李鑫玲，孫曉菲，李欣（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽471003）

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纖維素降解菌的篩選及酶學(xué)性質(zhì)的研究

李鑫玲，孫曉菲，李欣
（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽471003）

從土壤樣本中分離得到1株酶活性質(zhì)較高的菌株，采用3，5-二硝基水楊酸顯色法（DNS）進行酶活性測定，測定結(jié)果表明該菌株產(chǎn)酶的最適反應(yīng)溫度為50℃；溫度在40℃～60℃時，酶有較高的熱穩(wěn)定性；最適反應(yīng)pH 5.0；pH在4～6時，酶穩(wěn)定性達到75%以上；Ca2+、Mn2+是酶反應(yīng)的促進劑，Pb2+、Hg2+為酶反應(yīng)的抑制劑。

纖維素降解菌；篩選；酶學(xué)性質(zhì)

纖維素是自然界最豐富、來源最廣泛的有機物質(zhì)，是地球上重要的可再生資源［1］。我國植物纖維素資源豐富，但大部分被焚燒、廢棄，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。大量研究表明，要纖維素被分解或轉(zhuǎn)化成小分子化合物或其他營養(yǎng)物質(zhì)，纖維素生物降解具有其它方法無法比擬的優(yōu)點，因此纖維素酶高產(chǎn)菌的篩選和產(chǎn)酶研究具有重要現(xiàn)實意義。本研究對纖維素酶產(chǎn)生菌進行分離，并對其酶學(xué)性質(zhì)進行初步研究，旨在為該菌的應(yīng)用研究提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1樣品

土樣來源：河南科技大學(xué)校園圃的草底土、垃圾堆土及腐葉土。

1.1.2培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基［2］、纖維素剛果紅分離培養(yǎng)基［3］、液體搖瓶復(fù)篩培養(yǎng)基［4］。

1.2方法

1.2.1纖維素降解菌的初篩

將采集的樣品經(jīng)30℃、220 r/min富集培養(yǎng)48 h后，按10-2、10-3、10-4、10-5、10-6進行梯度稀釋，并涂布于纖維素剛果紅篩選培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)48 h，測量菌落和透明圈直徑，以透明圈直徑與菌落直徑的比值（D/d）、透明圈清晰度為指標(biāo)進行篩選。挑選出D/d值較大，且生長較快的單菌落作為初篩菌株。

1.2.2纖維素降解菌的復(fù)篩

將經(jīng)過初篩后獲得的菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)5 d。分別測定羧甲基纖維素酶（CMCase）活性和濾紙酶（FPA）活性，以酶活為指標(biāo)篩選出目的菌株。

1.2.3纖維素酶活測定

1.2.3.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的葡萄糖溶液，按照DNS法［9］繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2粗酶液的制備

取培養(yǎng)一定時間的發(fā)酵液10mL，在4℃，6000r/min條件下離心15 min，上清液即為粗酶液。

1.2.3.3酶活性測定

羧甲基纖維素酶（CMCase）活性和濾紙酶（FPA）活性采用3，5-二硝基水楊酸顯色法（DNS法）［5］測定。酶活性單位（U）定義為40℃、pH為7的條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化底物產(chǎn)生1 mg還原糖（以葡萄糖計）所需的酶量為1 U/mL。

1.2.4酶學(xué)特性的初步研究

在250 mL錐形瓶中進行液體發(fā)酵，改變某一條件并保持其他發(fā)酵條件不變，通過測定CMCase和FPA活性，研究培養(yǎng)溫度、熱穩(wěn)定性、最適pH、pH穩(wěn)定性及金屬離子對酶活的影響。

2　結(jié)果與分析

2.1纖維素降解菌的初篩

用CMC-Na剛果紅分離培養(yǎng)基分離純化菌種后，通過觀察，發(fā)現(xiàn)有6株菌產(chǎn)生較明顯的透明圈，其編號分別為1、2、3、4、5、6。觀察透明圈、測量透明圈大小，透明圈與菌落直徑之比見表1。

表1　菌落及透明圈直徑Tabel 1　The diameter of colony and transparent circle

由表1可知，編號為1、2、3、5的4個菌株的透明圈直徑/菌落直徑比值較大，作為初篩菌株。

2.2纖維素降解菌的復(fù)篩

2.2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以光密度（OD540）為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of glucose concentration

2.2.2復(fù)篩結(jié)果

復(fù)篩結(jié)果見圖2。

由圖2可知，初篩菌株的CMC酶活順序為3號＞5號＞1號＞2號，F(xiàn)PA酶活順序為3號＞1號＞2號＞5號，因此選出3號作為復(fù)篩菌株。

圖2　復(fù)篩結(jié)果Fig.2　Results of rescreening

2.3酶活性質(zhì)的研究

2.3.1酶反應(yīng)的最適溫度

溫度對酶活力的影響見圖3。

圖3　溫度對酶活力的影響Fig.3　Effect of temperature on cellulase activity

由圖3可知，該菌株在50℃時酶活力達到最高峰，然后開始呈下降趨勢。故50℃為該酶的最適反應(yīng)溫度。

2.3.2酶反應(yīng)的熱穩(wěn)定性

不同溫度下酶的穩(wěn)定性見圖4。

圖4　不同溫度下酶的穩(wěn)定性Fig.4　Effect of temperature on cellulase stability

由圖4可知，在40℃～60℃時，3號菌所產(chǎn)酶有較高的穩(wěn)定性，當(dāng)溫度超過60℃時酶活力下降很快，說明該菌所產(chǎn)纖維素酶屬于中溫型的酶。

2.3.3酶反應(yīng)的最適pH

pH對酶活力的影響見圖5。

由圖5可知，3號菌所產(chǎn)酶的酶活在pH為4～6時酶活性較高，最適反應(yīng)pH為5.0左右。

圖5　pH對酶活力的影響Fig.5　Effect of pH value on cellulase activity

2.3.4不同pH條件下酶的穩(wěn)定性的研究

將粗酶液置于不同pH（4、5、6、7、8、9）環(huán)境中，于50℃保溫60 min然后測定其剩余酶活力，見圖6。

圖6　不同pH下酶的穩(wěn)定性Fig.6　Effect of pH value on cellulase stability

由圖6可知，3號菌所產(chǎn)酶在pH 4～6時活性在75%以上，當(dāng)pH大于6時，酶穩(wěn)定性下降很快，所以該酶屬于酸性酶。

2.3.5金屬離子對酶活性的影響

在粗酶液反應(yīng)體系中加入1×10-2mol/L的Ca2+、Mn2+、Pb2+、Hg2+、K+、Fe2+，反應(yīng)30 min后測定3號菌的CMC酶活力，對照組不加金屬離子，見圖7。

圖7　金屬離子對CMC酶活力的影響Fig.7　Effect of metal ions on cellulase activity

由圖7可知，1×10-2mol/L的Ca2+、Mn2+對3號菌所產(chǎn)酶的CMC酶活力有明顯的促進作用，酶活力分別提高了31%和28%，而Pb2+、Hg2+為酶反應(yīng)的抑制劑，酶活力分別下降了37%和28%。K+、Fe2+對酶活力的作用不是十分明顯。

3　結(jié)論

本研究經(jīng)篩選得到1株酶活性質(zhì)較高的菌株，并對其產(chǎn)酶的酶學(xué)性質(zhì)進行初步研究。通過DNS法測定3號菌株CMC和FPA酶活，確定出該菌株產(chǎn)酶的最適反應(yīng)溫度為50℃；溫度在40℃～60℃時，酶有較高的熱穩(wěn)定性；最適反應(yīng)pH是5.0；pH在4～6時，酶穩(wěn)定性達到75%以上；Ca2+、Mn2+是酶反應(yīng)的促進劑，Pb2+、Hg2+為酶反應(yīng)的抑制劑。

［1］Lynd L R，Paul J W，Vanzyl W H，et al.Microbial cellulose utilization:fundamentals and biotechnology［J］.Microbiology and Biology Reviews，2002，66（3）:65-77

［2］陳路劼，劉斌，林白雪，等.降解纖維素嗜熱菌的分離及纖維素酶性質(zhì)分析［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，39（1）:67-72

［3］高春，孟建宇，馮福應(yīng).纖維素降解菌的分離篩選及其酶活研究［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2008，29（4）:17-20

［4］劉海波，王義強，陳介南，等.一株高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選與鑒定［J］.生物學(xué)雜志，2008，25（3）:16-20，12

［5］Miller G L.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar［J］.Anal Chem，1959，31（3）:426-428

Screening of Cellulose-degrading Bacteria and Studies on Characters of Enzyme Activity

LI Xin-ling，SUN Xiao-fei，LI Xin
（Food and Bioengineering Department，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，Henan，China）

From the nature of a strain isolated from soil samples of enzyme activity of high strain，and their enzyme activities were determined by DNS method.The enzyme activity results showed that the strain enzyme optimum temperature of 50℃；temperature in 40℃-60℃，enzymes had higher thermal stability；the optimum reaction pH was 5.0；pH in 4-6，enzyme stability was above 75%；Ca2+，Mn2+was enzyme reaction promoter，Pb2+and Hg2+was enzyme reaction inhibitors.

cellulose-decomposing microorganisms；screening；enzymatic properties

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.039

李鑫玲（1982—），女（漢），實驗師，碩士，研究方向：畜產(chǎn)品加工及食品質(zhì)量與安全。

2015-09-25