羅　昌，陳東亮，程　曦，黃叢林

(北京市農林科學院 北京農業(yè)生物技術研究中心，北京100097)

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甘菊ClHSP70與ClHSP90基因的克隆及表達分析

羅昌，陳東亮，程曦，黃叢林*

(北京市農林科學院 北京農業(yè)生物技術研究中心，北京100097)

該研究以甘菊(Chrysanthemumlavandulifolium)為實驗材料，通過RT-PCR方法從甘菊轉錄組數據中分離出熱激蛋白合成相關基因，命名為ClHSP70和ClHSP90。序列分析表明，ClHSP70基因ORF全長為2 559 bp，編碼852個氨基酸，蛋白功能區(qū)預測表明含有典型的HSP70蛋白NBD和SBD保守結構域；ClHSP90基因ORF全長為2 094 bp，編碼697個氨基酸，含有HATPase結構域和HSP90保守結構域。生物信息學分析表明，甘菊ClHSP70與大豆(Glycinemax)和煙草(Nicotianatomentosiformis)HSP70蛋白有較高的一致性，ClHSP90基因編碼的氨基酸序列與紫莖澤蘭(Ageratinaadenophora)HSP90高度相似；實時熒光定量表達分析表明，在42 ℃處理不同時間，甘菊葉片中ClHSP70和ClHSP90基因表達均在0.5 h時顯著增加，1 h達到最大值，2 h后緩慢下降；不同組織表達分析表明，甘菊在42 ℃處理1 h后，ClHSP70在成熟葉中的表達量顯著高于嫩葉和根等其他組織；ClHSP90在成熟莖中的表達量最高。研究說明，ClHSP70和ClHSP90基因具有熱激蛋白特征，參與了甘菊熱脅迫應答過程，該研究結果為以后深入研究其基因功能奠定了基礎。

甘菊;ClHSP70;ClHSP90; 熱脅迫

熱激蛋白(heat shock protein, HSPs)是在熱激條件下被誘導且表達增加的一部分特異蛋白質，在植物應對外界環(huán)境壓力，如干旱、鹽、低溫及高溫等時起著重要的作用[1]。HSPs的積累與生物耐熱性呈正相關，也就是說，在熱脅迫下HSPs的積累可以提高植株的耐熱性。

HSPs種類存在范圍很廣，根據其分子量大小，可分為5類：HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和‘小HSPs’[2]。在植物熱激蛋白家族中，HSP70最為保守和普遍，HSP70在氨基酸序列上高度相似，含有核酸結合區(qū)和底物結合區(qū)2個功能區(qū)，N-末端具有典型的約45 kD的ATPase區(qū)域。研究表明，HSP70在熱脅迫條件下能夠被顯著誘導，小球藻HSP70B含量在熱脅迫2 h后增加最明顯[3]，花生(ArachishypogaeaLinn.)AhHSP70在高溫脅迫3 h后表達明顯升高[4]。近年來在擬南芥[5]、煙草[1]、玉米[6]等研究中也證明了HSP70與植物耐熱性相關。HSP90是一個受ATP調節(jié)的二聚體分子伴侶，在分子進化上高度保守，每個單體由ATPase結構域、中間結構域和介導HSP90二聚化的C端結構域組成[7-8]。目前對于植物中HSP90蛋白的研究相對較少，擬南芥[9]和水稻[10]中的研究表明受到熱脅迫時HSP90表達量顯著增加，HSP90蛋白的積累量明顯提高，但其結構和功能仍待進一步探究。另外，有研究證實HSP90在植物生長發(fā)育進程中起著至關重要的作用，其功能的缺失會引起植物形態(tài)和生理特性發(fā)生改變[11-12]。此外，由于熱誘導和組成型表達的熱激蛋白可定位于細胞的細胞質和多種細胞器中，包括葉綠體、內質網[13-14]等，且執(zhí)行著不同的功能，也可在不同的器官中被誘導，可在根、莖、葉、種子以及幼苗中產生，因此高溫脅迫下植物HSPs基因的表達也呈現出明顯的組織特異性。

菊花(Chrysanthemum×morifoliumRamat.)是多年生草本植物，起源于中國，世界上均有廣泛栽培，在中國花卉生產中占有重要地位，周年生產鮮花是菊花生產的迫切需求。但是，周年生產過程中菊花在現蕾階段容易受到夏季高溫脅迫，導致花芽早熟或夭折。因此，了解菊花在受到熱脅迫時的耐熱機制對于培育適合周年生產的菊花品種很有必要。甘菊(Chrysanthemumlavandulifolium) 為菊科菊屬二倍體野生種(2n=2x=18)，是菊花原始種之一，生長于海拔200～2 800 m平原及山坡，有較強抗逆性，其生長季節(jié)和開花習性與栽培菊花相似[15-16]。本研究參照甘菊均一化轉錄組數據庫，利用RT-PCR技術，分離得到ClHSP70和ClHSP90的cDNA全長序列，利用實時熒光定量PCR技術分析了2個基因在高溫下不同處理時間和不同組織部位中的表達特性，為ClHSP70和ClHSP90基因的功能鑒定以及菊花耐熱育種奠定基礎。

1　材料與方法

1.1植物材料及處理

從北京農業(yè)生物技術研究中心組培室中選取15株生長水平一致的甘菊組培苗為實驗材料。將光照培養(yǎng)箱溫度設置為42 ℃，每3株作為一個重復，分別處理0、0.5、1、2和4 h時選取上部新鮮葉片置于液氮中冷凍，并放入-80 ℃冰箱中備用；42 ℃處理1 h, 選取植株嫩葉、成熟葉、嫩莖、成熟莖、根置于液氮中冷凍，并放入-80 ℃冰箱中備用。

1.2方法

1.2.1總RNA提取及甘菊ClHSP70和ClHSP90基因克隆用植物RNA小量提取試劑盒(MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，TaKaRa公司)提取甘菊葉片總RNA，再用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)將所提取RNA反轉錄為cDNA并檢測其濃度。

從甘菊均一化轉錄組數據中篩選ClHSP70和ClHSP90基因序列信息，根據在NCBI網站上預測2個基因的ORF設計引物(表1)。PCR反應體系(50 μL)：2 μL cDNA模板(100 mmol/L)，0.5 μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μL)，10 μL 5×PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus)，4 μL dNTP Mixture (各2.5 mmol/L)，正反向引物各2 μL 以及29.5 μL ddH2O。PCR擴增條件為98 ℃預變性5 min；98 ℃變性10 s，58 ℃復性5 s，72 ℃延伸15 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸6 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，回收純化目的片段后連接到pGEM-T Easy載體上，42 ℃熱激轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，進行Amp抗性篩選和X-gal/IPTG藍白斑篩選。挑取白色菌落進行PCR檢測，陽性克隆送往上海生物工程有限公司進行測序。用Segman序列拼接軟件對測序結果進行拼接，分別獲得ClHSP70和ClHSP90的ORF全長序列。

表1　本實驗相關引物

1.2.2ClHSP70和ClHSP90基因的生物信息學分析利用NCBI數據庫中Blast工具對ClHSP70和ClHSP90基因序列進行比對和同源性分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；運用Finder軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/g orf.html)進行開放閱讀框分析；在NCBI Conserved Domain Database (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)中進行蛋白質保守結構域預測；通過ExPASy-ProtParam軟件(http://web.expasy.org/protparam)預測蛋白的分子量及等電點；SMART在線軟件對蛋白質結構域進行分析預測。利用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線分析蛋白質的信號肽。使用Clustal X軟件進行氨基酸序列多重比對[17]，利用MEGA5.0軟件構建進化樹(Neighbor- Joining)[18]，并進行Boot-strap檢測。

1.2.3ClHSP70和ClHSP90基因表達分析用植物RNA小量提取試劑盒(MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，TaKaRa公司)提取42 ℃不同時間(0、0.5、1、2、4 h)處理后的甘菊葉片RNA，已經42 ℃處理1 h后不同組織部位(嫩葉、成熟葉、嫩莖、成熟莖、根)的RNA。用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)將所提取RNA反轉錄為cDNA。根據ClHSP70和ClHSP90基因的全長序列，用Premier 5.0設計Real-time PCR引物(表1)，采用Actin基因作為內標。參照熒光定量試劑盒SYBR?Premix EX TaqTMⅡ(TilRNaseH Plus，TaKaRa)說明書進行操作：SYBR Premix EX Taq (2×) 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL, cDNA模板 (100 mmol/L) 1 μL, ddH2O 7.8 μL,總體積20 μL。反應程序為95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40個循環(huán)后作熔解曲線。每個樣品均重復3次，在ABIStep-OnePlusTMReal-time PCR儀(美國ABI公司)上進行，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

2　結果與分析

2.1ClHSP70和ClHSP90基因克隆

根據甘菊轉錄組數據Unigene blastx注釋結果篩選HSP70和HSP90序列，在NCBI中進行開放閱讀框分析并設計特異性引物，以甘菊葉片cDNA為模板擴增到ClHSP70和ClHSP90編碼框序列，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，2個基因擴增條帶長度分別為2 500 bp和2000 bp左右(圖 1)，片段經測序后正反向拼接得到基因的全長。分析結果表明，ClHSP70含有1個2 559 bp開放閱讀框，編碼852個氨基酸(圖 2)；ClHSP90含有一個2 094 bp開放閱讀框，編碼697個氨基酸(圖 3)。

2.2ClHSP70和ClHSP90基因生物信息學分析

經Protparatam在線工具(http://web.expasy.org/protparam/)分析，結果顯示(表 2)ClHSP70蛋白的總平均疏水性為-0.444, ClHSP90蛋白的總平均疏水性為-0.604，均為親水性蛋白；總的帶負電荷的氨基酸比重均略高于帶正電荷的氨基酸，表現為酸性蛋白；從穩(wěn)定系數推測ClHSP70為不穩(wěn)定蛋白，ClHSP90為穩(wěn)定蛋白。通過二級結構預測發(fā)現ClHSP70含有40.73%的α-螺旋，5.87%的β-折疊和36.85%的隨機卷曲；ClHSP90則含有51.51%的α-螺旋、6.31%的β-折疊和24.82%的隨機卷曲。SignalP在線分析ClHSP70和ClHSP90均不含信號肽序列，也無跨膜結構。

M. DL5000; 1. ClHSP70；2. ClHSP90圖1　甘菊ClHSP70和ClHSP90基因擴增結果Fig. 1　PCR amplification results of ClHSP70 and ClHSP90 gene from C. lavandulifolium

下劃線部分為N端NBD結構域(A)和N端保守的ATPase結構域(B)；灰色陰影部分為高度保守的ClHSP90氨基酸序列(B)；黑色陰影部分為C-末端胞質亞型特殊信號的基序(B)；*.表示終止密碼子圖2　甘菊ClHSP70 (A)和ClHSP90 (B)基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Underline represents NBD domain of N-terminus domain(A)and the ATP binding domain of N-terminus domain (B); shaded gray represents highly conserved amino acid ClHSP90 signature sequence motifs characteristic (B); shaded black represents the C-terminus cytosolic isoform specific signature motif (MEEVD) (B); *. Stop codonFig. 2　The nucleotide and deduced amino acid sequences of ClHSP70 (A) and ClHSP90 (B) in C. lavandulifolium

NtHSP70-15.煙草 (XP009624163.1)；GmHSP70-14.大豆(XP 003546366.1)；AtHSP70. 擬南芥(NP 850984.4)；BoHSP70-14.甘藍(XP 013591718.1)圖3　甘菊ClHSP70與其他物種HSPs多序列比對NtHSP70-15.Nicotiana tomentosiformis (XP 009624163.1)；GmHSP70-14. Glycine max(XP 003546366.1)；AtHSP70. Arabidopsis thaliana (NP 850984.4)；BoHSP70-14. Brassica oleracea var.oleracea (XP 01591718.1).Fig. 3　Multiple alignment of ClHSP70 with HSPs from other plant species

蛋白性質ProteincharacterClHSP70ClHSP90總氨基酸數目Numberofaminoacids/aa852697蛋白分子質量Molecularweight/kD94.179.9理論等電點pI5.104.98蛋白分子式FormulaC4133H6584N1136O1302S34C3544H5649N917O1124S26總帶負電荷的殘基數Totalnumberofnegativelychargedresidues(Asp+Glu)135138總帶正電荷的殘基數Totalnumberofpositivelychargedresidues(Arg+Lys)103106脂肪族指數Aliphaticindex78.9182.50不穩(wěn)定系數Instabilityindex43.08,不穩(wěn)定Unstable37.55,穩(wěn)定Stable總平均疏水性Grandaverageofhydropathicity-0.444-0.604

氨基酸序列比對結果顯示，甘菊ClHSP70與大豆(Glycinemax)和煙草(Nicotianatomentosiformis) HSP70蛋白有較高的一致性，分別為78%和76%, 其次是與擬南芥(Arabidopsisthaliana)、甘藍(Brassicaoleraceavar.oleracea)同為74%(圖 3)；甘菊ClHSP90與紫莖澤蘭(Ageratinaadenophora)HSP90有顯著的一致性，高達93%，其次是與煙草為92%，與番茄(Solanumlycopersicum)、擬南芥一致性分別為91%和90%(圖 4)。說明ClHSP70和ClHSP90具有熱激蛋白家族高度保守的特征。保守域預測結果(圖 5)表明ClHSP70蛋白C端3～691aa為HSP70蛋白家族保守區(qū)域，782～818 aa為一段低復雜性區(qū)段(low-complexity region，LCR)。N端9～381aa是核酸結合區(qū)(nucleotide binding domain, NBD)(圖 2,A)，該結合區(qū)氨基酸序列高度保守，具有結合并水解ATP的活性中心，它與ATP的結合-水解過程調控著它對多肽的親和力，34～219aa為底物結合區(qū)(substrate binding domain, SBD)。

ClHSP90蛋白質結構中含有N端高度保守的ATPase結構域29～178aa(圖 5)，具有ATPase活性，ClHSP90蛋白質184～697aa。另外，ClHSP90氨

NtHSP80-like.煙草 (XP 009594054.1)；AaHSP90.紫莖澤蘭 (ABX76302.1); SlHSP90-1.番茄 (NP 001234436.1)；AtHSP81-2.擬南芥 (NP 200414.1)圖4　甘菊ClHSP90與其他物種HSPs多序列比對NtHSP80-like. Nicotiana tomentosiformis (XP 009594054.1)；AaHSP90. Ageratina adenophora (ABX76302.1); SlHSP90-1. Solanum lycopersicum (NP 001234436.1)；AtHSP81-2. Arabidopsis thaliana (NP 200414.1)；GmHSP90-2. Glycine max (NP 001236599.1)Fig. 4　Multiple alignment of ClHSP90 with HSPs from other plant species

基酸序列中還包括HSP90家族5個特征標記序列：NKEIFL RELISNSSDALDKIR、LGTIARSGT、MIGQFGVGF YSAYLVA、IKLYVRRVFI、GIVDSEDLPLNIS RE，C端末尾基序為MEEVD，推測該蛋白為細胞質熱激蛋白(圖 2,B)。

系統(tǒng)進化樹分析表明，ClHSP70基因與擬南芥AtHSP70 (NP-850984.4)、甘藍BoHSP70-14 (XP-013591718.1)的關系較近，處于同一分支(圖6，A)。ClHSP90與同為菊科的紫莖澤蘭的AaHSP90(ABX76302.1)關系最近，紫莖澤蘭HSP90已驗證參與脅迫應答，其次是煙草、番茄，與小麥、擬南芥、甘藍等的HSP90類基因關系較遠 (圖6,B)。

2.3ClHSP70和ClHSP90基因表達分析

實時熒光定量PCR分析結果表明，甘菊在42 ℃不同時間處理條件下，葉片中ClHSP70和ClHSP90基因表達量均有顯著增加，其中ClHSP70和ClHSP90在處理0.5 h時表達量都開始明顯升高，分別為對照的5.8和5.1倍，1 h時表達量達到最高，分別為對照的12.2和9.7倍，2和4 h后ClHSP70和ClHSP90基因表達量有所下降(圖7)。說明ClHSP70和ClHSP90屬于熱誘導型表達的熱激蛋白，當甘菊受到高溫脅迫時，在很短時間內就能夠參與熱脅迫響應進行大量表達，增加植株體內HSPs的積累，增強植株的耐熱性。

根據ClHSP70和ClHSP90高溫處理不同時間的表達情況，將甘菊植株42 ℃處理1 h, 分別取植株的嫩葉、成熟葉、嫩莖、成熟莖、根提取RNA，實時熒光定量PCR分析結果表明，ClHSP70基因在成熟葉中的表達量顯著高于其他部位，其次是嫩葉、根、成熟莖、嫩莖。ClHSP90基因在成熟莖中的表達量顯著高于其他部位，嫩莖中表達最低，嫩葉、成熟葉、根之間的表達差異不明顯(圖7)。說明在高溫誘導下ClHSP70和ClHSP90的表達存在明顯的組織器官特異性，同時ClHSP70與ClHSP90之間表達水平最高的部位也不相同，推測上述2類熱激蛋白在植株中的定位和執(zhí)行功能有所不同。

圖5　甘菊ClHSP70和ClHSP90保守域分析結果Fig. 5　Prediction of conserver domain of ClHSP70 and ClHSP90 from C. lavandulifolium

節(jié)點數字表示Bootstrap驗證中基于1 000次重復的可信度；括號內編號為氨基酸登錄號圖6　熱激蛋白HSP70(A)和HSP90(B)基因編碼的氨基酸系統(tǒng)進化樹Bootstrap values are shown at nodes based on 1 000 replications; The accession No. is given in bracketsFig. 6　Phylogenetic tree for HSP70 (A) and HSP90 (B) based on alignment of amino acid sequences from other species

不同小寫字母表示同一基因不同處理時間和在不同組織中的差異顯著，P<0.05圖7　甘菊葉片中ClHSP70和ClHSP90 42 ℃高溫處理不同時間和在不同組織中的表達Different letters represent significant difference among different treatment times and different tissues under 42 ℃ (P<0.05)Fig. 7　Relative expression level of ClHSP70 and ClHSP90 gene in different treatment times and different tissues under 42 ℃ high temperature stress.

3　討　論

高溫是植物生命活動中常會遭遇的非生物逆境，熱激蛋白(HSPs)是細胞受到高溫環(huán)境或其他脅迫環(huán)境誘導時產生的一類功能型蛋白質，可以作為分子伴侶參與細胞內新合成蛋白質的折疊、加工、轉運以及蛋白質變性后的復性[19]，增強細胞對脅迫環(huán)境的忍耐力從而提高細胞的適應能力[20]。菊花是中國十大名花，世界四大切花(菊花、月季、康乃馨、唐菖蒲)之一，產量居首，隨著國內菊花市場規(guī)模的發(fā)展，其栽培面積在不斷擴大，但夏季高溫影響了其產量和品質。因此，研究熱激蛋白HSPs基因的結構和功能，對于提高菊花耐熱性，培育耐高溫品種有長遠意義。

本研究利用甘菊均一化轉錄組數據，從甘菊葉片中克隆得到ClHSP70和ClHSP90基因，本實驗中保守區(qū)預測分析表明，ClHSP70含有典型的NBD結構域和SBD結構域，其在HSP70與ATP結合-水解和發(fā)揮分子伴侶功能時起著重要作用。據報道，HSP90多肽N端結構域包含1個ATP結合區(qū)域，在HSP90執(zhí)行生物功能時起著重要作用，真核生物細胞質HSP90的C端含有保守的MEEVD基序[21]，能夠與TPR(tetratricopeptide repeat)結構域的蛋白識別并結合，從而使HSP90發(fā)揮不同的作用。本研究中ClHSP90 N端結構域包含ATPase結合位點，C端含有MEEVD基序，與萵苣[22]、番茄[23]和擬南芥[24]中的研究一致，是細胞質HSP90。氨基酸序列比對分析表明：ClHSP70與大豆和煙草HSP70蛋白有較高的同源性，ClHSP90與紫莖澤蘭、煙草、番茄等植物HSP90有著很高的同源性。從系統(tǒng)進化樹可以得出，ClHSP70與擬南芥、甘藍HSP70聚成一類，ClHSP90與同屬于菊科植物的紫莖澤蘭聚為一組，并與煙草、番茄HSP90聚成一大分支。因此，ClHSP70和ClHSP90分別屬于植物HSP70基因家族和HSP90基因家族成員。

高溫脅迫下，熱激蛋白受到誘導且表達量明顯增加，同時在正常的環(huán)境下為維持細胞的正常運轉HSP70和HSP90可以組成型表達。本研究中，ClHSP70和ClHSP90在25 ℃時均有表達，且表達相對穩(wěn)定。研究表明，多數HSPs在受高溫脅迫后短時間內就能誘導合成，熱激處理3～5 min內，HSPs mRNA的量增加，20 min時可檢測到新合成的HSPs, 隨著熱激時間的延長，HSP的合成能夠持續(xù)數小時。本研究中，甘菊ClHSP70和ClHSP90在42 ℃處理時其合成主要在1 h內完成并達到最高，2 h后開始下降，4 h急劇下降。這與擬南芥中HSP70家族[25]和萵苣LsHsp90[22]在受到熱激處理時的表達模式類似。隨著熱激時間增加相對表達量下降的原因可能是因為熱激基因的長時間表達對生物體不利，植物適應高溫環(huán)境后將其表達下調[26]。根據亞細胞定位，植物HSP70主要分為四大類，分別為位于細胞質HSP70、內質網HSP70、線粒體HSP70和葉綠體HSP70。HSP90主要定位于細胞質，也有少部分存在于內質網、線粒體和葉綠體等亞細胞中。研究表明，HSPs在熱脅迫下的表達與其定位以及執(zhí)行的功能有一定關系，即高溫脅迫下植物HSPs基因的表達有明顯的組織器官特異性。本實驗中，42 ℃熱脅迫1 h，ClHSP70和ClHSP90在植株各個部位均有表達，但表達量具有顯著差異性。其中ClHSP70在成熟葉中的表達量最高，與臘梅E-CpHSP70-1基因[27]、玉米熱激蛋白70[28]在各個組織器官中的表達分析一致，推測可能與其亞細胞定位主要分布在葉片中有關，相對于嫩葉和其他組織部位，成熟葉細胞中葉綠體、內質網等細胞器含量更多。另外，當植株受到高溫脅迫時，首先會引起葉片萎蔫、葉色失綠等表型特征，ClHSP70在成熟葉片中的高表達表明其在植物響應高溫脅迫和緩解植物體受到的熱損傷過程中起重要作用。ClHSP90在成熟莖中的表達量最高，在葉片中表達量較低，與劉云飛等在番茄中的研究結果類似[23]，說明HSP90在植株受到熱脅迫后能在多個組織部位參與植物高溫脅迫的應答。此外，HSP90除了參與高溫脅迫的應答之外，其在植物生長發(fā)育進程中起著至關重要的作用，模式植物擬南芥[29-31]中的研究表明HSP90廣泛參與了植物的生長發(fā)育過程。本實驗中ClHSP90在成熟莖和嫩莖中的表達差異最為明顯，推測該基因可能參與莖尖分生組織相關調控活動。甘菊熱激蛋白基因對高溫脅迫的表達模式研究為菊花耐熱性研究提供了分子基礎，并為利用基因工程提高菊花耐熱性和耐熱種質資源創(chuàng)新與應用提供理論依據。關于ClHSP70和ClHSP90在菊花中如何行使其功能我們今后將做進一步研究。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Expression ofClHSP70 andClHSP90 Gene fromChrysanthemumlavandulifolium

LUO Chang, CHEN Dongliang, CHENG Xi, HUANG Conglin*

(Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing Agricultural Biotechnology Research Center, Beijing 100097, China)

Based onChrysanthemumlavandulifoliumRNA-seq data, we obtained two code DNA sequences namedClHSP70 andClHSP90 using RT-PCR. Sequence analysis showed the predicted open reading frame (ORF) ofClHSP70 is 2 559 bp, encoding a protein of 852 amino acids. The conserver domain search exhibited that N-teminar contains typical NBD domain which belongs to HSP70 family. The predicted ORF ofClHSP90 is 2 094 bp, encoding a protein of 697 amino acids. The conserver domain search showed that N-teminar contains ATPase-superfamily and HSP90 superfamily conservative structure. Bioinformatics showed that the amino acid sequences of ClHSP70 had high consistency withGlycinemaxandNicotianatomentosiformisHSP70, while ClHSP90 had high consistency withAgeratinaadenophoraHSP90. Real-time PCR demonstrated the expression patterns ofClHSP70 andClHSP90 in leaves at 42 ℃. The expression of these two genes were both significantly up-regulated after 0.5 h, reached the highest level after 1 h. Then the expression of both two genes decreased after 2 h, and remained at a relatively lower level after 4 h. In different plant tissues (root, stem, leaf) after 1 h at 42 ℃,ClHSP70 was highly expressed in mature leaves, lower in young, leaves, root, mature stems, young stems, andClHSP90 was the highest in mature stems. The results showed thatClHSP70 andClHSP90 participated the process of heat tolerance inChrysanthemumlavandulifoliumand laid a foundation for analyzingClHSP70 andClHSP90 gene function.

Chrysanthemumlavandulifolium;ClHSP70;ClHSP90; heat stress

1000-4025(2016)07-1321-10

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.07.1321

2016-03-28;修改稿收到日期:2016-05-17

北京市農林科學院科技創(chuàng)新能力建設專項(KJCX20140109)

羅昌(1982-)，男，碩士，助理研究員，主要從事菊花遺傳育種研究。E-mail: changluo1983@126.com.

黃叢林，研究員，主要從事菊花遺傳育種研究。E-mail: conglinh@126.com

Q785;Q786

A