梁　浩，董愛武，俞　瑜

(1. 復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438；2. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物科學(xué)研究所，上海 200438)

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水稻MRG701互作蛋白的篩選和鑒定

梁浩1,2，董愛武1,2，俞瑜1,2

(1. 復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438；2. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物科學(xué)研究所，上海 200438)

水稻MRG蛋白MRG702作為組蛋白H3K4/H3K36甲基化的識別蛋白，影響了水稻油菜素內(nèi)酯BR通路和開花過程中特異的基因表達.MRG蛋白家族的另外一個成員MRG701在序列上與MRG702高度同源，它們的共同缺失突變體表現(xiàn)出矮小、直立、晚花等多種表型.以MRG701為餌，篩選了水稻全長均一化酵母文庫，得到了26個可能與MRG701結(jié)合的蛋白質(zhì)，通過定位分析，這些蛋白主要定位于細胞核和線粒體中，在二者中的分布比例分別為46.2%和23.1%.通過酵母雙雜交實驗和雙分子免疫熒光實驗，對全部得到的26個蛋白和其中4個蛋白與MRG701蛋白的相互作用進行了驗證，發(fā)現(xiàn)Os10g0410600，Os05g0215800，Os04g0687100和MRG701在煙草中存在相互作用，為進一步研究甲基化識別蛋白的作用機制及作用網(wǎng)絡(luò)提供了基礎(chǔ).

水稻； 酵母文庫篩選； MRG701； 結(jié)合蛋白

作為一種重要的組蛋白修飾，組蛋白甲基化在真核生物表觀遺傳調(diào)控基因表達過程中扮演著重要的角色[1].組蛋白賴氨酸甲基化修飾主要發(fā)生在組蛋白H3的第4、9、27、36和79位以及組蛋白H4的第20位賴氨酸殘基上[2-4].在不同位點上的甲基化修飾通常參與不同的生物學(xué)過程，一般認為，組蛋白H3上第4、36和79位的賴氨酸甲基化與轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)，第9、27位和H4上第20位的賴氨酸甲基化與轉(zhuǎn)錄抑制和基因沉默相關(guān)[5-11].這些殘基上的修飾及其排列組合共同組成了組蛋白甲基化密碼.在組蛋白甲基化密碼實現(xiàn)其生物學(xué)功能的過程中，除了需要甲基化密碼的書寫者(writer)甲基轉(zhuǎn)移酶和甲基化密碼的擦去者(eraser)去甲基化酶的參與之外，還涉及到一類能夠特異識別組蛋白甲基化修飾的蛋白，這類組蛋白甲基化識別蛋白被稱為甲基化密碼的閱讀者(reader)[12-16].

目前，關(guān)于H3K36甲基化功能的研究已經(jīng)比較深入，除了參與轉(zhuǎn)錄延伸和抑制異常轉(zhuǎn)錄的起始外，H3K36的甲基化修飾還參與了DNA的復(fù)制、基因的可變剪接、DNA的損傷修復(fù)以及劑量補償效應(yīng)等生物學(xué)過程[17-21]，這些研究都表明H3K36是一個非常重要的甲基化修飾位點.對H3K36甲基轉(zhuǎn)移酶的研究表明在生物體中存在著非常復(fù)雜的H3K36甲基化催化機制，這也暗示著H3K36甲基化修飾在生物體的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著非常重要的影響.已經(jīng)被報道的組蛋白H3K36甲基化識別蛋白包括酵母中的Eaf3和動物中的MRG15，它們都屬于MRG蛋白家族，含有一個C端的MRG domain和一個N端的chromo domain.其N端的chromo domain能夠識別H3K4/H3K36的甲基化修飾，進而招募乙?；笍?fù)合物/去乙?；笍?fù)合物來調(diào)控特定基因的表達[22-23].在植物中，第一個被報道的組蛋白H3K36甲基化識別蛋白是擬南芥中的MRG1和MRG2蛋白，它們能夠在體內(nèi)外識別組蛋白H3K4/H3K36的三甲基化修飾，并且通過和轉(zhuǎn)錄因子CO相結(jié)合來調(diào)控成花素基因FT的表達，進而影響植物的開花[24-25].

水稻是我國重要的農(nóng)作物，是我國糧食的主要來源之一，在單子葉模式植物水稻(OryzasativaL.)中，存在兩個MRG蛋白家族的成員MRG701和MRG702.這兩個蛋白在序列上高度同源，前期的實驗已經(jīng)證明MRG702蛋白能夠在體內(nèi)外識別組蛋白H3K4/H3K36的甲基化修飾，并且影響了水稻油菜素內(nèi)酯BR通路和開花過程中特異的基因表達[26].本文我們以MRG701為餌，通過篩選酵母文庫鑒定得到了MRG701的結(jié)合蛋白，以期為研究組蛋白H3K4/H3K36甲基化識別蛋白的作用機制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)和提供參考.

1　材料與方法

1.1材料

實驗用水稻為日本晴(Oryza.SativaL. ssp.japonica,varnipponbare)，種植于上海市復(fù)旦大學(xué)邯鄲校區(qū)試驗大田和海南省三亞市.酵母菌Y2HGold、Y187，大腸桿菌EscherichiacoliTOP10均由本實驗室保藏；酵母雙雜交載體質(zhì)粒為pGADT7、pGBKT7質(zhì)粒，購自Clontech公司.

1.2MRG701 cDNA的獲得以及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

提取水稻日本晴的總RNA，在干熱滅菌后的研缽中加入液氮，研磨水稻除根之外的部分，利用TRIzol提取水稻RNA.將得到的RNA檢測OD260/OD280，OD260/OD230值，檢測RNA的濃度和質(zhì)量.利用TaKaRa公司cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄PCR擴增得到cDNA.以cDNA為模版擴增得到MRG701基因的cDNA片段.(引物序列MRG701-F： GAATTCATGGGGGGGAGCTCCAACAC；MRG701-R： GGATC CCTATTTGGTCTTTATCCCAT).將擴增得到的MRG701基因的cDNA片段和質(zhì)粒pGADT7、pGBKT7通過限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠回收純化，用T4DNA連接酶16℃過夜連接，最后通過測序檢測序列的準(zhǔn)確性.

1.3酵母轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒細胞毒性和自激活檢測

利用LiAC法制備酵母Y2HGold菌株的感受態(tài)細胞[27]，將構(gòu)建好的pGBKT7-MRG701重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到酵母細胞中，經(jīng)過選擇性平板(SD/-T)篩選，挑取單菌落在SD/-T培養(yǎng)基中培養(yǎng)用作酵母雜交的種子液.抽取酵母總蛋白，用anti-cMyc抗體通過Western blot檢測融合蛋白表達，同時對pGBKT7-MRG701重組質(zhì)粒在酵母Y2HGold菌株中進行自激活檢測.

1.4通過酵母cDNA文庫篩選結(jié)合蛋白

將上述的重組質(zhì)粒pGBKT7-MRG701轉(zhuǎn)化到酵母Y2HGold菌株中，通過選擇性平板(SD/-T)篩選后，將含有重組質(zhì)粒pGBKT7-MRG701的Y2HGold菌株在30℃中搖至OD600=0.8和含有cDNA文庫質(zhì)粒的酵母Y187菌株混合雜交24h，將酵母細胞離心沉淀后重懸濃縮，涂到TDO(SD/-Trp/-Leu/-Ade)平板上，將平板在30℃放置3～7d，將長出的新菌落涂到新的TDO板上，并給每一個菌落編號.將新的TDO放入30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約3d，取出，將平板上的菌落轉(zhuǎn)移到QDO(SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His)平板上，菌落編號不變，放入30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5d，挑取QDO平板上的陽性菌落進行菌落PCR擴增實驗(PRC體系為： 50μL中含5μL 10×PRC buffer，4μL 25mmol/L dNTPs，1μL 20mmol/L T7 Sequencing Primer，1μL 20mmol/L 3’AD Sequencing primer，1μL rTaq酶，95℃，10min；92℃，30s；55℃，30s；72℃，2min； 35個循環(huán))，將擴增后出現(xiàn)的單一電泳條帶編號送到上海桑尼生物公司測序，對測序后的結(jié)果進行分析.

1.5雙分子熒光互補(BiFC)

挑取了4個候選結(jié)合蛋白(MRG701BP1-4)，構(gòu)建它們的雙分子熒光互補的克隆驗證在植物體內(nèi)是否和MRG701蛋白也存在相互作用.電轉(zhuǎn)化克隆質(zhì)粒至農(nóng)桿菌內(nèi)，挑取含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，在含有相應(yīng)抗生素的液體YEB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體.用含終濃度為10mmol/L MgCl2、10mmol/L MES(pH 5.7)和150mol/L乙酰丁香酮的溶液將菌體重新懸浮，調(diào)整菌液濃度使其OD600= 0.8(約為1.5h左右)，室溫下放置2h.將需要共轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌等比例混合.使用1mL注射器將菌液沿小孔緩慢注入煙草葉片組織空隙.22℃培養(yǎng)2d后剪取煙草葉片，制片后使用卡爾蔡司公司共聚焦激光顯微鏡觀察拍照.

2　結(jié)果與分析

2.1誘餌蛋白MRG701的毒性檢測和融合蛋白表達檢測

將構(gòu)建得到的pGBKT7-MRG701質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到酵母Y2HGold菌株中，在缺少色氨酸(SD/-Trp)的平板上，轉(zhuǎn)化的酵母可以正常生長(圖1(a))，酵母細胞的活性正常，表明pGBKT7-MRG701質(zhì)粒不存在細胞毒性.抽取酵母總蛋白，利用anti-cMyc抗體進行Western blot檢測，能夠檢測到融合蛋白的表達(圖1(b))，如圖1(b)所示，pGBKT7-MRG701融合蛋白大小約為35kD，正對照TCP3約為100kD，說明重組蛋白能夠在酵母細胞中穩(wěn)定表達.

2.2重組質(zhì)粒pGBKT7-MRG701的自激活檢測

將重組質(zhì)粒pGBKT7-MRG701(BK-MRG701)和pGADT7(AD)共轉(zhuǎn)到酵母Y2HGold菌株中，通過選擇性二缺平板(SD/-Trp/-Leu)篩選后，將二缺板上生長出來的酵母菌落點滴到TDO平板上(SD/-Trp/-Leu/-Ade)，同時共轉(zhuǎn)pGBKT7(BK)和AD到酵母Y2HGold菌株中作為負對照，共轉(zhuǎn)AD和AtTCP3(TCP3，擬南芥中的基因，來自本實驗室，前面的工作已經(jīng)證明其具有自激活能力)到酵母Y2HGold菌株中作為正對照，30℃培養(yǎng)3～7d，實驗組和負對照沒有菌落長出，正對照長出菌落，說明重組質(zhì)粒BK-MRG701沒有自激活現(xiàn)象，即MRG701蛋白在酵母細胞內(nèi)不會非特異性結(jié)合UAG位點啟動GAL4下游報告基因的表達，可以進行下一步的篩選酵母文庫實驗(圖2).

2.3MRG701 cDNA文庫的篩選結(jié)果

采用酵母雜交的方法，將BK-MRG701質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母Y2HGold菌株中，酵母文庫質(zhì)粒構(gòu)建于酵母Y187菌株中，利用兩種不同類型的酵母能夠雜交融合的原理，使誘餌蛋白MRG701和水稻cDNA文庫蛋白能夠在同一個酵母細胞中相遇，檢測二者之間是否存在相互作用.在試驗中，21塊TDO平板上在3～7d 內(nèi)一共得到了158個大小在2mm以上的酵母菌落，將這些菌落轉(zhuǎn)移到新的TDO平板上保種并給予唯一編號，再點到QDO平板上，在QDO上面長出了136個菌落，抽取酵母中的質(zhì)粒進行PCR擴增，得到了117個單一的擴增條帶，送到公司進行測序.

在本次篩庫實驗中，117個送測樣品有113個測出序列，其中有62個蛋白質(zhì)的閱讀框架是正確的，占總數(shù)的54.9%.測序完成后進行GO(Gene Ontology)功能分析，排除了反向序列、移碼序列、錯誤的序列以及簡并重復(fù)的蛋白后，得到了26個蛋白閱讀框架正確的蛋白，每個蛋白在篩選文庫時的重復(fù)次數(shù)以及功能描述如表1所示.在這26個蛋白中有88.5%的蛋白都有重復(fù)，每個蛋白的平均重復(fù)次數(shù)為2.4次，水稻大約有3萬個基因，在本次篩庫實驗之前檢測的酵母文庫的濃度為1×106cfu，酵母雜交的效率約為5%，本次篩庫實驗所用的酵母文庫為2mL，經(jīng)過計算本次篩庫實驗每個水稻基因能夠覆蓋3次左右，這個和篩選得到的閱讀框架正確的蛋白的重復(fù)次數(shù)2.4次是很接近的，這說明本次篩庫的結(jié)果是真實可信的.

表1　MRG701結(jié)合蛋白及功能分析

(續(xù)表)

1)各組分比例Unknown cellular component 11.5%，Cell wall 3.84%，Chloroplast 3.84%，Endoplasmic reticulum 3.84%，Cell membrane 7.69%，Golgi apparatus 11.5%，Cytoplasm 15.4%，Mitochondrion 23.1%，Nucleus 46.2%.

把這26個酵母菌落的質(zhì)粒提取出來和BK-MRG701共轉(zhuǎn)到Y(jié)2HGold菌株里面，全部都能在三缺和四缺板上生長(圖3)，進一步說明本次酵母文庫篩選的結(jié)果是準(zhǔn)確可信的.

對得到的26個結(jié)合的蛋白亞細胞定位進行了預(yù)測統(tǒng)計分析(表1注釋).發(fā)現(xiàn)有46.2%的MRG701結(jié)合蛋白定位在細胞核中，這和MRG701作為一個甲基識別蛋白需要在核內(nèi)行使功能是密不可分的.有意思的是，23.1%的結(jié)合蛋白定位在線粒體中，這暗示著組蛋白甲基化修飾可能和胞內(nèi)能量代謝有緊密的關(guān)系.這也為研究組蛋白甲基化識別蛋白的作用機制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)和提供了線索.

對得到的26個互作蛋白在代謝途徑中的功能進行了統(tǒng)計分析(表2，見第86頁)，顯示得到的26個結(jié)合蛋白參與了多個生物學(xué)過程，這些功能的發(fā)揮和其在細胞中的定位是吻合的.

表2　MRG701結(jié)合蛋白功能統(tǒng)計分析

2.4結(jié)合蛋白的體內(nèi)驗證

為了驗證酵母中的蛋白相互作用在植物體內(nèi)是否也存在，從篩庫得到的26個蛋白中，我們隨機挑取了4個蛋白MRG701BP1∶Os10g0410600 MRG701BP2∶Os05g0215800 MRG701BP3∶Os04g0687100 MRG701BP4∶Os06g0143100(表1中編號分別為15，17，19，6)，構(gòu)建了這四個蛋白的雙分子熒光互補(BiFC)克隆，利用BiFC實驗驗證在煙草葉片體系中是否存在相互作用.如圖4所示，隨機挑取的4個蛋白中有3個(MRG701BP1～3)和MRG701蛋白在植物體內(nèi)存在相互作用.而MRG701BP4(Os06g0143100)與MRG701的結(jié)合在煙草葉片體系中沒有得到驗證，可能與該結(jié)合蛋白的高爾基體定位有關(guān).

3　討　論

在酵母文庫篩選實驗中，均一化酵母文庫的質(zhì)量和實驗室條件下酵母雜交的效率是兩個非常重要的因素，在本次實驗中，先利用抽提水稻各個組織RNA后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再通過均一化技術(shù)增加低豐度基因的拷貝來構(gòu)建的水稻酵母篩選文庫，通過梯度稀釋后檢測到文庫的濃度為1×106cfu，文庫的重組率和冗余度分別為為95%和1%，這些都表明構(gòu)建的酵母文庫的質(zhì)量比較高.同時利用陽性對照檢測到在實驗室條件下Y2HGold和Y187菌株的雜交率為5%，接近其他實驗室條件下的酵母實驗的雜交率.

在篩選酵母文庫中，一般采用兩套系統(tǒng)，質(zhì)粒共轉(zhuǎn)和酵母雜交，兩套系統(tǒng)各自擁有不同的優(yōu)缺點，質(zhì)粒共轉(zhuǎn)系統(tǒng)中，能夠克服酵母雜交率比較低，細胞毒性的問題，增加文庫中基因的覆蓋率，但是同時也存在一定的缺陷，比如文庫制備時的要求更加高，很難做到均一化，這樣就導(dǎo)致很多低表達量的蛋白被其他高豐度的蛋白稀釋覆蓋，從而無法篩選到；酵母雜交系統(tǒng)的缺點在于酵母雜交率一般都比較低，這樣就需要濃度比較高的酵母文庫來開展實驗，優(yōu)點是操作比較方便，文庫構(gòu)建均一化技術(shù)相對比較成熟，篩庫的結(jié)果比較全面.綜合這些因素后，考慮到MRG701蛋白在植物體內(nèi)自身表達量很低的情況，本研究選擇采用酵母雜交系統(tǒng)篩選其互作蛋白.

水稻里面關(guān)于甲基轉(zhuǎn)移酶的工作表明了組蛋白H3K36甲基化的催化機制非常復(fù)雜，有多種酶參與這一生物學(xué)過程，并且在水稻生長發(fā)育過程中起著多重影響，這些調(diào)控過程需要甲基化識別蛋白的參與才能夠?qū)崿F(xiàn).通過篩選酵母文庫我們得到了一些MRG701的結(jié)合蛋白，這些蛋白參與了多個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，功能涉及到多個方面，如蛋白質(zhì)的磷酸化，輔酶代謝，蛋白質(zhì)的加工折疊、轉(zhuǎn)運，能量代謝和逆境適應(yīng)等.考慮到MRG701/MRG702是組蛋白甲基化識別蛋白，因而組蛋白的甲基化和其他核內(nèi)蛋白的磷酸化等修飾以及輔酶的代謝在調(diào)控基因表達方面可能存在一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這也證實了我們關(guān)于組蛋白甲基化復(fù)雜的作用機制和網(wǎng)絡(luò)通路的猜想，圍繞這一部分基因的研究將會是組蛋白甲基化識別蛋白研究的后續(xù)工作的一個重要的方面.

我們后續(xù)的工作將主要集中在獲得有效的水稻mrg701突變體，利用遺傳學(xué)和分子生物學(xué)手段深入研究MRG701蛋白及其結(jié)合蛋白的功能和其在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的位置，以期更好地闡明組蛋白甲基化的分子機制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò).

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Screening Interaction Proteins of Rice Protein MRG701 by Yeast Two Hybrid

LIANG Hao1,2， DONG Aiwu1,2， YU Yu1,2

(1. State Key Laboratory of Genetic Engineering, Fudan University, Shanghai 200438, China;2.InstituteofPlantBiology,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

MRG protein MRG702, a reader of H3K4/H3K36 methylation, is involved in brassinosteroid-regulated growth and flowering time control in rice. MRG701 shares extremely high identity with MRG702, and knock-down expression of both MRG701 and MRG702 displays typical BR-deficient and late-flowering phenotypes. Using MRG701 as the bait protein, we screened rice cDNA library by yeast two hybrid system and obtained 26 interaction proteins of MRG701. By localization analysis, those proteins are located in cell nucleus and mitochondria, each accounted for 46.2% and 23.1% respectively. The interactions between MRG701 and some selected proteins were confirmed by yeast two hybrid and BiFC assays, we find that there is interaction among Os10g0410600，Os05g0215800，Os04g0687100 and MRG701 in tobacco. Our data provides clues for further understanding the molecular mechanism and the interaction network underlying how reader proteins recognize the histone methylation marks.

Rice; Yeast library screening; MRG701; binding proteins

0427-7104(2016)01-0082-07

2015-04-14

國家自然科學(xué)基金(31371304)

梁浩(1989—)，男，碩士研究生；俞瑜，女，講師，通訊聯(lián)系人，E-mail： yuy@fudan.edu.cn.

Q 946.1

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