于子優(yōu) 孫笛 羅毅 劉寧飛

慢性肢體淋巴水腫皮膚微淋巴管病理性肌化

于子優(yōu) 孫笛 羅毅 劉寧飛

目的 探索淋巴水腫過程中皮膚微淋巴管的病理生理改變。方法 自2013年11月至2015年9月，對37例淋巴水腫患者（原發(fā)性淋巴水腫26例，繼發(fā)性淋巴水腫11例）行皮膚活檢術，切取足背或上臂內側全層皮膚，以正常人皮膚標本作為對照組（n=7），免疫熒光染色標記淋巴管內皮標志物Podoplanin，平滑肌標志物α-SMA，計算每位患者α-SMA+淋巴管%（α-SMA+淋巴管數/淋巴管總數）、淋巴管密度、管腔面積，并與對照組比較。吲哚菁綠淋巴造影（ICG lymphography）檢查淋巴管功能。結果 淋巴水腫患者皮膚微淋巴管出現不同程度的“肌化”改變。原發(fā)性、繼發(fā)性淋巴水腫患者組α-SMA+淋巴管%分別為47.5%、73.2%（中位數），均顯著高于對照組（3.5%），P＜0.01；兩實驗組管腔面積均大于對照組，P＜0.05；兩實驗組淋巴管密度與對照組差異無統計學意義。不同于健肢淋巴管的影像學表現，淋巴水腫肢體均呈現出真皮反流的熒光影像。結論 皮膚微淋巴管“肌化”為原發(fā)性和繼發(fā)性慢性肢體淋巴水腫的重要病理改變，并參與疾病的演變。

淋巴水腫 毛細淋巴管 平滑肌細胞 肌化

淋巴水腫（Lymphedema，LE）是由淋巴循環(huán)障礙導致淋巴液在組織內滯留，而形成的慢性進行性組織高蛋白性水腫，多累及肢體，最終可導致肢體畸形與殘疾［1］。根據病因，可將淋巴水腫分為淋巴管發(fā)育異常所致的原發(fā)性淋巴水腫和腫瘤根治手術、放療、創(chuàng)傷等原因引發(fā)的繼發(fā)性淋巴水腫。淋巴水腫已成為乳腺癌及婦科腫瘤術后最常見的并發(fā)癥之一，嚴重影響患者的生活質量。以手法淋巴引流綜合消腫治療（Complex Decongestive Therapy，CDT）為主的保守治療是目前最廣泛采取的治療方式，其他治療還包括彈性材料、空氣波壓力治療、淋巴管-靜脈吻合手術等，以上治療雖能有效減輕水腫，但淋巴水腫仍無法治愈，缺乏有效的根治手段。不論原發(fā)或繼發(fā)性淋巴水腫，雖然已知的病理結局包括皮膚增厚、纖維化、脂肪沉積和慢性炎癥等［2-3］，但對淋巴管的病理生理改變一直了解較少，這成為判斷淋巴水腫愈后、選擇正確治療方法和療效預估的瓶頸。

既往針對集合淋巴管的研究，揭示了其在淋巴水腫中的擴張、破裂、硬化，甚至閉塞等結構或功能改變［4-7］，但對與其緊密相連、分布甚廣的皮膚淋巴管或微淋巴管的研究甚少，僅有的報道包括熒光微淋巴管造影 （Fluorescence Microlymphangiography，FM）和間接淋巴造影（Indirect Lymphography，IL），關注了病理狀態(tài)下微淋巴管的變化。有報道指出，繼發(fā)性淋巴水腫患者出現前集合淋巴管數量的增加［8］，而原發(fā)性淋巴水腫患者可表現為皮膚淋巴管的擴張、增生或不發(fā)育［9-13］。在Allegra等［14］對原發(fā)性LE的描述中，隨水腫程度進展，毛細淋巴管口徑增加，毛細淋巴管內壓、組織間隙壓力增加，顯影速度和造影劑排空時間延長。

作為淋巴管道的起始及淋巴循環(huán)的起點，毛細淋巴管以其獨特的精細結構行使吸收組織間液，形成和輸送淋巴液的重要功能，淋巴循環(huán)得以啟動。解剖學上，皮膚淋巴管由毛細淋巴管和前集合淋巴管組成。毛細淋巴管呈一盲端，由單層淋巴管內皮細胞構成薄壁管腔，管壁無平滑肌細胞，無連續(xù)的基膜，管腔內無瓣膜［15-17］。內皮細胞通過錨絲附著于細胞外基質，使組織內壓變化始終與內皮細胞間的開閉相協調，當淋巴液積聚，組織內壓力增大，錨絲張力增高，牽拉內皮細胞，大分子物質即通過寬松的細胞連接進入毛細淋巴管，組織內壓下降，內皮間“瓣膜樣”重疊結構又阻止了淋巴液返流。淋巴液繼而被運輸至前集合淋巴管，在皮膚中，前集合淋巴管通常分布在真皮深層靠近皮下組織處，其管壁可有不連續(xù)的平滑肌分布，管腔內也開始出現瓣膜結構［18］。通過毛細淋巴管和前集合淋巴管，組織內淋巴液得以生成并運輸至集合淋巴管，那么在淋巴回流受阻的病理狀況下，皮膚微淋巴管將發(fā)生何種改變，可能對淋巴水腫的治療和預后產生何種影響呢？

本研究通過對37例淋巴水腫患者皮膚標本，進行免疫熒光標記淋巴管內皮細胞特異性抗體podoplanin和平滑肌特異性抗體α-SMA，結合臨床資料及影像學表現，首次發(fā)現了皮膚微淋巴管在原發(fā)與繼發(fā)性淋巴水腫中“肌化”的特異性病理改變，為研究慢性淋巴水腫的病理生理機制及靶向治療提供了新思路。

1 資料和方法

1.1 臨床資料與標本收集

從2013年11月至2015年9月，共納入37例肢體慢性淋巴水腫患者，男16例，女21例，年齡5～69歲，平均（34±19.0）歲。其中原發(fā)性淋巴水腫26例，繼發(fā)性淋巴水腫11例（乳腺癌術后2例，婦科腫瘤術后9例），累及上肢7例，下肢30例，平均病程（12.5±11.0）年。按ISL診斷分類［19］：Ⅰ°肢體淋巴水腫1例，Ⅱ°16例，Ⅲ°14例，Ⅵ°6例。所有病例均行皮膚活檢術，切取水腫肢體足背或上臂腹側全層皮膚。對照組（n=7）皮膚標本來自正常志愿者。患者臨床診斷及標本收集均在我院淋巴治療中心進行，所有受試者均簽署知情同意書，該臨床試驗已通過上海市第九人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 實驗試劑及儀器

小鼠抗人podoplanin（Angiobio公司，美國），兔抗人alpha smooth muscle actin（Abcam公司，英國），Alexa fluor 555山羊抗小鼠抗體（Invitrogen公司，美國），Alexa fluor 488山羊抗兔抗體（Invitrogen公司，美國）；PDE熒光定位儀（Hamamatsu公司，日本）；共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss公司，德國）；Image Pro Plus 6.0軟件（Media Cybernetics公司，美國）。

1.3 影像學檢查

隨著近年來吲哚菁綠（Indocyanine Green，ICG）及紅外熒光成像技術在淋巴管造影方面的應用，使皮膚淺表淋巴管顯影和觀察病理狀態(tài)下淋巴回流的動態(tài)變化成為可能。我們對6例原發(fā)性LE（Ⅰ°2例，Ⅱ°3例，Ⅵ°1例）和5例繼發(fā)性LE患者（Ⅲ°）行ICG熒光淋巴造影 （Indocyanine Green Lymphography），以患者健肢為自身對照，以2.5 mg/mL ICG 0.05 mL注射于雙足背或雙手背指蹼間，采用PDE熒光定位儀（Photodynamic Eye）在造影劑注入的同時開始觀察熒光成像，注射后30 min再次觀察。

1.4 免疫熒光染色

TL：Chinese Proverb-an outwardly attractive but worthless person

標本4%多聚甲醛固定、包埋，5 μm切片，二甲苯、梯度乙醇脫蠟、水化，置于98℃、pH=6的檸檬酸修復液中抗原修復30 min，滴加0.2%Triton X-100室溫5 min，5%BSA封閉30 min。滴加小鼠抗人podoplanin（1∶50）、兔抗人alpha smooth muscle actin （1∶300），4℃過夜，PBS浸洗 （5×5 min），滴加二抗Alexa fluor 555山羊抗小鼠抗體（1∶300）、Alexa fluor 488山羊抗兔抗體（1∶300），37℃，1 h。DAB顯色8～10 min后封片。

1.5 皮膚淋巴管計數分析

標本熒光染色后，在共聚焦顯微鏡下拍攝重建組織的拼圖，觀察并計數皮膚淋巴管α-SMA+平滑肌細胞的募集情況。每個標本中α-SMA+淋巴管的百分比 （α-SMA+Lv%）計算公式：（α-SMA+淋巴管數/淋巴管總數）×100%。淋巴管管腔面積（中位數）由Image Pro Plus 6.0軟件測量。淋巴管密度由淋巴管總數/切片總組織面積算得。

1.6 統計學分析

使用SAS v9.2軟件進行統計學分析。所有結果采用中位數（極值）或計數（%）表示。組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗，當P＜0.05時，為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 皮膚微淋巴管病理改變

2.1.1 大體改變

與對照組相比，LE患者皮膚均明顯增厚、纖維化，可見大量炎細胞浸潤，除1例原發(fā)性LE病人皮膚淋巴管表現為小而塌陷的形態(tài)結構外，絕大多數淋巴管管腔明顯擴張。原發(fā)與繼發(fā)組管腔面積分別為304 μm2和856.7 μm2（中位數），與對照組比較差異顯著（P＜0.05），表明兩LE組淋巴管管腔均明顯擴張。兩LE組皮膚淋巴管密度與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

2.1.2 淋巴水腫病人皮膚淋巴管“肌化”

通過免疫熒光染色觀察α-SMA+平滑肌細胞在病人淋巴管管周的募集，計算得到平均α-SMA+Lv%在原發(fā)與繼發(fā)組分別為47.5%和73.2%，均顯著高于對照組（P＜0.01）。平滑肌募集可同時見于擴張或“塌陷狀”的淋巴管，表現為一個或幾個細胞不連續(xù)環(huán)繞在淋巴管內皮細胞周圍，亦可表現為成束平滑肌分布在淋巴管周圍（圖1b、c）。淋巴水腫患者皮膚中，不同性別或不同水腫部位間α-SMA+Lv%差異無統計學意義，α-SMA+Lv%與病程、水腫分期、皮膚淋巴管密度均未見相關性。

2.2 影像學表現

健肢熒光影像通常表現為自足背或手背注射點發(fā)出數條清晰的線性淋巴管影并逐漸上行 （圖1d、g）。通常在皮內注射過程中即可見自注射點開始顯影的淋巴管，說明毛細淋巴管吸收造影劑在數秒內即可完成。

淋巴水腫肢體表現出不同形式的皮下彌散和真皮反流。在原發(fā)性淋巴水腫患者中，注射造影劑后淋巴管常難以顯影，30 min后足背出現局限性造影劑彌散和真皮反流（圖1e、h）。在繼發(fā)性淋巴水腫患者中，雖注射后可見延遲的淋巴管顯影，30 min后常出現大片皮下彌散和真皮反流的熒光影像（圖1 f、i）。

表1 淋巴水腫病人與對照組的組間比較Table1 Comparisons between lymphedema patients and controls

圖1 正常、原發(fā)、繼發(fā)性淋巴水腫皮膚組織podoplainin、α-SMA免疫熒光染色和ICG淋巴造影影像學觀察Fig.1 ICG lymphographic findings and immunofluorescent staining of podoplainin，α-SMA in control and lymphedematous skin

3 討論

對慢性肢體淋巴水腫組織中淋巴管形態(tài)和功能的研究，主要聚焦于大的集合淋巴管，而對皮膚淋巴管改變的研究甚少。雖有文獻提及了LE患者皮膚淋巴管口徑的增加和密度的變化［9］，且通過熒光微淋巴管造影可觀察到毛細淋巴管充盈范圍及運輸功能的變化［9，13-14］，但對其結構改變及病理機制的研究仍鮮有報道，對淋巴水腫疾病過程發(fā)生發(fā)展規(guī)律認識的不足，亦使臨床治療面臨困境。

本研究中，我們探索了慢性肢體淋巴水腫過程中皮膚淋巴管的病理生理改變，發(fā)現了皮膚微淋巴管“肌化”的獨特病理現象。在原發(fā)與繼發(fā)性LE病人中，分別存在47.5%和73.2%的皮膚淋巴管被不均勻分布的平滑肌細胞環(huán)繞，管壁的增厚、管腔通透性的降低提示這些“肌化”的淋巴管功能已受損。在ICG熒光淋巴造影過程中，LE肢體淋巴管顯影時間，即毛細淋巴管吸收造影劑時間往往較健肢明顯延長［14］。α-SMA+Lv%與病程及水腫分期無明顯相關性，但值得注意的是，1例病程僅為3個月的Ⅰ°雙下肢原發(fā)性LE病人，α-SMA+Lv%已達76%，表明“肌化”可發(fā)生在淋巴水腫早期或潛伏期階段，臨床表現尚不明顯時，淋巴管的組織學病變可能已非常顯著，且在ICG熒光淋巴造影檢查中可觀察到在Ⅰ°LE患者中，即見淋巴管顯影的延遲及彌散的熒光影像。以上結果表明，微淋巴管“肌化”的病理改變可能貫穿著整個疾病發(fā)展過程，并在早期影響淋巴管功能。

類似“肌化”或硬化的病理改變在對集合淋巴管的研究中也有報道［4-5］。正常集合淋巴管管壁存在平滑肌層，在兩相鄰瓣膜間，平滑肌的收縮與瓣膜的開閉形成有功能的收縮單位，保證了淋巴液的單向運輸［15-16，20］。大量體內外實驗表明，在集合淋巴管跨壁壓增加時，淋巴管平滑肌的收縮頻率和收縮力均明顯增加［21-22］。Ogata等［4］報道了繼發(fā)性淋巴水腫病人集合淋巴管“硬化”現象，即管壁平滑肌增生伴表型改變，且管壁病變程度與水腫嚴重程度成正比?？赡苁窃谒[發(fā)生發(fā)展過程中，集合淋巴管作為具有主動收縮功能的肌性管道，在長期管內高壓的負荷下，出現代償性管壁平滑肌增生與重塑，晚期影響功能。若集合淋巴管“硬化”導致了其收縮功能的下降，那么毛細淋巴管“肌化”可能影響著淋巴液的生成與運輸。兩者是否存在相同的病理機制還有待研究，但管腔內壓增高勢必同樣累及微淋巴管，長期淋巴液瘀滯、管壁牽張、管內外高壓可能是“肌化”發(fā)生的主要原因之一。單層淋巴管內皮細胞構成的微淋巴管被平滑肌細胞覆蓋后，“肌化”對附著在其表面的錨絲的結構和功能有何影響目前尚不可知。有理由推測，平滑肌的附著可能增加微淋巴管管壁的厚度，影響錨絲牽拉對內皮細胞之間連接處的開放和閉合功能，從而降低有效淋巴液的生成。我們的研究顯示，平滑肌包繞的微淋巴管的管壁明顯增厚，呈現持續(xù)的擴張狀態(tài)，在淋巴回流阻力增加、管腔壓力持續(xù)存在的情況下，淋巴液在“肌化”或“硬化”的微淋巴管和組織之間形成所謂的雙向流動，這可能就是真皮反流的病理基礎。體內及體外實驗探索生理及病理狀態(tài)下淋巴管內皮細胞-平滑肌細胞間的信號通路可能為深入理解其分子機制提供線索。

至今，淋巴水腫仍尚無根治方法，CDT雖可有效減輕水腫，但仍需終身治療。以淋巴管-靜脈吻合手術為主的手術治療往往遠期效果不佳。淋巴水腫所伴隨的一系列病變包括脂肪沉積、組織纖維化以及集合淋巴管管壁的增厚、纖維化、甚至閉塞等，一旦發(fā)生便不可逆。皮膚淋巴管的“肌化”可能是淋巴水腫過程中諸多病理改變的一個環(huán)節(jié)，雖然目前尚不知“肌化”微淋巴管的發(fā)生發(fā)展過程以及“肌化”對淋巴水腫轉機的影響，但由于皮膚微淋巴管在淋巴液形成中所起的重要作用，“肌化”的結果勢必導致淋巴液生成障礙和在組織中的滯留，功能性皮膚微淋巴管數量的下降可能參與解釋了當前淋巴水腫治療困難和病程不可逆性的原因，如不使其恢復正常的生理結構，治愈則無從談起?！叭ゼ』笨赡艹蔀槁灾w淋巴水腫的新治療靶點之一。

4 結論

皮膚微淋巴管“肌化”為原發(fā)性和繼發(fā)性慢性肢體淋巴水腫的重要病理改變，可發(fā)生在淋巴水腫的極早期階段，主要通過影響微淋巴管的吸收功能而加重淋巴循環(huán)障礙。對“肌化”發(fā)生的分子機制的研究將為其靶向治療提供可能。

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Myogenesis of Lymphatic Capillaries in Chronic Lymphoedematous Skin

YU Ziyou，SUN Di，LUO Yi，LIU Ningfei.Department of Plastic and Reconstructive Surgery，Shanghai Ninth People's Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200011，China.Corresponding author：LIU Ningfei
（E-mail：liuningfei@126.com）.

Objective To explore the pathophysiological changes of skin lymphatic capillaries in patients with chronic lymphedema （LE）.Methods From November 2013 to September 2015，37 patients （26 with primary LE and 11 with secondary LE）and 7 healthy controls were enrolled in the study.Full-thickness skin on the lymphedematous limb was excised.Skin sections were immunofluorescently stained with podoplanin and α-smooth muscle actin （α-SMA）.The percent of α-SMA+lymphatic vessel were calculated.Meanwhile，the density and luminal area of dermal lymphatic vessel were measured.Lymphatic vessel function was assessed by Indocyanine green lymphography.Results Myogenesis of lymphatic capillaries were observed in primary and secondary lymphedematous skin.The α-SMA+Lv%in primary and secondary LE were 47.5%and 73.2%（median）respectively，which were both significantly higher than that of the control group（3.05%，P＜0.01）.The inner luminal area of lymphatic vessels in lymphedematous skin of experimental groups were greater compared with control group （P＜0.05）.The differences in the lymphatic vessel density between the two experimental groups and the control group were not statistically significant.In contrast with the imaging findings in healthy limbs，the lymphoedematous extremities all exhibited dermal backflow patterns.Conclusion Dermal lymphatic capillary myogenesis is an important pathological during the process of chronic lymphedema which might be involved in the evolution of the disease.

Lymphedema；Lymphatic capillaries；Smooth muscle cell；Myogenesis

R551.2

A

1673－0364（2016）04－0243－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.04.009

國家自然科學基金（81272146）。

200011 上海市 上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復外科。

劉寧飛（E-mail：liuningfei@126.com）。

（2016年4月6日；

2016年5月23日）