黎　君，楊　恒，周天華,2*

(1 陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西漢中 723001; 2 陜南秦巴山區(qū)資源生物綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西漢中 723001)

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白芨SSR引物篩選及群體遺傳多樣性研究

黎君1，楊恒1，周天華1,2*

(1 陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西漢中 723001; 2 陜南秦巴山區(qū)資源生物綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西漢中 723001)

白芨(BletillastriataRchb.)為中國珍稀瀕危植物，重要的藥用植物。該研究基于Illumina測序技術構建白芨基因組文庫和微衛(wèi)星文庫，設計白芨微衛(wèi)星引物，用白芨4個野生種群80個個體對引物進行多態(tài)性檢測，應用4個白芨近緣種中進行引物的通用性檢測，并在此基礎上分析了白芨的遺傳多樣性和遺傳分化，以探討白芨的遺傳結構和進化潛能。結果表明：(1)白芨基因組中微衛(wèi)星片斷豐富，共檢測出17 841條微衛(wèi)星片斷。基于白芨微衛(wèi)星庫對100個位點設計了引物對，經PCR擴增和檢測篩選出能夠穩(wěn)定擴增的多態(tài)性位點20個，每個位點的復等位基因數(Na)在2～6之間，平均為3.85；20對引物的大部分能夠在4個白芨近緣種中成功擴增。(2)白芨在物種水平均有較高的遺傳多樣性(Na=3.85，I=1.07，H=0.614 7)，白芨種群遺傳分化強烈(Gst=0.43)，居群間的基因流較弱(Nm= 0.867 6)，居群聚類分析結果均表明地理距離較近的居群具有較近的遺傳關系。

白芨；微衛(wèi)星；遺傳多樣性；居群；引物篩選

白芨(BletillastriataRchb. f.)是蘭科多年生草本植物，生長在海拔100～3 200 m的常綠闊葉林下，櫟樹林、路邊草或巖石縫中。主要分布于四川、云南、陜西、湖北、甘肅等省份，全國各地有少量栽培?；ㄗ霞t色或粉紅色，可供觀賞。白芨塊莖含白芨膠質(粘液質)、淀粉、揮發(fā)油、葡萄糖等。以干燥塊莖入藥，味苦、甘、澀，性微寒，歸肺、肝、胃經，具有收斂止血，消腫生肌的功能，主要用于治療咳血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂、肺結核咳血、潰瘍病出血等[1-2]。此外，白芨還是優(yōu)良的天然粘合劑，可作為工業(yè)糊料，用于漿絲綢、棉紗、精表裝幀等。

白芨分布范圍較廣，野生資源比較豐富，但隨著醫(yī)藥行業(yè)對白芨的進一步開發(fā)利用，市場需求量逐年增加，其野生資源遭到過度采挖，生態(tài)環(huán)境也因多種原因受到嚴重破壞，藥材的后續(xù)供應已成為一個嚴重的問題，因此，白芨的人工栽培已成為解決白芨資源匱乏的必然選擇，要選育出品種優(yōu)良白芨，以及其真實性的檢測成為當務之急。近幾年來，中國學者在白芨的藥理、有效成分和組織培養(yǎng)技術等方面開展了大量的研究，但對白芨遺多樣性的研究尚屬空白。

簡單序列重復(SSR, Simple Sequence Repeat)，又稱微衛(wèi)星DNA Microsatel-lite DNA(Litt and Luty 1989)[3]，是一類由1～6個堿基組成的基序串聯(lián)重復而成的DNA序列。不同等位基因間的重復數存在豐富的差異，且重復序列兩側多是相對保守的單拷貝序列，可以通過設計特異引物，對基因組總DNA進行PCR擴增，擴增片段的長度多態(tài)性可用作分子標記。微衛(wèi)星標記多態(tài)性豐富，重復性好，標記多呈共顯性，在基因組中分散分布，現(xiàn)已證明微衛(wèi)星DNA存在于絕大多數真核生物基因組中[4]，因此已廣泛應用于遺傳圖譜構建、品種指紋圖譜繪制、品種純度檢測及目標性狀分子標記篩選等領域。特別在人類及哺乳動物的分子連鎖圖譜中微衛(wèi)星標記已成為最重要的遺傳標記之一，目前植物基因組中微衛(wèi)星標記研究也非常活躍[5]。植物SSR的分離及克隆先在幾個熱帶樹種[6]上展開，其后擴展到大豆、水稻、小麥、油菜、西紅柿、甜菜等作物上[7]。

目前國內對白芨種質資源的研究局限于理化水平、組培技術等方面，尚未深入到分子領域，可供使用的SSR引物很少，相關的分子標記也很少，難以滿足對白芨的遺傳多樣性分析，資源評價以及混偽品鑒定的需要。本研究基于第二代測序技術建立白芨基因文庫，開發(fā)白芨的微衛(wèi)星(SSR)引物，并應用該分子標記技術對該物種進行群體遺傳分析，并提出保護策略，為白芨這種重要資源植物的保護提供理論支撐。

1　材料與方法

1.1實驗材料

本研究選取白芨(B.striata)的新鮮塊莖為實驗材料。分別于2014～2015年采自陜西嵐皋(LG)、陜西鎮(zhèn)巴(ZB)、四川漢源(HY)和云南玉溪(YX)4個白芨自然分布區(qū)(表1)，用于白芨引物開發(fā)和物種遺傳多樣性分析。此外，本研究還選取采自陜西留壩和云南的黃花白芨(Bletillaochracea)、小白芨(Bletillaformosana)、華白芨(Bletillasinensis)和綬草(Spiranthessinensis)4個近緣種(表1)來檢測引物的通用性。野外采集到新鮮葉片放入自封袋中加硅膠干燥，帶回實驗室在-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?，并記錄樣品的海拔、經緯度、生境等信息。所有樣品的憑證標本保存于陜西理工學院生物科學與工程學院植物分子生物學實驗室。

1.2方法

1.2.1白芨DNA提取采用改良2×CTAB法[8]提取白芨4個野生居群80份個體的基因組DNA，記錄DNA濃度和A260/A280吸光比值并用濃度為1%瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性，凝膠成像儀拍照觀察并記錄結果。

1.2.2白芨微衛(wèi)星文庫的建立提取白芨全基因組DNA，構建白芨基因組文庫，采取Illumina二代測序技術獲取大量100 bp短序列片段。

采用CLC Genomics Workbench[9]軟件進行片段組裝，設置過濾參數為：片段長度大于299 bp，序列平均覆蓋率為25倍，初步篩選出適合微衛(wèi)星位點開發(fā)的潛在序列集合。設置一定閾值，初步篩選出適合微衛(wèi)星位點開發(fā)的潛在序列集合。基于篩選出的序列比對，導出一致性序列，以fasta格式保存成單一文件。以SciRoKo v3.3[10]軟件掃描上述文件，統(tǒng)計出微衛(wèi)星位點情況，包括各類重復位點數量、比例，對應原始序列名稱等信息。二代測序建庫工作由北京NOVOGENE生物科技公司代理完成。

表1　白芨及其近緣種居群采樣基本數據

1.2.3白芨SSR引物設計采用Oligo 7[11]軟件設計SSR引物100對。利用軟件設計引物的時候必須遵循以下基本原則：①引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內設計；(2)引物長度一般在15～30 bp之間；(3)引物的GC含量在40%～60%之間，Tm值最好接近72；(5)引物自身及引物之間不應存在互補序列；(6)引物5′端及3′端ΔG的絕對值應該小于4；(7)擴增產物的單鏈不能形成二級結構；(8)引物3′端不能選擇A，最好選擇T；選取軟件綜合評分在95分以上的35對送往北京奧科鼎盛生物科技有限公司進行引物合成。

1.2.4PCR擴增與聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測PCR總反應體系為20 μL，包括DNA模板50 ng，2×Mix(天根生物科技)10 μL，正反引物各50 ng，ddH2O至20 μL。PCR反應在PCR擴增儀(Bio-Rad S1000TM)上按以下程序運行：首先94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，退火溫度下45 s，72 ℃下延伸45 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

完成PCR循環(huán)48 h內，取2 μL PCR產物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上恒電壓160 V電泳14 h。用NaOH銀染方法進行染色顯影。各種溶劑配方和體積為：銀染液，AgNO31 g，去離子水500 mL；顯影液， NaOH 15 g，甲醛2 mL，去離子水500 mL。銀染程序為：去離子水漂洗30 s，銀染30 min，去離子水漂洗30 s，在顯影液中輕搖至顯帶。顯影完成之后，用凝膠成像系統(tǒng)(Gel DOCTM XR+)采集圖像并進行數據統(tǒng)計分析。

1.2.5引物篩選及通用性檢測用35對引物對4個白芨居群的DNA進行檢測，采用聚丙烯凝膠電泳檢測，電泳結束后，按照NaOH銀染方法進行染色顯影，并拍照保存。從35對引物中篩選出20對條帶比較明顯，且和預期長度相近的SSR引物。使用這些引物對白芨的4個近緣種進行聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測，觀測擴增產物及目標產物的雜合度。

1.2.6白芨種群的遺傳多樣性分析使用Excel 2007和Bio-rad quantity軟件對電泳后的凝膠圖像進行條帶統(tǒng)計，采用人工讀帶的方式，記錄主要帶型，忽略弱雜帶。應用Powermarker 3.25[12]軟件，計算各引物的等位基因數目(Na)，期望雜合度(He)，觀測雜合度(Ho)，多態(tài)性信息含量(PIC)等(表2)。應用POPGENE Version 1.32[13]軟件，分析各種群的平均復等位基因數(Na)、遺傳雜合度(Ne)、Nei’s遺傳多樣性指數(H)、Shannon指數和遺傳分化系數(Fst)等(表3)。應用GenALEx 6.3軟件[14]進行AMOVA分析、各種群地理距離和遺傳距離的相關性分析及居群主相關性分析。此外還使用采用MEGA5.0軟件基于各居群的遺傳距離進行UPGMA聚類。

2　實驗結果

2.1白芨微衛(wèi)星文庫

二代測序共返回40 715 734條125 bp配對序列，采用CLC Genomics Workbench軟件進行組裝得到576 466條拼接序列，用于后續(xù)分析；采用該軟件進行片段組裝，設置過濾參數為：片段長度大于299 bp，序列平均覆蓋率為25倍，初步篩選出適合微衛(wèi)星位點開發(fā)的潛在序列集合，得到拼接序列數23 906條。雖然上述篩選后的組裝序列平均覆蓋率均達到25倍，但部分數據內部覆蓋率不均勻，局部覆蓋率較低。在此情況下，去除內部覆蓋率低于5倍的區(qū)域，并將一致性序列分為若干“亞片段”，以增加最終用于微衛(wèi)星開發(fā)母序列的可靠性。最終，得到序列17 841條?；诤Y選出的序列比對，導出一致性序列，以fasta格式保存成單一文件。以SciRoKo v3.3軟件掃描上述文件，統(tǒng)計出微衛(wèi)星位點情況，包括各類重復位點數量、比例，對應原始序列名稱等信息。

2.2微衛(wèi)星引物多態(tài)性分析

利用POPGENE Version軟件對篩選出的白芨微衛(wèi)星位點進行群體遺傳多樣性分析，得到了等位基因數以及觀察雜合度和期望雜合度等群體多態(tài)性信息。由表2和表3可知，20對擴增成功的微衛(wèi)星引物中檢測到2～6個不等的等位基因數，平均等位基因數目為3.85個。多態(tài)性信息含量范圍為0.357 2～0.722 9。這些微衛(wèi)星引物的Ho為0.350 0～0.700 0，平均值為0.485 6；He為0.468 5～0.765 3，平均值為0.618 5。就單個引物位點而言，通常其He總是大于Ho[15]。通過分析Ho和He值，說明各個群體之間存在較豐富的遺樣性。

2.3群體遺傳多樣性分析

篩選出的20對白芨微衛(wèi)星引物能夠成功擴增樣品的DNA(圖1)；這些引物擴增產物的等位基因數目為2～6個，觀察雜合度范圍為0.350 0～0.700 0，期望雜合度范圍為0.468 5～0.765 3，通過AMOVA分析得出，Gst為0.43，說明有57%變異來自于種群內，有43%變異來自于種群間，種群間存在著顯著的遺傳分化。Mantel Test檢測結果(表4)表明，白芨居群之間的遺傳距離與其相應的地理距離無顯著的正相關關系(r=0.294 3，P< 0.01)。

2.4基于SSR標記的聚類分析

用軟件進行聚類分析，構建UPGMA聚類樹(圖2)顯示，4個白芨野生居群在遺傳上有明顯的差異，地理距離近的LG居群和ZB居群進化關系較近，而YX居群和其他3個居群進化關系較遠。使用GenAlEx 6.3 軟件進行居群主相關性分析，結果(圖3)與UPGMA聚類分析的結果完全一致，4個白芨野生居群完全分開。

表4　白芨各居群間Nei’s遺傳距離(下三角)和

表3　白芨居群間基因流及遺傳分化參數

注: 居群代號同表1;下同

Note: Population codes are same as in Table 1; The same as below

M.PUC-18;1～20.HY居群個體圖1　引物Bjssr14對四川漢源(HY)居群的SSR擴增1～20.Samples of HY populationFig. 1　SSR amplification products generated by the primer pairs Bjssr14 for HY(Sichuan hanyuan)population

圖2　基于Nei’s遺傳距離的白芨自然居群的UPGMA聚類樹Fig. 2　UPGMA dendrogram of B. striata populations using Nei’s unbiased genetic distances

圖3　基于GD的白芨自然居群主相關性分析Fig. 3　PCA analysis of B. striata populations using genetic distances

2.5引物通用性檢測

通過篩選得到20對能夠穩(wěn)定擴增且多態(tài)性豐富的白芨微衛(wèi)星引物，使用這些引物對采集的4個白芨近緣種(華白芨、小白芨、黃花白芨和綬草)樣本進行擴增，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴增結果進行檢測。結果表明，華白芨、小白芨和黃花白芨種群中，20對引物均能檢測出等位基因(表5)，供試的40份樣品中30份能夠檢測出條帶，因此，篩選出的引物可以在白芨屬植物中通用，在蘭科其他屬中也有一定的通用性。

3　討　論

本研究通過對白芨4個野生居群的聚丙烯酰氨凝膠電泳實驗，篩選出20對穩(wěn)定性好，多態(tài)性信息位點豐富的SSR引物。對80份白芨野生種質資源的實驗結果分析表明，20對引物共獲得77個等位變異點，平均每對引物3.85個，表明篩選出的微衛(wèi)星引物多態(tài)性豐富。多態(tài)性信息含量(PIC)范圍為0.357 2～0.722 9，平均值為0.547 9，說明本研究構建的SSR標記體系對于4個白芨野生居群遺傳多樣性的分析十分有效。因為重復序列和包含SSR位點的側翼序列在物種間具有保守性, 所以通常一個物種的微衛(wèi)星引物在同科不同屬或者更近物種間具有適用性[16]。提高微衛(wèi)星利用率的一個辦法是一旦微衛(wèi)星位點在某一物種中分離并測序, 它就可被用于近緣種的分析[17]。本研究設計篩選的白芨SSR引物能夠在4個白芨近緣種共40份樣品中成功擴增，說明SSR引物通用性良好。因此，篩選出的白芨SSR引物能夠被用于白芨群體遺傳學分析的研究，同時也能夠用于白芨屬其他近緣物種的群體遺傳學研究。這對于利用SSR分子標記對全國范圍白芨野生種質資源的分析與評價，提供了科學依據。

表5　20對引物對4個白芨近緣種的通用性檢測(n=10)

注: n.每種群個體數;1.觀測到純合子;2.觀測到雜合子

Note: n.Number of individuals; 1.Observed homozygote; 2.Observed heterozygote

自然界中，生物所表現(xiàn)出來的遺傳多樣性，其在本質上就是DNA的差異。因此通過分子手段來分析物種或群體遺傳多樣性更為直接，也更為準確。它直接分析遺傳物質本身，是分析生物的基因型而非表現(xiàn)型，排除了環(huán)境因素給藥材鑒定帶來的干擾，也不受樣品形態(tài)和材料來源的影響，比傳統(tǒng)的方法更準確可靠。它不僅能區(qū)分相近物種，而且可以檢測外型極為相似的同種不同變種、變型、品系、化學型乃至個體之間的DNA 的細微變異。本研究利用SSR分子標記技術，發(fā)現(xiàn)白芨在物種水平上，觀察雜合度范圍為0.350 0～0.700 0，期望雜合度范圍為0.468 5～0.765 3，多態(tài)性信息含量范圍為0.357 2～0.722 9，通過AMOVA分析顯示，有57%變異來自于種群內，有43%變異來自于種群間，說明白芨在物種水平上的遺傳多樣性非常豐富。

有研究表明，在地理分布上受限的植物具有較低的遺傳多樣性，相反，分布范圍越廣的物種具有越高的遺傳多樣性[18-20]。白芨在物種水平上具有較高的遺傳多樣性，可能與白芨屬植物的生活史和自然分布有關。白芨屬植物大多分布在海拔100～3 200 m的常綠闊葉林下，櫟樹林、路邊草或巖石縫中。該屬植物屬于起源比較晚的物種類別，分布區(qū)域較廣，在四川、云南、陜西、湖北、甘肅、安徽等地的山區(qū)均有分布，并且多省均有大面積種植。一個物種對環(huán)境變化的適應能力主要取決于該物種是否具有豐富的遺傳多樣性，因此，雖然由于人為過度采挖以及自然變遷的影響導致白芨的自然資源稀少，但是該屬植物頻繁的基因交流使其具有豐富的遺傳變異，使其能夠很好地生存下來。

白芨(BletillastriataRchb. f.)是中國二級保護植物，也是重要的藥用植物，野生資源枯竭，亟需保護。白芨在人工栽培條件下繁殖速度很慢，繁殖系數極低，盡管近幾年對白芨的組織培養(yǎng)研究較多，在一定程度上緩解了需求增長與資源危機的矛盾，但因藥材道地性觀念的影響而造成的野生白芨與栽培白芨市場價格的懸殊，導致了人們對野生白芨的過度采挖，加上蘭科植物的種子萌發(fā)率極低，自然繁殖困難，所以白芨野生資源較稀少，已被列人國家珍稀瀕危保護植物名錄，因此野生白芨種質資源的有效保育已刻不容緩。近年來，SSR 分子標記技術已被廣泛應用于藥用植物的遺傳多樣性分析[21-23]。本實驗運用 SSR 分子標記技術，對白芨的野生居群進行遺傳多樣性分析，結果顯示，白芨居群具有較豐富的遺傳多樣性水平，從DNA水平上驗證了白芨居群豐富的遺傳變異能力，說明白芨具有較強的進化潛能，為后續(xù)白芨屬植物資源的保護、利用和評價奠定了良好基礎。

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(編輯:宋亞珍)

Microsatellite Primer Screening and Population Genetic Diversity ofBletillastriata(Thunb.) Rchb. f.

LI Jun1，YANG Heng1，ZHOU Tianhua1,2*

(1 College of Biological Science and Engineering， Shaanxi Sci-Tech University，Hanzhong Shaanxi 723001, China；2 Qinling-Bashan Mountains Bioresources Comprehensive Development Collaborative Innovation Center，Hanzhong, Shaanxi 723001, China)

Bletillastriata(Thunb.) Rchb. f. is an endangered plant in China with important medicinal value. In this study, the genomic sequence library and microsatellite library ofB.striatawas set up based on Illumina sequencing. SSR primers were designed and carried out to test their polymorphism with 80 individuals from 4 wild populations. Four related species ofB.striatawere used to investigated their cross-taxa transferability. In addition, genetic diversity and genetic differentiation of the species were also investigated. The results showed that: (1) Microsatellite sequences were abundance in the genome ofB.striata, 17 841 loci were detected in total.100 pair of primers were designed, 20 of them performed high polymorphism after PCR and polyacrylamide gelelectrophoresis, the alleles ranged from 2 to 6 with average of 3.85 per locus. The cross-taxa transferability was also examined in 4 related species, most of 20 loci were proved amplifiable in these species. (2) The study revealed that the genetic diversity ofB.striatawas high (Na=3.85,I=1.07,H=0.614 7), genetic differentiation was prominent among populations (Gst=0.43). The gene flow among populations was limited (Nm=0.867 6), the adjacent populations performed tight genetic relationship as revealed by cluster analyses of populations. The reasons for genetic construction and conservational strategies of the species were also discussed in this study.

Bletillastriata(Thunb.) Rchb. f.; microsatellite; genetic diversity; population; primer screening

1000-4025(2016)07-1343-08

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.07.1343

2016-04-15;修改稿收到日期:2016-06-15

陜西省自然科學基礎研究計劃(2015JM3115)；秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心2016年度自然科學基金(QBXT-Z(P)-15-10)；陜西理工學院2015年研究生創(chuàng)新基金(SLGYCX1524)；陜西省科技廳項目(2015KTTSSF01-02)

黎君(1990-)，男，在讀碩士研究生，主要從事植物分子生態(tài)學研究。E-mail：lijun5525@163.com

周天華，碩士生導師，主要從事植物資源學研究。E-mail：444721689@qq.com

Q346+.5；Q789

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