于群，段偉文，劉兵，段振華，，*，商飛飛（.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口5708；.賀州學(xué)院食品研究院，廣西賀州54899）

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憂遁草活性物質(zhì)超聲輔助提取工藝的優(yōu)化

于群1，段偉文2，劉兵1，段振華1，2，*，商飛飛2
（1.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228；2.賀州學(xué)院食品研究院，廣西賀州542899）

以多酚、黃酮、三萜和維生素C 4種活性物質(zhì)為指標(biāo)，研究超聲時(shí)間、超聲溫度、料液比和超聲功率對(duì)憂遁草中活性物質(zhì)提取效果的影響，利用正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助提取憂遁草活性物質(zhì)的最佳工藝條件。試驗(yàn)結(jié)果表明料液比和超聲時(shí)間對(duì)多酚、黃酮和維生素C得率的影響較大；超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)三萜得率影響較大。通過(guò)四因素三水平的正交試驗(yàn)，確定了憂遁草中4種活性物質(zhì)提取的最佳條件，得出超聲輔助提取的最優(yōu)提取工藝是：超聲時(shí)間40 min，超聲溫度45℃，料液比1∶55（mg/mL），超聲功率156 W。在此條件下4種活性成分的得率分別為：多酚9.387 mg/g，黃酮28.785 mg/g，三萜23.665mg/g，維生素C0.216mg/g。

憂遁草；活性物質(zhì)；超聲波；提取

憂遁草又名鱷嘴花、扭序花等，在海南省五指山等少數(shù)民族地區(qū)稱之為“接骨草”。憂遁草為爵床科鱷嘴花屬植物，生長(zhǎng)在靠近赤道的低海拔疏林中或灌叢內(nèi)潮濕砂質(zhì)土壤里，是一種高大草本植物，它分布于東南亞地區(qū)以及我國(guó)海南、廣東、廣西和云南等地［1-2］。憂遁草一般以全株或葉片入藥，味甘、微苦，性涼，具有清熱利濕、利尿消腫、活血疏經(jīng)、除濕、抗腫瘤等功效。在泰國(guó)民間，憂遁草已被作為一種廣泛運(yùn)用的藥用植物，常被用于昆蟲或毒蛇咬傷［3］。據(jù)文獻(xiàn)記載，憂遁草的這些生理活性主要?dú)w根于其中含有豐富的三萜類、黃酮糖苷、多酚類和維生素類等活性成分［4-5］。所以將這些活性成分充分高效地提取具有重要意義。超聲提取技術(shù)操作簡(jiǎn)單、快捷，提取成本低，而且超聲波能顯著加速傳質(zhì)過(guò)程，提高提取效率［6-8］。本文以多酚、黃酮、三萜和維生素C 4種活性物質(zhì)為測(cè)定指標(biāo)，利用超聲波輔助提取憂遁草中的活性物質(zhì)，確定最佳工藝，為憂遁草的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

憂遁草粉末：海南五指山萬(wàn)家寶科技有限公司提供。

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、2，6-二氯靛酚、齊墩果酸和香草醛：上海源葉生物科技有限公司；福林酚標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司；抗壞血酸：西隴化工股份有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2主要儀器與設(shè)備

KS-300E超聲波清洗機(jī)：寧波科生儀器廠；7200可見分光光度計(jì)：龍尼柯（上海）儀器有限公司；BS124S電子天平：Sartorius公司；HH-S26S電熱恒溫水浴鍋：金壇市大地自動(dòng)化儀器廠；TDZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；EL204電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司等。

1.3方法

1.3.1多酚得率的測(cè)定方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：參照徐輝艷等［9］方法，稍作修改。以試劑空白參比，用最小二乘法做線性回歸，得多酚濃度（mg/mL）與吸光度A的回歸方程為A= 91.406C1+0.015 9，r2=0.995 8。

量取提取液0.5 mL，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟操作測(cè)定吸光度并由上述公式計(jì)算得到多酚的質(zhì)量濃度。

多酚得率/（mg/g）=100C1×V1/m，式中：C1為多酚的質(zhì)量濃度；V1為待測(cè)液體積；m為憂遁草質(zhì)量。

1.3.2黃酮得率的測(cè)定方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：參照李鵬婧等［10］方法，稍作修改。以試劑空白參比，用最小二乘法做線性回歸，得黃酮濃度（mg/mL）與吸光度A的回歸方程為A=5.8766C2+ 0.015 9，r2=0.995 5。

量取提取液1 mL，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟操作測(cè)定吸光度并由上述公式計(jì)算得到黃酮的質(zhì)量濃度。

黃酮得率/（mg/g）=100C2×V2/m，式中：C2為黃酮的質(zhì)量濃度；V2為待測(cè)液體積；m為憂遁草質(zhì)量。

1.3.3三萜得率的測(cè)定方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：參照黃生權(quán)等［11］方法，稍作修改。以試劑空白參比，用最小二乘法做線性回歸，得三萜濃度（mg/mL）與吸光度A的回歸方程為A= 42.899C3－0.016 2，r2=0.995 8。

量取提取液0.5 mL，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟操作測(cè)定吸光度并由上述公式計(jì)算得到三萜的質(zhì)量濃度。

三萜得率/（mg/g）=100C3×V3/m，式中：C3為三萜的質(zhì)量濃度；V3為待測(cè)液體積；m為憂遁草質(zhì)量。

1.3.4維生素C含量的測(cè)定方法

參照趙曉梅等［12］方法，稍作修改，對(duì)憂遁草中的維生素C含量進(jìn)行測(cè)定。先對(duì)2，6-二氯靛酚進(jìn)行標(biāo)定，標(biāo)定所得滴定度T（mg/mL）的計(jì)算公式為：T=CV/（V1-V0），式中：C為標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸濃度；V為吸取的標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液體積；V0為空白溶液滴定所消耗的2，6-二氯靛酚溶液體積；V1為滴定所消耗的2，6-二氯靛酚溶液體積。

然后根據(jù)公式計(jì)算維生素C（mg/100 mg）的提取率：維生素C/（mg/100 mg）=5（V2-V0）T/M，式中：V0為空白溶液滴定所消耗的2，6-二氯靛酚溶液體積；V2為提取液滴定時(shí)所消耗的2，6-二氯靛酚溶液體積；T為滴定度；M為測(cè)定時(shí)吸取的提取液相當(dāng)于憂遁草原料的質(zhì)量。

1.3.5提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素試驗(yàn)：根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲時(shí)間（10、20、30、40、50 min）、料液比［1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（mg/mL）］、超聲溫度（30、40、50、60、70℃）和超聲功率（72、108、144、180、216 W）4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在控制其他因素不變的情況下，考察各個(gè)單因素對(duì)憂遁草多酚、多糖、黃酮和維生素C得率的影響。

正交試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上以超聲時(shí)間、料液比、超聲溫度和超聲功率為考察因素，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)，對(duì)超聲波輔助提取憂遁草活性物質(zhì)的工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1超聲時(shí)間對(duì)活性成分得率影響的結(jié)果與分析

準(zhǔn)確稱取1.00 g憂遁草粉末，設(shè)定超聲溫度為50℃，超聲功率為144 W，探索超聲時(shí)間對(duì)憂遁草各活性成分得率的影響。結(jié)果如圖1所示。

圖1　超聲時(shí)間對(duì)得率的影響Fig.1　Effect of ultrasound treatment time on yield

由圖1可以看出，隨著超聲時(shí)間的增加各成分得率都呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間增加到30 min時(shí)，隨著超聲時(shí)間的增加，維生素C和三萜含量呈明顯下降趨勢(shì)，其他成分變化較平緩。這可能是因?yàn)槌晻r(shí)間的延長(zhǎng)使已溶出的維生素C被氧化而造成損失；而且超聲波獨(dú)具的物理性質(zhì)能夠促使植物細(xì)胞組織破壁或變形，短時(shí)間內(nèi)即可獲得最佳得率，但隨著時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，強(qiáng)烈的空化作用將使分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變且超聲波處理過(guò)程不斷產(chǎn)熱，對(duì)三萜造成一定損失［13］；除此之外，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，一些黃酮和多酚因不穩(wěn)定而易被氧化，時(shí)間過(guò)短，部分黃酮和多酚溶解不充分［14］。因此，從節(jié)約能源和活性物質(zhì)得率降低的角度考慮，選定30 min為較適超聲時(shí)間。

2.1.2料液比對(duì)活性成分得率影響的結(jié)果與分析

設(shè)定超聲時(shí)間30 min，超聲溫度為50℃，超聲功率比為144 W，探索料液比對(duì)憂遁草各活性成分得率的影響。結(jié)果如圖2所示。

圖2　料液比對(duì)得率的影響Fig.2　Effect of material/liquid radio on yield

由圖2可以看出，隨著料液比的增加，多酚、黃酮、維生素C和三萜的得率呈現(xiàn)增大趨勢(shì)，其中，維生素C、三萜和多酚在料液比為1∶50（mg/mL）時(shí)出現(xiàn)最大值，黃酮、三萜和多酚的含量隨著料液比的增加而趨于平穩(wěn)，這可能是因?yàn)槿軇┝窟^(guò)大時(shí)，超聲波輻射被溶劑分子吸收較多，溶劑分子分散了超聲波對(duì)有效成分的作用，作用于物料相對(duì)較少，活性物質(zhì)提取不完全，因而會(huì)影響黃酮、三萜和多酚的析出［15］。綜上考慮，選擇1∶50（mg/mL）為較適料液比。

2.1.3超聲溫度對(duì)活性成分得率影響的結(jié)果與分析

準(zhǔn)確稱取1.00 g憂遁草粉末，設(shè)定超聲時(shí)間為30 min，超聲功率為144 W，探索超聲溫度對(duì)憂遁草各活性成分得率的影響。結(jié)果如圖3所示。

圖3　超聲溫度對(duì)得率的影響Fig.3　Effect of ultrasound temperature on yield

由圖3可以看出，隨著溫度的升高，4種活性物質(zhì)的得率都表現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，其中黃酮和維生素C在整個(gè)過(guò)程中變化趨勢(shì)較明顯，多酚和三萜變化趨勢(shì)較平緩。隨著提取溫度的上升，活性分子的運(yùn)動(dòng)速度加快，而且熱量對(duì)細(xì)胞壁有破壞作用，使其容易從細(xì)胞中提取出來(lái)，當(dāng)提取溫度達(dá)到50℃時(shí)，繼續(xù)增加溫度，提取率有所下降，這可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高，活性物質(zhì)易被氧化，導(dǎo)致得率降低［16］。此外，多酚在較高溫度和超聲波的作用下還可能發(fā)生變質(zhì)［17］，所以，選擇50℃為較佳提取溫度。

2.1.4超聲功率對(duì)活性成分得率影響的結(jié)果與分析

準(zhǔn)確稱取1.00 g憂遁草粉末，設(shè)定超聲時(shí)間為30 min，超聲溫度為50℃，探索超聲功率對(duì)憂遁草各活性成分得率的影響。結(jié)果如圖4所示。

圖4　超聲功率對(duì)得率的影響Fig.4　Effect of ultrasound power on yield

由圖4可以看出，隨著超聲功率的增加，4種活性物質(zhì)的得率呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，當(dāng)超聲功率達(dá)到144 W時(shí)，四種活性物質(zhì)的功率達(dá)到最大值，但隨著超聲功率的繼續(xù)增加，活性物質(zhì)得率下降。這主要是由于超聲功率的增加，溶劑分子擴(kuò)散速度加快，有利于活性物質(zhì)的浸出；但隨著功率的進(jìn)一步增加，過(guò)高的超聲功率產(chǎn)生瞬時(shí)高溫會(huì)使許多活性成分遭到破壞，雜質(zhì)溶出較多，因此它們得率會(huì)降低［18］。綜上考慮，選擇144 W為最佳提取功率。

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲時(shí)間、超聲溫度、料液比和超聲功率為考察因素，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)表見表1。

表1　正交試驗(yàn)因素水平表Table 1　Factors and their levels in orthogonal array design

試驗(yàn)結(jié)果分析如表2所示。

由表2可以看出，多酚得率影響因素的主次順序?yàn)镃＞A＞D＞B，A2B1C3D3為最優(yōu)組合；黃酮得率影響因素的主次順序?yàn)锳＞C＞D＞B，A3B2C3D2為最優(yōu)組合；三萜得率影響因素的主次順序?yàn)镈＞A＞C＞B，A2B1C2D3為最優(yōu)組合；維生素C得率影響因素的主次順序?yàn)锳＞C＞D＞B，A1B3C2D3為最優(yōu)組合?？紤]到料液比對(duì)多酚的影響最顯著，所以選擇多酚的最佳料液比1∶55（mg/mL）為最優(yōu)料液比；超聲時(shí)間對(duì)黃酮的影響最顯著，所以選擇黃酮的最佳超聲時(shí)間40 min為最優(yōu)超聲時(shí)間；而超聲功率對(duì)三萜的影響最顯著，所以選擇三萜的最佳超聲功率156 W為最優(yōu)超聲功率；超聲溫度對(duì)4種活性物質(zhì)的影響并不顯著，為保證其最大活性，選擇45℃為最優(yōu)超聲溫度。綜上所述，確定最優(yōu)組合為A3B1C3D3，即提取時(shí)間40 min，超聲溫度45℃，料液比1∶55（mg/mL），超聲功率156 W。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2　Results of orthogonal test

根據(jù)篩選到的最優(yōu)組合進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果平均值為：多酚得率9.476 mg/g，黃酮得率28.695 mg/g，三萜得率23.719 mg/g，維生素C得率0.216 mg/g均高于或接近正交試驗(yàn)結(jié)果。

3　結(jié)論

利用超聲波技術(shù)輔助提取憂遁草內(nèi)4種活性物質(zhì)（多酚、黃酮、三萜、維生素C）。并考察4個(gè)因素（超聲時(shí)間、超聲溫度、料液比和超聲功率）對(duì)4種活性物質(zhì)得率的影響。

多酚得率的影響大小因素次序?yàn)榱弦罕龋咎崛r(shí)間＞超聲功率＞超聲溫度，黃酮得率的影響大小因素次序?yàn)樘崛r(shí)間＞料液比＞超聲功率＞超聲溫度，三萜得率的影響大小因素次序?yàn)槌暪β剩咎崛r(shí)間＞料液比＞超聲溫度，維生素C得率的影響大小因素次序?yàn)樘崛r(shí)間＞料液比＞超聲功率＞超聲溫度。

超聲波輔助提取的最佳條件為：提取時(shí)間40 min，超聲溫度45℃，料液比1∶55（mg/mL），超聲功率156 W。

［1］林級(jí)田，李惠敏，余競(jìng)光.傣藥扭序花化學(xué)成分的研究［J］.中草藥，1983，14（8）:337

［2］劉旭，郭文潔，黃丹民，等.鱷嘴花正丁醇提取物對(duì)小鼠Heps肝癌的抑制作用［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2014，24（3）:211-215

［3］王賢兒，鐘希文，張文霞，等.基于憂遁草化學(xué)成分研究分析其抗腫瘤作用［J］.中國(guó)藥房，2013，24（43）:4104-4107

［4］易博，徐文彤，鄧盾，等.鱷嘴花葉氨基酸和微量元素分析及其化學(xué)成分研究［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28（5）:396

［5］Dampawan P，Huntrakul C，Reutrakul V，et al.Constituents of Clinacanthus nutans and the crystal structure of LUP-20（29）-ene-3-one［J］.J Sci Soc Thai，1977（3）:14

［6］劉怡彤，段振華，馬華林，等.超聲波輔助提取黃秋葵多酚和多糖的工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（21）:247-249，253

［7］段振華，汪菊蘭，王美蓉.超聲波輔助制備魚鰾寡肽的研究［J］.中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2008（6）:27-29

［8］Duan Zhen-hua，Li Yan-lan，Wang Ju-lan.Study on the technology of extraction protein of fish swim bladder with ultrasonic treatment［J］.Advanced Materials Research，2012（396/398）:1413-1416

［9］徐輝艷，孫曉東，張佩君，等.紅棗汁中總酚含量的福林法測(cè)定［J］.食品研究與開發(fā)，2009，30（3）:126-128

［10］李鵬婧，柳旭光，龍海榮，等.超聲波輔助提取菱角殼總黃酮及抗氧化性研究［J］.食品科技，2011，36（1）:167-171

［11］黃生權(quán)，姚松君，劉翠玲，等.不同生長(zhǎng)期的靈芝三萜含量測(cè)定及變化規(guī)律研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2011，27（8）:1015-1019

［12］趙曉梅，江英，吳玉鵬.果蔬VC含量測(cè)定方法的研究［J］.食品科學(xué)，2006，27（3）:197-199

［13］陳莉華，吳玲，李林芝，等.玄參總?cè)铺崛∥镏苽浼捌淇寡趸锘钚匝芯浚跩］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2013，33（6）:85-90

［14］肖曉瑩，龐杰.顯齒蛇葡萄黃酮化合物提取及其提取物抗氧化活性研究［D］.福州:福建農(nóng)林大學(xué)2013:18-19

［15］呂明生，王淑軍，房耀維，等.超聲波提取雪蓮薯多糖工藝優(yōu)化及其對(duì)羥自由基的清除［J］.食品科學(xué)，2011，32（2）:24-27

［16］李曉軍，吳俊林，等.超聲波輔助提取金銀花黃酮類化合物的研究［D］.西安:陜西師范大學(xué)，2009:29

［17］婁在祥，王洪新，陳尚衛(wèi)，等.牛蒡葉多酚的超聲波輔助提取及抗氧化活性、成分分析研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，31（8）:261-264

［18］韓曉祥，周凌霄，勵(lì)建榮，等.超聲波輔助提取胡柚皮黃酮及抗氧化作用研究［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2011，11（4）:55-61

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction Process for Active Substance from Clinacanthus nutans

YU Qun1，DUAN Wei-wen2，LIU Bing1，DUAN Zhen-hua1，2，*，SHANG Fei-fei2
（1.College of Food Science，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China；2.Institue of Food Research，Hezhou University，Hezhou 542899，Guangxi，China）

With polyphenols，flavonoids，triterpenoid and vitaminC as detection index，the effect of ultrasonic temperature，time，power and solid-liquid ratio on extraction efficiency was studied.Optimum extraction process was determined by orthogonal test.The solid-liquid ratio and ultrasonic time had great effect on extraction efficiency of polyphenols，flavonoids and vitaminC.The ultrasonic power and ultrasonic time had a greater effect on triterpenoid than the temperature and solid-liquid ratio.The best condition of active substance of Clinacanthus nutans was determined by four-factor and three-level orthogonal test.The optimal extraction process conditions were determined as follows：ultrasonic temperature，45℃；ultrasonic power，156W；and solid-liquid ratio，1∶55（mg/mL）for an extraction duration of 40 minutes.Under these conditions the extraction yield of each component were：polyphenols 9.387 mg/g，flavonoids 28.785 mg/g，triterpenoid 23.665 mg/g，vitaminC 0.216 mg/g.

Cinacanthus nutans；active substance；ultrasonic；extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.013

于群（1993—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品工程。

段振華（1965—），男（漢），教授，博士，研究方向：水產(chǎn)品食品科學(xué)技術(shù)。

2015-11-27