李月秋，徐璐璐，吳錦濤，韓媛媛，邸科前，李軍（.河北大學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)中心醫(yī)學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)中心，河北保定07000；.河北大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)與衛(wèi)生事業(yè)管理系，河北保定07000）

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酸解增敏同步熒光測(cè)動(dòng)物食品中頭孢拉定殘留

李月秋1，徐璐璐2，吳錦濤2，韓媛媛1，邸科前1，李軍1
（1.河北大學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)中心醫(yī)學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)中心，河北保定071000；2.河北大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)與衛(wèi)生事業(yè)管理系，河北保定071000）

基于頭孢拉定酸性降解產(chǎn)物熒光強(qiáng)度更強(qiáng)，吐溫-20能提高降解產(chǎn)物熒光強(qiáng)度，建立測(cè)定動(dòng)物性食品中頭孢拉定殘留量的同步熒光分光光度法。對(duì)降解介質(zhì)及波長(zhǎng)差進(jìn)行了選擇，討論加熱時(shí)長(zhǎng)、硫酸體積、pH值、表面活性劑種類及用量對(duì)降解產(chǎn)物熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果：選擇1.5 mL 2.0 mol/L硫酸溶液，加熱120 min，用Na2CO3-NaHCO3緩沖液調(diào)pH值到10.6，加入1 mL 5%吐溫-20溶液，在1 cm熒光比色皿中，于發(fā)射波長(zhǎng)λem420 nm～550 nm內(nèi)，△λ為90 nm條件下掃描測(cè)定，468 nm處讀出熒光強(qiáng)度。應(yīng)用加入乙腈沉淀蛋白的方法對(duì)動(dòng)物性食品進(jìn)行前處理。在0.02 μg/mL～2.00 μg/mL范圍內(nèi)，頭孢拉定濃度與降解產(chǎn)物熒光強(qiáng)度呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 2，檢出限為2.17 ng/mL。加標(biāo)水平在0.4μg/mL～0.6μg/mL范圍內(nèi)，回收率為93.91%～96.90%，RSD為0.50%～0.90%（n=3）。建立的新方法可用于動(dòng)物性食品中頭孢拉定殘留量檢測(cè)。

頭孢拉定；酸性降解；吐溫-20增敏；動(dòng)物性食品；同步熒光分光光度法

我國(guó)政府已將食品安全問(wèn)題上升到了與社會(huì)穩(wěn)定相關(guān)的高度，我國(guó)應(yīng)加大力度解決動(dòng)物性食品中獸用抗菌藥殘留超標(biāo)，生鮮乳違禁物質(zhì)濫用，蔬菜、水果、茶葉中禁限用高毒農(nóng)藥殘留超標(biāo)等突出問(wèn)題，并應(yīng)針對(duì)這些問(wèn)題著手建立食品安全保障體系。此體系中，對(duì)動(dòng)物性食品中獸藥殘留進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測(cè)無(wú)疑是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

頭孢拉定是第一代頭孢烯類β-內(nèi)酰胺抗生素。臨床主要用于呼吸道、泌尿道、皮膚和軟組織等感染。因其具有良好抗菌作用，被廣泛應(yīng)用于畜禽疾病治療預(yù)防中。由于其具有腎毒性和容易引起胃腸功能紊亂，在動(dòng)物性食品中殘留會(huì)影響人類身體健康。

目前，我國(guó)對(duì)頭孢拉定測(cè)定方法很多：中國(guó)藥典測(cè)定頭孢拉定［1］含量的方法為高效液相色譜法（HPLC），同時(shí)該法也是現(xiàn)階段最為常見(jiàn)的檢測(cè)方法之一，主要用于膠囊［2］、藥物［3］、血液［4］、尿液［5］、牛奶［5］等樣品檢測(cè)。該方法檢測(cè)靈敏度高、自動(dòng)化程度高、結(jié)果重現(xiàn)性好；但需使用大量有機(jī)溶劑，檢測(cè)成本高，且易造成環(huán)境污染；前處理過(guò)程復(fù)雜，不利于快速檢測(cè)；對(duì)檢測(cè)人員要求較高，不易推廣。

其他方法還有電化學(xué)分析法［6］，流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法［7-8］，紫外分光光度法［9-10］，毛細(xì)管電泳法［11-12］，質(zhì)譜聯(lián)用［13-14］，熒光分光光度法［15-17］等。電化學(xué)分析法應(yīng)用不是十分普遍，流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法存在著選擇性差的問(wèn)題，紫外法檢測(cè)靈敏度低，毛細(xì)管電泳應(yīng)用于痕量分析時(shí)需要通過(guò)一定的技術(shù)手段進(jìn)行富集以提高靈敏度。質(zhì)譜聯(lián)用雖然靈敏度高，選擇性好，但是不便普及。

熒光法具有便于普及，選擇性好，靈敏度高，新技術(shù)多等優(yōu)點(diǎn)。目前主要用于藥物中頭孢拉定含量測(cè)定。何文亮［17］等研究了頭孢拉定堿性降解反應(yīng)，建立了表面活性劑增敏熒光分光光度法測(cè)定牛奶中頭孢拉定含量。同步熒光光譜法是熒光光譜分析新技術(shù)之一，應(yīng)用最多的是最早提出的恒波長(zhǎng)同步熒光法，具有譜帶窄化，光譜重疊少，散射光影響小等優(yōu)點(diǎn)，有利于進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，減少共存組分干擾。

目前，國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)頭孢拉定酸性降解后，表面活性劑增敏同步熒光法檢測(cè)動(dòng)物性食品中頭孢拉定殘留量的報(bào)道。本研究將以探討頭孢拉定酸性降解反應(yīng)為開(kāi)端，過(guò)程中應(yīng)用表面活性劑對(duì)其進(jìn)行增敏，最后采用同步熒光法對(duì)動(dòng)物性食品中頭孢拉定殘留量進(jìn)行測(cè)定，以達(dá)到進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，建立一種便于日常跟蹤監(jiān)測(cè)的方法的目的。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)、AUW120D電子天平：日本島津；FE20型酸度計(jì)：瑞士梅特勒；Milli-Q Advantage A10超純化水機(jī)：法國(guó)密理博；TGL-20B高速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SK-1型快速混勻器：常州國(guó)華電器有限公司。

1.0mg/mL頭孢拉定標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取頭孢拉定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）0.1 g溶于水中，定容至100 mL棕色容量瓶中，并置于冰箱中避光冷藏保存。

硫酸，氫氧化鈉，醋酸，醋酸鈉，十二烷基硫酸鈉（SDS），十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），十六烷基三甲基氯化銨（CTAC），吐溫-20，吐溫-80，三羥甲基氨基甲烷（Tris），鹽酸，磷酸氫鈉，氫氧化鈉，碳酸鈉，碳酸氫鈉等試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2方法

1.2.1樣品預(yù)處理

1.2.1.1牛奶樣品前處理

取5 mL牛奶樣品于10 mL離心管中，加入3 mL乙腈快速渦旋混勻10 min，在5 000 r/min條件下離心30 min，吸取上清液作為待測(cè)樣品。

1.2.1.2豬肉樣品前處理

將市售豬肉切碎勻漿，取5 g置于10 mL的離心管中，加入3 mL乙腈快速渦旋混勻10 min，于8 000 r/min條件下離心60 min，取出上清液作為待測(cè)樣品。

1.2.1.3蝦樣品前處理

市售蝦處理方法同市售豬肉。

1.2.2樣品測(cè)定

3種樣品分別取1.0 mL置于編號(hào)1、2、3的3只具塞比色管中，在各管中依次加入1.5 mL 2.0 mol/L的硫酸溶液，加水定容至5 mL，沸水浴中加熱120 min后取出，用冰水迅速冷卻至室溫，然后加入2.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，然后加入Na2CO3-NaHCO3緩沖液調(diào)pH值到10.6，加入1 mL 5%的吐溫-20溶液，加水定容至10 mL，渦旋混勻1 min，避光放置2 min，將樣品溶液分別置于1 cm熒光比色皿中，在發(fā)射波長(zhǎng)λem420 nm～550 nm范圍內(nèi)，發(fā)射波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)的波長(zhǎng)差為90 nm（△λ=90 nm）條件下分別掃描樣品，在468 nm處讀出熒光強(qiáng)度。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

配置一系列不同濃度的頭孢拉定標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.2的實(shí)驗(yàn)條件測(cè)定，以頭孢拉定的濃度為橫坐標(biāo)，降解產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=450.83X+14.19（r=0.999 2）。結(jié)果表明：在0.02 μg/mL～2 μg/mL范圍內(nèi)，頭孢拉定濃度與降解產(chǎn)物熒光強(qiáng)度呈良好線性關(guān)系。

根據(jù)IUPAC（3δ）［18］的規(guī)定，由公式：D=3×δ/k（D為檢出限，k為工作曲線斜率，δ為11份空白溶液熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)差），求得檢測(cè)限為2.17 ng/mL。

1.2.4精密度和回收率

取市售牛奶9份，每份5 mL，按其濃度的80%，100%，120%，分別加入頭孢拉定對(duì)照品各3份，按照1.2.1.1的樣品前處理方法并按照1.2.2的樣品測(cè)定方法，測(cè)定平均回收率和精密度。

1.2.5穩(wěn)定性

將按照1.2.2方法處理好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液在避光條件下，分別在0、0.5、1、2、4、8、12、24 h內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，樣品熒光強(qiáng)度的RSD為0.7%。結(jié)果表明，頭孢拉定酸解產(chǎn)物在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2　結(jié)果與討論

2.1同步熒光分光光度法條件選擇

2.1.1降解介質(zhì)選擇

研究了頭孢拉定在不同降解介質(zhì)中的熒光強(qiáng)度。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　不同介質(zhì)降解產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度Table 1　Fluorescence intensities of cephradine’s degradation product in different degradation medium

試驗(yàn)證明：頭孢拉定在水介質(zhì)中只有少量的熒光物質(zhì)產(chǎn)生，在酸性和堿性介質(zhì)中熒光強(qiáng)度都明顯增強(qiáng)，酸性介質(zhì)中降解產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度明顯高于堿性介質(zhì)中降解產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度。

2.1.2波長(zhǎng)差（△λ）選擇

按照試驗(yàn)方法，在波長(zhǎng)差△λ分別為40、50、60、70、80、90、100、110、120 nm的條件下測(cè)定頭孢拉定酸解產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度。熒光掃描和同步熒光掃描光譜圖見(jiàn)圖1，同步掃描峰形變窄，有利于減少干擾，且靈敏度有所提高。

由測(cè)定結(jié)果可知，隨著波長(zhǎng)差的△λ的增加，頭孢拉定酸解產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度呈先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)，當(dāng)△λ=90 nm時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。所以選用△λ= 90 nm進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1　熒光與同步熒光光譜圖Fig.1　Fluorescence and synchronous fluorescence spectrum

2.1.3加熱時(shí)長(zhǎng)對(duì)熒光強(qiáng)度影響

取頭孢拉定標(biāo)準(zhǔn)溶液置于具塞比色管中，依照已建立的實(shí)驗(yàn)方法，考察不同加熱時(shí)間（30、45、60、90、120、135、150 min）下降解產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明：反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，降解產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度越大；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于120 min時(shí)，頭孢拉定的酸解產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，可認(rèn)為頭孢拉定已酸解完全。所以綜合考慮，沸水浴加熱時(shí)間選擇120 min。

2.1.4硫酸體積對(duì)熒光強(qiáng)度影響

取頭孢拉定標(biāo)準(zhǔn)溶液置于具塞比色管中，依照已建立的實(shí)驗(yàn)方法，考察2 mol/L硫酸體積（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL）對(duì)降解產(chǎn)物熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明：隨硫酸溶液用量增加，體系的熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，當(dāng)硫酸溶液的加入量超過(guò)1.5 mL時(shí)體系的熒光強(qiáng)度增加趨于平緩，所以實(shí)驗(yàn)選擇加入1.5 mL 2.0 mol/L的硫酸溶液。

2.1.5pH對(duì)熒光強(qiáng)度影響

按照已建立的方法，考察了醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.0）、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉（pH5.8、7.0、8.0），Tris-鹽酸緩沖液（pH 7.10、8.00、8.90），碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液（pH10.14、10.53）對(duì)降解產(chǎn)物熒光強(qiáng)度的影響見(jiàn)圖2。

圖2　pH值對(duì)頭孢拉定酸解產(chǎn)物熒光強(qiáng)度影響Fig.2　Effect of pH on fluorescence intensities of cephradine’s degradation product in acid medium

結(jié)果如圖2所示，隨著所用緩沖液pH值增大熒光強(qiáng)度有增大的趨勢(shì)，當(dāng)pH值為10.60時(shí)熒光強(qiáng)度最大；當(dāng)pH值超過(guò)10.60時(shí)，熒光強(qiáng)度隨pH值增大而減小。因此，試驗(yàn)選擇加入碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液將pH值調(diào)到10.60。

2.1.6表面活性劑對(duì)熒光強(qiáng)度影響

應(yīng)用表面活性劑可將被測(cè)分子包裹于膠束內(nèi)，使其避免因碰撞而發(fā)生無(wú)輻射去激，從而可提高熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度，因此，向反應(yīng)產(chǎn)物中加入表面活性劑以提高其靈敏度。試驗(yàn)中考察了不同表面活性劑（SDS、CTAB、CTAC、吐溫-80、吐溫-20）對(duì)頭孢拉定降解產(chǎn)物熒光強(qiáng)度（F）的影響，見(jiàn)圖3～圖4。

圖3　未增敏及吐溫-20增敏的頭孢拉定酸解產(chǎn)物同步熒光光譜圖Fig.3　Synchronous fluorescence Spectrum of cephradine’s degradation product in acid medium added Twain-20 and not

圖4　表面活性劑對(duì)頭孢拉定酸解產(chǎn)物熒光強(qiáng)度影響Fig.4　Effect of surfactant on fluorescence intensities of cephradine’s degradation product in acid medium

結(jié)果表明：向反應(yīng)體系中加入表面活性劑可使熒光強(qiáng)度明顯增大；試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)吐溫-20對(duì)頭孢拉定降解產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度的提高最為明顯。故選擇吐溫-20作為體系的增敏劑。

2.1.7吐溫-20體積分?jǐn)?shù)對(duì)熒光強(qiáng)度影響

表面活性劑對(duì)熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)作用與表面活性劑的濃度有關(guān)。因此，考察了體積分?jǐn)?shù)分別為0.5%、2.5%、5%、7.5%、10%時(shí)吐溫-20對(duì)頭孢拉定降解產(chǎn)物的增敏效果。結(jié)果顯示：當(dāng)吐溫-20體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，頭孢拉定酸解體系的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。所以試驗(yàn)選用吐溫-20溶液的濃度為5%。

2.2樣品測(cè)定

2.2.1樣品前處理?xiàng)l件選擇

取牛奶樣品適量，分別向其中加入乙腈，分別在3 000、5 000、6 000、7000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心各15、30、45、60 min。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)速5 000 r/min時(shí)離心30 min，牛奶中含有的蛋白等雜質(zhì)已基本沉淀完全，不會(huì)干擾測(cè)定。

對(duì)豬肉及蝦樣分別進(jìn)行了如上討論，結(jié)果表明：在轉(zhuǎn)速8 000 r/min時(shí)離心60 min，豬肉及蝦蛋白等雜質(zhì)已基本沉淀完全，不會(huì)干擾測(cè)定。

2.2.2精密度和回收率

按照1.2.4節(jié)中精密度和回收率的測(cè)定方法，平均回收率及精密度的結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）Table 2　Determination results of average recovery and RDS（n=3）

2.2.3測(cè)定結(jié)果

按照1.2.1節(jié)中的樣品前處理方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，按照1.2.2實(shí)驗(yàn)條件對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表3。

表3　樣品測(cè)定結(jié)果Table 3　Determination results of samples

3　結(jié)論

本研究探索建立了酸解吐溫-20增敏動(dòng)物性食品中頭孢拉定殘留量的同步熒光檢測(cè)方法。應(yīng)用硫酸酸解，加入吐溫增敏，在△λ為90 nm條件下同步掃描測(cè)定條件下，頭孢拉定在0.02 μg/mL～2.00 μg/mL范圍內(nèi)，其濃度與降解產(chǎn)物熒光強(qiáng)度呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 2，檢出限為2.17 ng/mL。加標(biāo)水平在0.4 μg/mL～0.6 μg/mL范圍內(nèi)，回收率為93.91%～96.90%。本文建立的方法選擇性好、精密度高、穩(wěn)定性好、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單；與已報(bào)道的研究相比［17］，靈敏度有了明顯提高。該方法可為動(dòng)物性食品中頭孢拉定藥物殘留檢測(cè)提供新方法，也能為食品中藥物殘留檢測(cè)研究提供新思路。

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Synchronous Fluorimetric Determination of Residue Cephradine by Acidly Degraded and Sensitized in Animal Food

LI Yue-qiu1，XU Lu-lu2，WU Jin-tao2，HAN Yuan-yuan1，DI Ke-qian1，LI Jun1
（1.Center of Medical Comprehensive Experimental，Center of Comprehensive Experimental，Hebei University，Baoding 071000，Hebei，China；2.Preventive Medicine and Health Management，Hebei
University，Baoding 071000，Hebei，China）

A new synchronous fluorescence spectrophotometry method was developed for the determination of trace cephradine in animal food.The method was based on the condition that Cephradine was degradated in acidic condition and fluorescence intensity of its degradation product was increased by Twain-20.The degradation condition and wavelength difference（△λ）were selected.The effects of heating time，the volume of sulfuric acid，pH，the effect of type and amount of surface active agent on the fluorescence intensity of degradation product were discussed.The results showed：1.5 mL 2.0 mol/L sulfuric acid was selected，heating time was 120 min，the buffer of Na2CO3-NaHCO3was used to increasing pH to 10.6，1 mL 5%Twain-20 solution was added.The standard and sample solution were putted into 1cm fluorescence cuvette，Synchronous fluorescence spectrums were scaned from 420 nm to 550 nm，△λ was 90，the fluorescence intensities were readed at 468 nm. The protein in food sample were precipitaded by acetonitrile.In the range of 0.02 μg/mL-2.00 μg/mL，the concentration of cephradine and the fluorescence intensity of its degradation product had good linearity，the correlation coefficients was 0.999 2，the detection limit was 2.71 ng/mL.At spiked levels of 0.40 μg/mL to 0.60 μg/mL，the recoveries were 93.91%to 96.90%，the relative standard deviation was 0.50%to 0.90%（n=3）.The new method could be used for residue cephradine in animal food.

cephradine；acid degradation；Twain-20 sensitization；animal food；synchronous fluorescence spectrophotometry

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.029

河北省省級(jí)科技計(jì)劃自籌經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（15275511）

李月秋（1977—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品有害污染物殘留分析。

2015-06-17