王順妮,陳紅巖,葉曉娟,閔太善,盧大儒,陳浩明

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200438； 2. 復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200438；3. 復(fù)旦大學(xué) 現(xiàn)代人類(lèi)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200438)

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乳腺癌Jab1蛋白調(diào)控Nov基因的表達(dá)受甲基化水平影響

王順妮1,2,3,陳紅巖1,2,3,葉曉娟1,2,3,閔太善1,2,3,盧大儒1,2,3,陳浩明1,2,3

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200438； 2. 復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200438；3. 復(fù)旦大學(xué) 現(xiàn)代人類(lèi)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200438)

為探討癌基因Jab1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的功能,首先在乳腺癌細(xì)胞MDA231中建立了慢病毒介導(dǎo)的Jab1基因的表達(dá)干擾系統(tǒng),并通過(guò)人基因表達(dá)譜芯片分析結(jié)果以及實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)篩選出受Jab1調(diào)控的下游基因；此外,通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR以及Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)Jab1干擾表達(dá)能降低Nov基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平表達(dá),而且Nov啟動(dòng)子區(qū)域存在4個(gè)高甲基化CpG位點(diǎn).進(jìn)一步使用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理Jab1干擾表達(dá)細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)與未使用抑制劑處理細(xì)胞相比,Nov基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平發(fā)生明顯上調(diào),說(shuō)明Jab1基因調(diào)控Nov表達(dá)受甲基化水平的影響,提示Jab1可能是通過(guò)表觀遺傳學(xué)水平調(diào)控Nov基因的表達(dá).

乳腺癌； Jab1； 甲基化；Nov

乳腺癌高居女性惡性腫瘤的首位,全世界范圍內(nèi)每年約有120萬(wàn)新發(fā)乳腺癌病例,嚴(yán)重威脅著女性健康.Jab1也稱為c-Jun激活結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白-1(c-Jun activation domain binding protein 1),同時(shí)也是COP9信號(hào)復(fù)合體的第5個(gè)亞單位(CSN5)[1].COP9信號(hào)復(fù)合體(CSN)是一個(gè)復(fù)雜保守的蛋白質(zhì),包含8個(gè)亞基,即CSN1～CSN8[2].CSN在多種真核動(dòng)物和植物中都表達(dá),并參與多種生物學(xué)過(guò)程[3-4].Jab1是一種重要的原癌蛋白,只存在于真核生物中,能夠從復(fù)合體中脫離開(kāi)單獨(dú)進(jìn)行作用并行使其功能[5-6],很多研究表明Jab1在多種癌癥病人樣本中都有過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象,包括乳腺癌、腦垂體瘤、胰腺癌和肺癌[7-12]等,因此進(jìn)一步深入揭示Jab1在腫瘤細(xì)胞中的分子機(jī)制顯得尤為重要.

Nov(Nephroblastoma overexpressed),又稱CCN3,是CCN家族中的成員之一,其在多個(gè)器官的發(fā)育和分化中起重要作用[13].Nov的異常表達(dá)常見(jiàn)于腫瘤中,并與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)有關(guān).在多數(shù)腫瘤中,Nov起負(fù)調(diào)節(jié)作用,能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；但在個(gè)別腫瘤,例如前列腺癌、腎細(xì)胞癌等癌癥中,Nov反而能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[14].以上結(jié)果提示我們Nov在腫瘤中具有重要作用.

在腫瘤形成過(guò)程中,表觀遺傳學(xué)機(jī)制的作用越來(lái)越受到重視.其中一個(gè)重要機(jī)制就是DNA甲基化.研究表明,異常的DNA甲基化可以出現(xiàn)在腫瘤發(fā)生和發(fā)展的各個(gè)階段[15-17].

在本次研究中,通過(guò)攜帶相應(yīng)shRNA片段的慢病毒感染乳腺癌細(xì)胞系MDA231后篩選到Jab1調(diào)控的下游基因Nov,并從表觀遺傳學(xué)的水平初步探索了Jab1調(diào)控Nov基因的可能分子機(jī)制.

1　材料和方法

1.1材料

人源胚胎腎細(xì)胞(Human Embryonic Kidney, HEK)293T、人乳腺癌細(xì)胞MDA231、慢病毒包裝相關(guān)質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室保存；DMSO試劑購(gòu)自上海試劑廠；Lipofetamin 2000轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄以及定量PCR試劑購(gòu)自Toyobo公司；RIPA裂解液、一抗稀釋液以及HRP標(biāo)記的Western blot二抗購(gòu)自碧云天生物研究所；人表達(dá)譜芯片購(gòu)自上海博奧生物有限公司；Jab1一抗購(gòu)自Thermo公司；β-actin、Nov一抗購(gòu)自Cell Signaling公司；Polybrene粉末試劑購(gòu)自Sigma公司；PVDF膜購(gòu)自Millipore公司；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)培養(yǎng)基、血清以及雙抗均購(gòu)自Gibco公司；5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5′-aza-dC)購(gòu)自上海研域生物科技有限公司,DNA甲基化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海銳賽生物技術(shù)有限公司.

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

293T、MDA231細(xì)胞培養(yǎng)使用DMEM高糖培養(yǎng)基,完全培養(yǎng)基中含有10% 胎牛血清以及青霉素(100U/mL)-鏈霉素(100μg/mL)雙抗；培養(yǎng)于37℃、含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.3慢病毒包裝

Jab1對(duì)應(yīng)的干擾慢病毒shRNA序列為: Jab1sh2: 5′-GCACTGAAACCCGAGTAAATG-3′,Jab1sh5: 5′-GCTTGAGCTGTTGTGGAATAA-3′；對(duì)照組慢病毒shRNA序列: shLuc: 5′-CGTACG CGGAATACTTCGA-3′,分別克隆到pCDH-copGFP慢病毒表達(dá)載體中.

慢病毒包裝時(shí)將各種慢病毒主質(zhì)粒分別和3種輔助質(zhì)粒PLP1、PLP2以及VSVG按質(zhì)量比3∶1∶1∶1 混合后轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中,8h后換液,48h后收集病毒上清,2000r/min離心10min后用0.45μm 濾器過(guò)濾并分裝后凍存于-80℃冰箱；感染時(shí),取1mL慢病毒加入到含有10%細(xì)胞的六孔板中,加入1mL DMEM高糖完全培養(yǎng)基,并加入終濃度為3μg/mL的Polybrene溶液.

1.4抽提細(xì)胞總RNA

經(jīng)過(guò)慢病毒感染的細(xì)胞棄去培養(yǎng)基后使用PBS將培養(yǎng)基洗干凈,加入TRIzol裂解液后將細(xì)胞置于冰上裂解10min,加入三氯甲烷震蕩?kù)o置,分層后冷凍離心取上層,加入等量異丙醇充分混勻后冷凍離心去上清,加入75%乙醇洗滌沉淀后加入適量DEPC水,凍于-80℃冰箱.

1.5實(shí)時(shí)定量PCR

定量PCR在ABI公司7900HT定量PCR儀上進(jìn)行,結(jié)果由配套的SDS2.4軟件進(jìn)行分析,GAPDH基因作為內(nèi)參基因,實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3組重復(fù)；GAPDH上游引物: 5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′,GAPDH下游引物: 5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；Jab1上游引物: 5′-GCAATCGGGTGGTAT CATAGC-3′,Jab1下游引物5′-GCAATCGGGTGGTATCATAGC-3′；Nov上游引物: 5′-TGCGGATA TTGTTCTTGTTGGA-3′,Nov下游引物: 5′-ATTGACGGTTCCTATTGGTGAC-3′.

1.6Western blot

經(jīng)過(guò)慢病毒感染的細(xì)胞棄去培養(yǎng)基后使用PBS將培養(yǎng)基洗干凈,加入RIPA裂解液將細(xì)胞置于冰上裂解30min,冷凍離心取上清,BCA定量后將各蛋白質(zhì)裂解液用RIPA裂解液調(diào)整至統(tǒng)一濃度,加入適量上樣緩沖液,煮沸10min后,取20μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳,電泳結(jié)束后200mA恒流轉(zhuǎn)膜2h至孔徑0.22μm 的PVDF膜,使用5%脫脂奶粉封閉1h,一抗(各抗體按照1∶103稀釋)室溫?fù)u床孵育2h,相應(yīng)二抗(1∶103稀釋)室溫?fù)u床孵育1h,基因科技(上海)有限公司G-BOX顯影儀顯影拍照.

1.7熒光顯微鏡觀察

Leica公司倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞,使用藍(lán)色激發(fā)光觀察綠色熒光,在200倍放大條件下選取適當(dāng)視野、適當(dāng)曝光時(shí)間進(jìn)行拍照,保存照片.

1.85′-aza-dC處理細(xì)胞

消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞鋪于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,按照1∶103的比例加入5′-aza-dC于細(xì)胞中,根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行換液,生長(zhǎng)至合適密度后抽提總RNA及總蛋白質(zhì).

1.9甲基化檢測(cè)和甲基化程度計(jì)算

使用shLuc、Jab1sh2和Jab1sh5慢病毒感染細(xì)胞,根據(jù)DNA甲基化檢測(cè)試劑盒步驟處理細(xì)胞后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),并回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序.在基因組DNA中,由于非甲基化的胞嘧啶(C)經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鹽處理與PCR擴(kuò)增后會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?T)；全部發(fā)生甲基化的“C”經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鹽處理與 PCR 擴(kuò)增后仍然為“C”；而部分發(fā)生甲基化的“C”堿基經(jīng)過(guò)處理后會(huì)呈現(xiàn)出“C”和“T”疊加的情況(圖1).前期的研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)計(jì)算測(cè)序峰圖中的“C”的峰高與“C”及“T”峰高之和的比值可以得出每個(gè) CpG 位點(diǎn)的甲基化比例,公式如下所示:

甲基化程度=甲基化峰高/(甲基化峰高+非甲基化峰高)×100%

1.10數(shù)據(jù)處理

2　結(jié)　果

2.1慢病毒介導(dǎo)的Jab1基因的shRNA干擾

用制備的對(duì)照慢病毒(shLuc)和Jab1基因的shRNA干擾慢病毒(Jab1sh2和Jab1sh5)分別感染MDA231細(xì)胞,120h后使用熒光顯微鏡觀察慢病毒干擾表達(dá)情況,并抽提相應(yīng)細(xì)胞總蛋白質(zhì),進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn),檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Jab1基因的表達(dá)水平(圖2).可見(jiàn)光視野和熒光視野的對(duì)比結(jié)果表明(圖2(a)),高于80%的細(xì)胞具有不同程度的GFP熒光強(qiáng)度,說(shuō)明shLuc、Jab1sh2和Jab1sh5慢病毒對(duì)MDA231細(xì)胞的感染率高.Western blot檢測(cè)結(jié)果表明,在蛋白質(zhì)水平上Jab1基因的shRNA慢病毒干擾細(xì)胞組中的Jab1表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(圖2(b)).以上結(jié)果表明,慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾使得MDA231細(xì)胞中Jab1基因的表達(dá)顯著下調(diào),乳腺癌細(xì)胞MDA231中Jab1表達(dá)干擾系統(tǒng)構(gòu)建成功.

2.2Jab1表達(dá)干擾后人表達(dá)譜芯片篩選

使用shLuc、Jab1sh2和Jab1sh5慢病毒感染MDA231細(xì)胞后,抽提RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后使用Illumina Bead Chip Human HF12-V4型芯片檢測(cè),總共測(cè)定1600個(gè)基因,之后根據(jù)表達(dá)差異顯著程度以及基因功能篩選出了表達(dá)差異顯著并且與細(xì)胞增殖遷移等相關(guān)的候選基因,包括Nov、CSF2以及DEK等,篩選結(jié)果如表1所示.

表1　MDA231細(xì)胞感染慢病毒后表達(dá)譜篩選結(jié)果

根據(jù)表達(dá)譜芯片篩選結(jié)果,進(jìn)一步使用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證了上述候選基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)變化情況,結(jié)果如圖3所示,在Jab1低表達(dá)(P<0.001)時(shí)Nov基因的mRNA水平發(fā)生了明顯下調(diào),并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001). 根據(jù)已有的Nov基因研究報(bào)道[18-19],本研究選擇了Nov基因作為Jab1調(diào)控的下游基因進(jìn)一步研究.

2.3Jab1干擾表達(dá)能夠下調(diào)Nov基因表達(dá)

本研究進(jìn)一步對(duì)Jab1干擾表達(dá)后Nov的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平進(jìn)行了檢測(cè).實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明,(圖4(a)),Jab1表達(dá)干擾組相較于對(duì)照組細(xì)胞Jab1基因mRNA水平顯著下調(diào),同時(shí),Nov基因mRNA表達(dá)水平也相應(yīng)下調(diào),統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明Jab1表達(dá)干擾組和對(duì)照組相比,Nov的mRNA表達(dá)水平均具有極顯著性差異(P<0.01).如圖4(b)所示,隨著MDA231細(xì)胞中Jab1蛋白表達(dá)量下降,Nov蛋白表達(dá)水平也顯著下調(diào)(以β-actin作為內(nèi)參),表明Jab1可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控Nov基因的表達(dá).

2.4Nov啟動(dòng)子CpG位點(diǎn)分析

DNA甲基化是常見(jiàn)的表觀遺傳修飾,一般多發(fā)生于CpG雙核苷酸部位或CpG島區(qū)域.已有研究表明腫瘤中許多重要功能基因的DNA甲基化水平存在明顯的異常[20],進(jìn)而影響基因的表達(dá).

為進(jìn)一步研究Jab1是通過(guò)何種機(jī)制調(diào)控Nov的表達(dá),本研究對(duì)于Nov啟動(dòng)子3000bp 區(qū)域進(jìn)行了在線CpG位點(diǎn)分析(www.urogene.org),結(jié)果如圖5所示,啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)CpG位點(diǎn)和一個(gè)CpG島,說(shuō)明Jab1有可能會(huì)通過(guò)調(diào)控Nov基因啟動(dòng)子甲基化程度進(jìn)而調(diào)節(jié)Nov的轉(zhuǎn)錄翻譯表達(dá).

于是使用DNA甲基化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了Nov基因可能轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域(-120～+150)序列(通過(guò)網(wǎng)站http: ∥promotor.biosino.org/預(yù)測(cè))有4個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化程度顯著高于對(duì)照組,表示這四個(gè)CpG位點(diǎn)的高甲基化可能與Nov在乳腺癌細(xì)胞中受Jab1蛋白調(diào)控有關(guān).

2.55′-aza-dC對(duì)Nov基因表達(dá)的影響

為進(jìn)一步研究Jab1是否會(huì)影響Nov基因的DNA甲基化,本研究使用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5′-aza-dC分別處理Jab1干擾表達(dá)實(shí)驗(yàn)組和shLuc對(duì)照組,生長(zhǎng)至合適密度后抽取總RNA和總蛋白質(zhì)進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量PCR以及Western blot實(shí)驗(yàn).5′-aza-dC可以直接作用于DNA上,抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶,使DNA甲基化水平降低.5′-aza-dC處理細(xì)胞后,Nov的轉(zhuǎn)錄水平增加(以DMSO為對(duì)照),并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異(P<0.05),結(jié)果如圖6(a)所示.Western blot檢測(cè)結(jié)果(圖6(b))顯示,5′-aza-dC處理Jab1干擾表達(dá)實(shí)驗(yàn)組和shLuc對(duì)照組后,Nov的表達(dá)水平相對(duì)于未加5′-aza-dC(DMSO組)發(fā)生了上調(diào),表明甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑能增加Nov的表達(dá),使用5′-aza-dC處理后Nov的表達(dá)從顯著下調(diào)變?yōu)榱私M間表達(dá)基本無(wú)差異,說(shuō)明Jab1基因調(diào)控Nov的表達(dá)受甲基化水平的影響.

3　討　論

已有研究表明,原癌蛋白Jab1對(duì)于多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要作用,并且因Jab1對(duì)腫瘤抑制子的降解能力使得其也參與了其他細(xì)胞進(jìn)程,例如細(xì)胞增殖、凋亡、血管增生等[21-23].而這些作用也正是將它和腫瘤的發(fā)生發(fā)展、不良預(yù)后和化療抵抗等聯(lián)系起來(lái)的重要原因.Jab1位于人染色體8q13.1,這個(gè)區(qū)域已有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、前列腺癌、大腸癌和子宮癌中具有過(guò)度擴(kuò)增的現(xiàn)象,而且Jab1與具有侵染性和遷移性的癌癥發(fā)生都有相關(guān)性[24-28].Nov作為CCN家族中的重要成員參與多種生理過(guò)程和病理過(guò)程,先前有研究報(bào)道Nov的異常表達(dá)常見(jiàn)于腫瘤中并且受到多種因素的調(diào)控,存在時(shí)間和空間特異性[19],例如在鳥(niǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中BMP信號(hào)通路激活后可誘導(dǎo)Nov基因的表達(dá),而Notch信號(hào)通路則能夠降低Nov的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平.以上結(jié)果提示Nov在癌癥中的作用和相關(guān)生物學(xué)功能也越來(lái)越受到人們的重視.

然而此前還沒(méi)有研究揭示Jab1與Nov的調(diào)控關(guān)系和分子機(jī)制,因此在本次研究中,首先利用shRNA介導(dǎo)的慢病毒感染轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系MDA231,實(shí)現(xiàn)了Jab1基因表達(dá)的干擾.再通過(guò)人表達(dá)譜芯片篩選出一系列可能被Jab1調(diào)控的基因,并通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR發(fā)現(xiàn)Jab1基因的干擾表達(dá)能夠使得與細(xì)胞增殖相關(guān)基因Nov在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上都發(fā)生顯著下調(diào).

進(jìn)一步,本研究探討了使用shRNA介導(dǎo)的慢病毒干擾Jab1表達(dá)后引起Nov表達(dá)變化的機(jī)制,通過(guò)對(duì)Nov基因啟動(dòng)子分析推測(cè)Jab1低表達(dá)有可能會(huì)引起Nov基因甲基化的異常發(fā)生.使用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5′-aza-dC處理Jab1干擾表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)Jab1基因表達(dá)干擾實(shí)驗(yàn)組中Nov基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平表達(dá)從原來(lái)的下調(diào)變?yōu)榕c對(duì)照組間無(wú)明顯表達(dá)差異,此結(jié)果提示我們Jab1可能是通過(guò)表觀遺傳學(xué)中的甲基化修飾方式來(lái)調(diào)控Nov基因的表達(dá).下一步研究可聚焦在Jab1基因是具體通過(guò)調(diào)控Nov啟動(dòng)子哪個(gè)甲基化位點(diǎn)使得Nov基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平改變,并進(jìn)一步通過(guò)過(guò)表達(dá)Nov基因的方法研究Nov對(duì)于乳腺癌MDA231細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響.

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Jab1 Regulating Nov Affected by DNA Methylation in Breast Cancer Cell Line

WANG Shunni1,2,3, CHEN Hongyan1,2,3, YE Xiaojuan1,2,3, MIN Taishan1,2,3,LU Daru1,2,3, CHEN Haoming1,2,3

(1. School of Life Science, Fudan University, Shanghai 200438, China; 2. State Key LaboratoryofGeneticsEngineering,FudanUniversity,Shanghai200438,China; 3.MOEKeyLaboratoryofContemporaryAnthropology,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

In order to study the effects of Jab1 in breast cancer, a Jab1 gene knockdown system in breast cancer cell line MDA231 was established with lentivirus mediated RNA interference. Then our study confirmed thatNovgene was regulated by Jab1 through human expression microarray and Real-Time PCR. Moreover, the knockdown of Jab1 decreased the expression level of mRNA and protein ofNovgene. Moreover, 4 CpG sites ofNovpromotor have high methylation rates. The expression level ofNovgene had no significant difference after adding methyltransferase inhibitor 5′-aza-dC in Jab1 knockdown cell lines comparing to the expression ofNovdown regulated in Jab1 knockdown cell lines without inhibitor which indicats that Jab1 may regulateNovgene through epigenetics.

breast cancer; Jab1; methylation;Nov

0427-7104(2016)01-0112-07

2015-05-05

國(guó)家自然科學(xué)基金(81071739,81272385)

王順妮(1989—),女,碩士研究生；陳浩明,男,副教授,E-mail: hmchen@fudan.edu.cn.

R 737.9

A