detection of lipid peroxidation by Schiff’s reagent in the root tips of two V. sativa varieties, L3 and ZM

圖3　不同濃度鎘對2個箭舌豌豆品種L3和ZM根尖伊文思藍(lán)吸收的影響Fig. 3　Quantitative assay of Evans blue uptake in the root tips of two V. sativa varieties, L3 and ZM

品種Cultivar鎘濃度Cdconcentration/(μmol·L-1)抗壞血酸含量AsAcontent(μmol·g-1)脫氫抗壞血酸含量DHAcontent(μmol·g-1)抗壞血酸/脫氫抗壞血酸AsA/DHAL300.30±0.03e0.37±0.02c0.83±0.12bcd100.92±0.03cd0.53±0.13bc1.82±0.44a251.18±0.01b0.69±0.10b1.72±0.24a501.63±0.19a1.41±0.19a1.17±0.20bZM00.42±0.07e0.41±0.03c1.01±0.19bc100.83±0.02d1.39±0.06a0.60±0.04d250.97±0.05c1.51±0.10a0.65±0.07cd500.79±0.04d1.48±0.42a0.58±0.10d

注：結(jié)果為3次重復(fù)實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)

Note: Values are means±SD (n=3) of three different experiments

2.4鎘脅迫對2個箭舌豌豆品種根系DHAR同工酶譜的影響

對鎘處理7 d的2個箭舌豌豆品種根系的可溶性蛋白提取物進行活性電泳和DHAR活性染色，可見4條DHAR同工酶條帶(圖4)。這些同工酶的活性均隨著鎘處理濃度的升高而升高，其中DHAR1只在L3根系中顯示，而DHAR4只在ZM根系中顯示，DHAR2 和DHAR3在L3根系中的活性高于ZM。進一步對凝膠條帶強度進行定量分析的結(jié)果顯示，在10、25和50 μmol·L-1鎘處理下L3和ZM根系中DHAR同工酶總活性均隨著鎘處理濃度的升高而顯著升高。在25和50 μmol·L-1鎘處理下，L3根系DHAR的總活性分別是ZM的1.25和1.16倍，顯著高于ZM。

2.5鎘脅迫對2個箭舌豌豆品種根系A(chǔ)PX同工酶譜和基因表達(dá)的影響

對鎘處理7 d的2個箭舌豌豆品種根系的可溶性蛋白提取物進行活性電泳和APX活性染色，可見11條APX同工酶條帶(圖5)。其中，APX 5、6、9、10、11條帶在2個品種根系中均不受鎘脅迫誘導(dǎo)；APX 1、2、4 條帶在ZM根系中受鎘脅迫的顯著誘導(dǎo)，但在L3根系中不受鎘脅迫的誘導(dǎo)；APX3條帶在2個品種根系均受鎘脅迫誘導(dǎo)，但品種間無顯著差異；APX 7、8是2個主要的APX同工酶條帶，在2個品種中均隨著鎘處理濃度的升高而升高，其中APX 8在L3根系中較ZM升高更顯著。進一步對凝膠條帶強度進行定量分析發(fā)現(xiàn)， 10、25和50 μmol·L-1鎘處理下L3和ZM根系中APX同工酶總活性均較對照顯著升高，在L3根系中分別是對照的1.06、1.09和1.16倍；在ZM根系中分別是對照的1.16、1.21和1.26倍；相同鎘處理濃度下，L3與ZM根系中APX的總活性沒有顯著差異。

圖4　鎘脅迫下兩個箭舌豌豆品種L3和ZM根系DHAR同工酶譜Fig. 4　Changes of DHAR isozyme profile under increasing Cd concentration in the roots of the two V. sativa varieties, L3 and ZM

圖5　不同濃度鎘脅迫下2個箭舌豌豆品種L3和ZM根系A(chǔ)PX同工酶譜的變化Fig. 5　Changes of APX isozyme profile under increasing Cd concentration in the roots of the two V. sativa varieties, L3 and ZM

圖6　25 μmol·L-1鎘處理下2個箭舌豌豆品種L3和ZM根系A(chǔ)PX基因表達(dá)的熒光定量PCR分析Fig. 6　Real time RT-PCR analysis of APX gene in response to 25 μmol·L-1 Cd treatment in the roots of two V. sativa varieties, L3 and ZM

同時，進一步通過熒光定量 RT-PCR考察了鎘脅迫下2個箭舌豌豆品種根系中1個細(xì)胞質(zhì)APX基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)鎘脅迫誘導(dǎo)了這一APX基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)(圖6)。其中，在鎘脅迫處理12 h時，2個箭舌豌豆品種根系中該APX基因的表達(dá)已見上調(diào)，隨后APX基因的表達(dá)水平隨鎘脅迫處理時間的延長保持在對照表達(dá)量的2.0倍左右水平，而品種間沒有顯著差異。

3　討　論

鎘脅迫影響植物正常的生長發(fā)育[17-18]，一般鎘對根的抑制較地上部嚴(yán)重，根的伸長對鎘脅迫最敏感[19]；鎘脅迫還常導(dǎo)致植物的氧化脅迫。本實驗中，鎘對箭舌豌豆品種ZM根生長的抑制程度顯著大于品種L3；ZM根尖膜脂過氧化和質(zhì)膜損傷程度也顯著大于L3。這些結(jié)果證明品種ZM對鎘脅迫比L3更敏感。

同時，本研究中鎘脅迫使2個箭舌豌豆品種根系A(chǔ)sA含量都顯著升高，而在相同鎘處理濃度下L3根系A(chǔ)sA含量高于ZM，DHA含量低于ZM，AsA/DHA的比值始終大于ZM，這說明AsA參與了鎘脅迫下箭舌豌豆根系的抗氧化響應(yīng)，L3根系具有更強的抗氧化、保持氧化還原穩(wěn)態(tài)的能力，這可能是L3較ZM具有更強鎘耐性的重要原因之一。

植物體內(nèi)AsA的水平取決于AsA的合成、循環(huán)、降解和轉(zhuǎn)運等環(huán)節(jié)，其中AsA循環(huán)在植物脅迫響應(yīng)中起著尤其重要的作用[20]。AsA氧化形成的DHA一方面可在DHAR的催化下還原為AsA，另一方面可以自發(fā)水解成2，3-二酮古洛酸[21]。DHAR催化DHA還原，可以減少DHA的分解，促進AsA的循環(huán)再生。本實驗中2個箭舌豌豆品種根系共鑒定到4條DHAR同工酶帶，這些同工酶的活性都隨鎘處理濃度的升高而顯著升高，說明箭舌豌豆根系DHAR活性受鎘脅迫的顯著誘導(dǎo)。相同鎘處理濃度下，耐性品種L3根系DHAR的總活性高于敏感品種ZM，這可能使L3根系較ZM更有效地促進DHA還原為AsA，而具有更高的AsA水平和AsA/DHA比值。Chen等[22]報道，在煙草和玉米葉片過表達(dá)小麥DHAR基因可提高DHAR活性，增加AsA含量和AsA/DHA比值。Yin等[23]報道過表達(dá)擬南芥DHAR基因的煙草植株AsA含量和APX活性在鋁脅迫下增加，對鋁的耐性提高。鎘脅迫下，植物產(chǎn)生的ROS常積累于質(zhì)外體[24]，因此質(zhì)外體ROS的清除對提高植物鎘耐性有重要作用。本實驗前期的研究發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫下2個箭舌豌豆品種根系ROS主要積累于細(xì)胞壁和質(zhì)外體空間[25]。AsA是質(zhì)外體中最重要的抗氧化分子[23]。但質(zhì)外體缺乏AsA代謝相關(guān)酶，質(zhì)外體中AsA氧化產(chǎn)生的DHA要通過AsA/DHA轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運過質(zhì)膜，然后在共質(zhì)體中由DHAR還原為AsA，AsA再轉(zhuǎn)運至質(zhì)外體[26]。因此，共質(zhì)體中的DHAR可以同時還原共質(zhì)體和質(zhì)外體中的DHA為AsA。本實驗中，耐鎘品種L3根系較鎘敏感品種ZM具有更高的DHAR活性，可以更有效地促進共質(zhì)體和質(zhì)外體中的DHA還原為AsA，更有效地減輕鎘脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化脅迫，從而提高L3對鎘脅迫的耐性。目前，關(guān)于根系DHAR同工酶研究的報道較少，Shimaoka等[27]曾報道分離了菠菜葉片中占90%DHA還原活性的兩種DHAR同工酶。本實驗中兩個箭舌豌豆品種根系DHAR同工酶差異顯著，這些差異對它們DHA還原能力的影響值得今后深入研究。

AsA抗氧化的主要途徑是通過APX催化AsA與H2O2反應(yīng)，將H2O2還原為H2O。本實驗中2個不同鎘耐性的箭舌豌豆品種根系A(chǔ)PX活性都隨鎘處理濃度的升高而升高，說明APX活性受鎘處理的誘導(dǎo)。高等植物中，APX存在多種同工酶，包括胞質(zhì)APX、葉綠體基質(zhì)APX和類囊體膜結(jié)合APX、微體(包括乙醛酸循環(huán)體和過氧化物酶體)膜結(jié)合APX和線粒體膜結(jié)合APX[28]。本實驗在2個箭舌豌豆品種根系中共鑒定到11條APX同工酶帶，其中APX1、2、4只在ZM根系受到誘導(dǎo)，而活性最高的同工酶APX8在L3根系較ZM受到更顯著的誘導(dǎo)。推測2個箭舌豌豆品種根系A(chǔ)PX總活性雖然沒有顯著差異，但不同的APX同工酶受到不同程度的誘導(dǎo)，可能導(dǎo)致2個箭舌豌豆品種根系催化H2O2分解能力的差異。本實驗中2個箭舌豌豆品種根系中1個胞質(zhì)APX基因在鎘脅迫下顯著上調(diào)表達(dá)，說明APX活性的升高與其基因表達(dá)增加有關(guān)，鎘脅迫下箭舌豌豆根系A(chǔ)PX活性存在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。

另外，除通過APX催化H2O2的分解、減輕植物的活性氧傷害，AsA還可能通過其它過程影響植物的鎘耐性。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)鎘脅迫下ZM根尖較L3更明顯地木質(zhì)化[25]，木質(zhì)化過程包含H2O2參與的酚類物質(zhì)的氧化，酚類物質(zhì)氧化過程中會產(chǎn)生中間產(chǎn)物酚自由基，對質(zhì)膜等結(jié)構(gòu)造成損傷[29]。AsA是有效的酚自由基清除劑，L3的鎘耐性可能與其維持較高的AsA水平，減少了酚自由基的傷害有關(guān)。AsA還可作為酶的輔因子對一系列重要的酶促反應(yīng)起調(diào)控作用，影響植物細(xì)胞的分裂分化和伸展，AsA還是植物細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[30-32]。因此，AsA還可能通過影響細(xì)胞壁木質(zhì)化和木栓化過程、影響細(xì)胞分裂以及根的生長，從而影響植物的鎘耐性，這些都需要今后進一步深入研究。

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(編輯:裴阿衛(wèi))

Study on Ascorbic Acid and Relative Enzymes Against Cadmium Stress in the Roots ofViciasativaL.

RUI Haiyun1,2, ZHANG Xingxing2, ZHUANG Kai2, SHEN Zhenguo2, ZHANG Fenqin3

(1 Taizhou University, Taizhou, Jiangsu 225300,China; 2 College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095,China; 3 College of Hexi, Zhangye, Gansu 734000,China)

Two varieties ofViciasativaL. with different Cd tolerances (Cd-tolerant variety L3, Cd-sensitive variety ZM) were studied to compare concentrations of ascorbic acid (AsA), activities of dehydroascorbate reductase (DHAR) isoenzymes and ascorbate peroxidase (APX) isoenzymes, and APX gene expression in response to Cd treatment in the roots. Results showed that: (1) Cd treatment significantly increased the concentrations of AsA and dehydroascorbate (DHA) in the roots of both L3 and ZM. Cd treatment also tended to increase ratio of AsA/DHA in L3, but to decrease the ratio in ZM. At the same Cd treatment, L3 roots had higher AsA concentration and AsA/DHA ratio than that of ZM. (2) Four isoforms of DHAR were obtained in L3 and ZM roots by native PAGE and their activities generally increased with increasing Cd concentration. DHAR1 was obtained only in L3 and DHAR4 only in ZM. At equivalent Cd concentrations, the total activity of DHAR was higher in roots of L3 than that in ZM. (3) Eleven APX isoforms were obtained in both L3 and ZM roots by native PAGE. APX1, 2, 4 were induced by Cd treatment only in ZM and the activity of APX8 was more significantly induced in L3 than that in ZM. An APX gene was cloned and subjected to RT-PCR analysis. The gene expression level was upregulated under Cd stress in the roots of both varieties. These results suggested that concentration of AsA, activities of DHAR and APX, and APX gene expression level increased in response to cadmium stress in the roots of twoV.sativavarieties. It is possible that the more effective AsA recycle in the roots of L3 contributed to its higher AsA concentration than that in ZM, and this could be related to its stronger protection from ROS generation and finally contributed to its higher tolerance to Cd stress.

ViciasativaL.; cadmium tolerance; ascorbic acid; ascorbate peroxidase; dehydroascorbate reductase

1000-4025(2016)07-1391-08

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.07.1391

2016-03-03;修改稿收到日期:2016-06-16

國家自然科學(xué)基金(31160053，31560072)；泰州學(xué)院博士基金(TZXY2015JBJJ005)

芮海云(1969-)，女，博士，副教授，主要從事植物逆境生理研究。E-mail: njrtz@sina.com

Q945.78

A