劉慧琳，陳曉默，穆琳，王靜（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京工商大學(xué)，北京100048）

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HPLC-MS/MS快速測定常見食品中羧甲基賴氨酸含量

劉慧琳，陳曉默，穆琳，王靜
（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京工商大學(xué)，北京100048）

采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS/MS）測定了幾種高蛋白食品中羧甲基賴氨酸（CML）的含量，包括：液態(tài)牛奶，奶粉，餅干，面包和蛋白類發(fā)酵食品——醬油。對樣品進(jìn)行還原、沉淀、水解以及除雜后上樣檢測，對固相萃取柱及洗脫液進(jìn)行了優(yōu)化，采用外標(biāo)法定量，HPLC-MS/MS的分析時間為25 min。其中醬油和餅干中CML的含量最高達(dá)到（385.59±7.73）mg/kg蛋白和（491.75±3.13）mg/kg蛋白，奶粉中CML的含量是最低的（45.66±2.89）mg/kg蛋白。

羧甲基賴氨酸；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；食品；含量測定

食品在加工和儲藏過程中，蛋白中的賴氨酸殘基與還原糖的羰基或者脂質(zhì)氧化產(chǎn)物形成晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）和晚期脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物（ALEs）［1-2］，包括羧甲基賴氨酸 ［Nε-（carboxymethyl）lysine，CML］，羧乙基賴氨酸，吡咯素，戊糖素等，其中研究最多的是CML。CML包括內(nèi)源性和食源性兩大類，膳食攝取的食源性CML是人體中CML的重要來源，動物實(shí)驗和臨床試驗表明CML在人體內(nèi)的積累和一些疾病如，腎病、阿茲海默癥、動脈粥樣硬化和人體的衰老密切相關(guān)［3-6］。因此人類日常膳食中CML的含量受到廣泛的關(guān)注，Assar等利用超高相液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-MS）測定了西方常見的食品中CML的含量［7］，Hull等利用UPLC-MS/MS技術(shù)測定了257中常見食物中CML的含量［8］。CML的定量檢測對指導(dǎo)人們減少食源性CML的攝入，進(jìn)而降低相關(guān)疾病的患病風(fēng)險有重要的意義。

常見的CML檢測方法包括酶聯(lián)免疫法（ELISA）［12］、高效液相色譜熒光檢測法（HPLC-FLD）［13］，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）［14］，和液相色譜法（HPLC）［15］，但是都存在不同程度的缺陷。ELISA法主要用于內(nèi)源性CML的測定，由于食品體系的化學(xué)組分復(fù)雜，會產(chǎn)生干擾，因此不適合用于食源性CML的測定。而HPLCFLD、GC-MS、HPLC法都需要進(jìn)行復(fù)雜的柱前衍生，操作繁瑣，靈敏度低，HPLC-MS法檢測樣品前處理過程簡單，不需要復(fù)雜的柱前衍生過程，而且保留時間穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。本文采用了HPLC-MS法檢測了國內(nèi)幾種常見的高蛋白食品中CML的含量。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

硼氫化鈉（純度≥98%）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；硼酸（純度≥99.5%）：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司；十水合四硼酸鈉、三氯乙酸、37%鹽酸、氨水、甲醇（純度≥99.5%）：均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所有待檢測的食品樣品均購自北京某大型超市；甲醇、乙腈、三氟乙酸（HPLC級）：購于北京百靈威科技有限公司。

UGC-24M氮吹儀：北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；KQ-700GVDV超聲波清洗器：昆山市超聲波清洗器；AL204萬分之一電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Tilli-Q超純水儀：山東萊索科技有限公司；QSE-24D固相萃取裝置：上海鑫翁科學(xué)儀器有限公司；Cleanert PCX-SPE、Cleanert S C18-SPE（60 mg/3 mL）：均購于天津博納艾杰爾科技有限公司；MCX混合陽離子交換固相萃取小柱（60 mg/3 mL）：美國Waters公司；安捷倫1260 infinity液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用：美國安捷倫公司。

1.2試驗方法

1.2.1游離態(tài)CML檢測樣品前處理

取一定量等同于2 mg蛋白當(dāng)量的樣品，固態(tài)樣品加入75%的甲醇（500 μL），液態(tài)樣品加入無水甲醇至甲醇最終的濃度為75%，10 000 r/min離心10 min后沉淀雜質(zhì)，然后過PCX固相萃取柱除雜，加5 mL甲醇（含5%氨水）洗脫，氮?dú)獯蹈珊笥? mL的超純水復(fù)溶，過0.45 μm水相膜，等待上樣。

1.2.2結(jié)合態(tài)CML檢測樣品前處理

參照Assar的前處理方法［7］，并做適當(dāng)?shù)男薷?。取一定量等同? mg蛋白當(dāng)量的樣品，加入硼酸鈉緩沖液（0.5 mol/L，pH 9.2），使其最終濃度為0.2 mol/L，混勻后加入硼氫化鈉還原（2 mol/L，用0.1 mol/L NaOH配制），使其濃度為0.1 mol/L，樣品在4℃下還原10 h。得到的溶液加入60%的三氯乙酸使得三氯乙酸的最終濃度為20%，10 000 r/min離心10 min以沉淀蛋白質(zhì)，獲得的蛋白用丙酮洗滌2次，沉淀后的蛋白加入1 mL，6 mol/L的HCl在110℃下水解24 h，然后氮?dú)獯蹈桑^PCX固相萃取柱除雜，洗脫液吹干后用2 mL的超純水復(fù)溶，過0.45 μm的水系膜，等待上樣。

1.2.3HPLC-MS檢測條件

1.2.3.1液相條件

液相模塊為安捷倫1260 Infinity二元液相色譜系統(tǒng)；色譜柱為InertsilODS-SP色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm，Shimadzu），進(jìn)樣量10μL，流動相速率0.2mL/min；柱溫30℃；運(yùn)行時間25 min；流動相A為含有0.1%三氟甲酸的高純水，流動相B為乙腈，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫參數(shù)如表1所示。

表1　梯度洗脫參數(shù)Table 1　Parameters for procedure of gradient elution

1.2.3.2質(zhì)譜條件

質(zhì)譜模塊為三重四級桿質(zhì)譜儀；儀器模式為電噴霧電離正離子模式（ESI+）；監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)控模式（MRM）；離子源溫度：300℃；霧化氣壓力：0.1 MPa；毛細(xì)管電壓：4 kV；MS1四級桿溫度：100℃；MS2四級桿溫度：100℃；MRM模式離子條件：m/z 205.0→m/z 84.0。

2　結(jié)果與討論

2.1固相萃取柱的選擇

比較了C18SPE小柱、PCX和MCX陽離子交換柱3種固相萃取柱對標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時間和洗脫效果，如表2所示（其中標(biāo)品中CML的含量為1 042 μg/L± 15.74 μg/L）。

表2　固相萃取柱的優(yōu)化Table 2　Optimization of solid phase extraction cartridges

由表2可知，其中C18小柱不能完全保留住CML，在上樣流出液中檢測出CML，而經(jīng)過PCX和MCX陽離子交換柱凈化后，保留效果好，最后基本被完全洗脫下來，回收率達(dá)到99%以上。因此本試驗選擇PCX陽離子交換柱。

2.2固相萃取柱洗脫液的優(yōu)化

比較了不同濃度的氨水甲醇洗脫液，包括甲醇（不含氨水）、甲醇（5%氨水）、甲醇（10%氨水）、甲醇（15%氨水）結(jié)果如表3所示。

表3結(jié)果表明，含5%氨水的甲醇的洗脫效果最好，因此本試驗使用的洗脫液為含有5%氨水的甲醇。

2.3流動相的選擇

分別用甲醇-水和乙腈-水作為流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇-水作為流動相時會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，如圖1所示，以乙腈-水作為流動相時峰型不佳，通過改變pH，提高離子化效率，改善峰型，試驗表明當(dāng)向超純水中加入0.1%三氟甲酸時，CML的出峰時間和峰型較佳如圖2所示。

表3　固相萃取洗脫液的優(yōu)化Table 3　Optimization of solid phase extraction eluents

圖1　甲醇-水作為流動相時的譜圖Fig.1　Chromatogram for methanol-water as eluent

圖2　乙腈-水（含0.1%三氟甲酸）作為流動相時的譜圖Fig.2　Chromatogram for acetonitrile-water as eluent

2.4CML標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取2 mg的CML用pH 7.0的磷酸緩沖溶液配制成1 000 μg/L的溶液，分別取2、1、0.5 mL的1 000 μg/L的溶液于容量瓶中，加入超純水定容至10 mL，搖勻得到200、100、50 μg/L的CML的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別從上述3種溶液中吸取1 mL的CML標(biāo)準(zhǔn)溶液溶液于10 mL容量瓶中配制成20、10、5 μg/L的CML的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用HPLC-MS法測定6種不同濃度CML的峰面積，如表4所示，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。

表4　峰面積積分值Table 4　Peak area integral value

由圖3可知，CML在5 μg/L～200 μg/L濃度范圍內(nèi)，峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)計算的回歸方程為Y=22.40x+38.24，R2=0.999。該方法的檢測限是5 ng/L，定量限是16.67 ng/L。

圖3　CML標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.3　The standard curve of CML

2.5常見高蛋白食品中CML的含量

蛋白質(zhì)和碳水化合物是AGEs形成的前體物質(zhì)，本文選取了國內(nèi)常見的幾種高蛋白食品作為研究對象，測定其中的CML的含量，結(jié)果見表5所示。

表5　幾種高蛋白食品中CML的含量Table 5　The content of CML in several high protein foods

從表5可以看出，醬油和餅干中的CML的含量較高，Chao等［2］也發(fā)現(xiàn)經(jīng)過醬油調(diào)味的肉制品的CML的含量要明顯高于未經(jīng)處理的肉制品，醬油中游離態(tài)CML含量很高，因為醬油是豆類發(fā)酵產(chǎn)品，在各種微生物的作用下大豆蛋白水解為多種游離的氨基酸。對于餅干類食品，由于餅干中蛋白質(zhì)、糖類和油脂含量較高，再加上高溫烘焙處理，所以餅干中CML的含量也較高。Assar等［7］利用UPLC-MS法測定了全脂和脫脂牛奶中CML的含量，結(jié)果表明全脂牛奶中CML的含量比脫脂的牛奶中CML的含量高（全脂牛奶的CML的含量為16.2 mg/kg蛋白，脫脂牛奶為10.4 mg/kg蛋白）。本試驗中脫脂牛奶比全脂牛奶中CML的含量高，原因可能因為脫脂牛奶中碳水化合物的含量較高所導(dǎo)致的。奶粉中的CML要比液態(tài)牛奶中CML的含量高，可能是由于奶粉的真空干燥過程產(chǎn)生了較多的CML，結(jié)果與Fenaille等的結(jié)果相同，F(xiàn)enaille等用GC-MS的方法測定了液態(tài)牛奶和粉末狀牛奶中CML的含量，結(jié)果表明，粉末狀牛奶的含量為212.4 mg/kg蛋白高于液態(tài)牛奶62.9 mg/kg蛋白［12］。Assar等［7］用U PLC-MS方法分別測定了面包皮和面包心的CML的含量，結(jié)果表明由于面包皮的高溫烘烤導(dǎo)致皮的CML的含量比面包心的高，考慮到食用的習(xí)慣，本研究將面包冷凍干燥后混勻測定整體的CML的含量，結(jié)果表明全麥面包中的CML的含量比白面包的量低，是因為全麥面包中還原糖的含量較低所導(dǎo)致。

3　結(jié)論

本研究對實(shí)際樣品中CML測定時前處理進(jìn)行了優(yōu)化，包括固相萃取柱的選擇，固相萃取柱洗脫液的優(yōu)化，以及流動相條件的優(yōu)化，在實(shí)際樣品檢測中選用了PCX陽離子交換小柱，選用含5%氨水的甲醇為洗脫液，利用HPLC-MS法測定CML的含量，流動相A為含0.1%三氟甲酸，流動相B為乙腈，采用梯度洗脫的方法，出峰時間穩(wěn)定在7.0 min左右，重現(xiàn)性好，適用于食品真實(shí)體系中的CML的含量，操作簡單，快速，為進(jìn)一步檢測多種國內(nèi)食品中的CML的含量提供技術(shù)依據(jù)，為后續(xù)食源性CML的抑制研究奠定基礎(chǔ)。

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Detection of Nε-（carboxymethyl）lysine in Foods by High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

LIU Hui-lin，CHEN Xiao-mo，MU Lin，WANG Jing
（Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health，Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives，Beijing Technology&Business University（BTBU），Beijing 100048，China）

High performance liquid chromatography-mass spectrometry（HPLC-MS/MS）was used to detect Nε-（carboxymethyl）lysine（CML）in several foods which contain high protein content，including liquid milk，powdered milk，biscuit，bread and soybean sauce.Samples were analyzed before pre-processing with sodium borohydride reduction，protein isolation，hydrolysis，and removing impurity.The optimization of different solid phase extraction cartridges and eluents in this study，and the analysis time of HPLC-MS/MS was 25 min.The CMLlevel in foods were as follows，soybean sauce and biscuit had the highest content，up to（385.59±7.73）mg/kg pro and（491.75±3.13）mg/kg pro，powdered milk had the least content，up to（45.66±2.89）mg/kg pro.

Nε-（carboxymethyl）lysine；high performance liquid chromatography-mass spectrometry；food；determination of content

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.024

國家自然科學(xué)基金（31501559；31571940）

劉慧琳（1987—），女（漢），講師，博士，研究方向：食品安全檢測。

2016-03-27