張翠忠，連　歡，張貞發(fā)，劉　璐,彭金云

(廣西民族師范學(xué)院，廣西　崇左　532200)

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單壁碳納米管修飾玻碳電極直接測(cè)定綠植中的槲皮素*

張翠忠，連歡，張貞發(fā)，劉璐,彭金云

(廣西民族師范學(xué)院，廣西崇左532200)

構(gòu)建了一種簡單的單壁碳納米管(SWNTs)修飾玻碳電極直接測(cè)定綠植中槲皮素的方法。不借助于酶，SWNTs電極對(duì)槲皮素催化氧化為醌表現(xiàn)出良好的伏安響應(yīng)。最優(yōu)條件下，槲皮素的線性范圍為1.5×10-6～1.3×10-5mol·L-1，檢出限為5.0×10-7mol·L-1(S/N=3)。該修飾電極靈敏性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性好、便于攜帶。并能用于測(cè)定實(shí)際樣品，獲得滿意的回收率。

單壁碳納米管；槲皮素；微分脈沖伏安法

隨著食品科學(xué)的迅速發(fā)展和人們消費(fèi)理念的轉(zhuǎn)變，含有天然活性成分的食品、化妝品和保健藥品已成現(xiàn)代人追求的目標(biāo)，而以純天然、高活性[1]等特性著稱的黃酮類化合物恰能滿足這一要求并受到人們的青睞。國內(nèi)外科研和臨床試驗(yàn)進(jìn)一步表明槲皮素兼具多種生物活性，尤其強(qiáng)氧化性[2]抗衰老，能防止低密度脂蛋白氧化，治療冠心病，抑制惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移等作用[3-5]。目前，檢測(cè)槲皮素的方法有高效液相色譜法[6]、光譜法[7]、毛細(xì)管電泳法[8-9]和電化學(xué)法[10-12]等。而電化學(xué)方法，因其儀器體積小方便現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、價(jià)格低廉易普及、分析速度快、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)得到廣泛應(yīng)用。

碳納米材料具有比表面積大、化學(xué)穩(wěn)定性高、催化能力強(qiáng)、生物兼容性好，尤其對(duì)生物小分子表現(xiàn)出超高的電催化活性，已被用于槲皮素的測(cè)定[13-15]，但是不一樣的分離純化方法得到的效果是不一樣的，本實(shí)驗(yàn)采用回流法純化碳納米管法，碳納米管經(jīng)酸處理可以在其表面和兩端引入許多含氧官能團(tuán)和表面缺陷，可為電化學(xué)反應(yīng)提供較多的活性點(diǎn)[16-17]，基于單壁碳納米管(SWNTs)對(duì)槲皮素良好的電催化作用，獲得了相對(duì)低的檢測(cè)限，利用該方法可直接分析食品或綠植中的槲皮素。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器和試劑

單壁碳納米管修飾玻碳電極(SWNTs/GCE)為工作電極，鉑柱電極為輔助電極、飽和甘汞電極為參比電極；CHI660D電化學(xué)分析儀，上海辰華儀器有限公司；AR224CN型電子天平，奧豪斯儀器上海有限公司；SD3200D超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；pHS-3C型pH計(jì)，上海今邁儀器儀表有限公司；掃描電子顯微鏡，德國卡爾蔡司公司(EVO MA 15/LS 15)。

槲皮素購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀[Fe(CN)6]3-/4-等均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次水。

1.2電化學(xué)測(cè)試

在小燒杯中加入7 mL pH=7.0的0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液(PBS)，安裝好三電極體系，以0.05 V·s-1的掃描速度在-0.1～0.5 V電位窗口內(nèi)重復(fù)掃描電極20圈至循環(huán)伏安曲線穩(wěn)定，增強(qiáng)其活性，活化該修飾電極。在緩沖溶液中加入一定量的槲皮素溶液，開路條件下攪拌富集150 s后，再進(jìn)行電化學(xué)的測(cè)試。所有的電化學(xué)測(cè)試均在室溫下進(jìn)行。

2　結(jié)果與討論

2.1SWNTs的電鏡表征

圖1為所觀察到的SWNTs的管狀結(jié)構(gòu)，可以清晰地看到SWNTs線條明顯，直徑僅6 nm左右。早在1991年研究者在高倍透射電鏡下觀察到碳納米管的導(dǎo)電性取決于管的正五邊形或六邊形的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與管的直徑，隨著管中網(wǎng)格的結(jié)構(gòu)和直徑的變化可是金屬型或半導(dǎo)體型[18-19]，當(dāng)管徑小于6 nm時(shí)，可以被看成是具有良好導(dǎo)電性的準(zhǔn)一維量子導(dǎo)線[20]。由于構(gòu)成碳納米管的碳原子基本上都處在表面位置，故其具有較大的比表面積，理論計(jì)算表明，碳納米管的比表面積在50～1315 m2/g的較大范圍內(nèi)變化，并且單壁碳納米管的比表面積比多壁碳納米管的大一個(gè)數(shù)量級(jí)[21]。

圖1　GCE(a)和SWNTs/GCE(b)的SEM形貌圖

2.2修飾電極(SWNTs/GCE)的電化學(xué)表征及電極有效面積的計(jì)算

圖2　兩種電極GCE(a)和SWNTs/GCE(b)在1 mmol·L-1[Fe(CN)6]3-/4-+0.1 mol·L-1KCl溶液中的循環(huán)伏安圖(A)和交流阻抗圖(B)

分別以裸玻碳電極(a)和SWNTs修飾電極(b)為工作電極，采用循環(huán)伏安法(CV)和交流阻抗(EIS)在1 mmol·L-1[Fe(CN)6]3-/4-+0.1 mol·L-1KCl溶液中進(jìn)行電化學(xué)掃描。如圖2(A)所示，探針分子在裸玻碳電極上的氧化還原峰的電位差為75 mV，而在SWNTs/GCE上的氧化還原峰的電位差為69 mV，峰電位減少了6 mV，電位差明顯的降低，這表明SWNTs/GCE可以有效的促進(jìn)探針分子[Fe(CN)6]3-/4-在電極表面的電子轉(zhuǎn)移；另一方面，發(fā)生在SWNTs/GCE電極上的氧化還原峰的峰電流明顯大于裸玻碳電極，這說明修飾電極能有效的促進(jìn)[Fe(CN)6]3-/4-探針分子在電極表面的傳遞速率。交流阻抗(EIS)是對(duì)電極表面的另一種有效表征工具。由圖2(B)可以看出，GCE的阻抗曲線出現(xiàn)一個(gè)小圓弧，這表明GCE具有較高的阻抗，電子轉(zhuǎn)移受到一定的阻礙，而當(dāng)玻碳電極表面修飾SWNTs后，其圓弧基本消失，幾乎呈一條直線，說明電荷轉(zhuǎn)移速率加快，阻礙解除，這也與循環(huán)伏安法的表征結(jié)果相吻合。

在[Fe(CN)6]3-/4-探針分子的可逆體系，可用方程計(jì)算電極有效面[22]。其中修飾后的電極面積是裸電極面積的1.33倍，提高了電子轉(zhuǎn)移的效率。以此類推，測(cè)定槲皮素，也會(huì)提高電子轉(zhuǎn)移的效率。

2.3槲皮素在裸玻碳電極和修飾電極上的循環(huán)伏安行為

圖3　兩種電極在空白底液和0.5 mmol·L-1槲皮素+0.1 mol·L-1PBS (pH=7.0)溶液中的循環(huán)伏安圖

CV考察了槲皮素在不同工作電極上的電化學(xué)行為，如圖3所示：在空白底液中，修飾電極和裸電極都沒有明顯響應(yīng)；而在0.5 mmol·L-1的槲皮素PBS(0.1 mol·L-1pH=7.0)緩沖液中，裸GCE和SWNTs/GCE電極都能產(chǎn)生一對(duì)氧化還原峰,但SWNTs/GCE電極的電化學(xué)響應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于裸玻碳電極，響應(yīng)電流約為裸玻碳電極的6倍，因?yàn)樘技{米管經(jīng)酸處理可以在其表面和兩端引入許多含氧官能團(tuán)和表面缺陷，可為電化學(xué)反應(yīng)提供較多的活性點(diǎn)[16-17]。當(dāng)SWNTs修飾電極對(duì)槲皮素測(cè)定槲皮素時(shí)，一般認(rèn)為在酸性較強(qiáng)的條件下(pH 1.81)棚皮素CV曲線的峰形較好，有兩個(gè)明顯的氧化峰，分別為 B環(huán)上的兒茶酚3’，4’-雙羥基供電子基團(tuán)發(fā)生的二電子和二質(zhì)子反應(yīng)，[23]但是當(dāng)pH接近中性時(shí)，只出現(xiàn)一對(duì)氧化還原峰，石慧霞等用密度泛函數(shù)探索出B環(huán)上的4’-OH活性貢獻(xiàn)最大[24]，所以經(jīng)酸處理過的碳納米管容易和槲皮素發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)式表示如下：

2.4緩沖溶液pH值的選擇

緩沖溶液的pH值是影響電極反應(yīng)過程的重要因素之一，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用CV考察了不同pH值對(duì)槲皮素的氧化峰電位和峰電流的影響。分別以pH為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0和9.0的PBS緩沖溶液作為底液，結(jié)果如圖4所示：槲皮素的氧化峰電流先是隨著pH值的增大而增大，在pH=7.0時(shí)，響應(yīng)值達(dá)到最大值，當(dāng)pH值超過9.0，槲皮素的氧化還原峰越變?cè)叫?，可能隨著堿性增大，槲皮素在電極表面的吸附逐漸減弱，直至氧化還原峰消失。所以，本實(shí)驗(yàn)選擇0.1 mol·L-1pH=7.0的PBS緩沖溶液作為底液。

圖4　不同pH值在SWNTs/GCE上對(duì)槲皮素氧化峰電流的影響

2.5掃描速度的影響

圖5　掃描速度對(duì)槲皮素氧化還原峰電流的影響

通常有關(guān)電化學(xué)反應(yīng)機(jī)理的有效信息我們可以從峰值電流和掃描速率間的關(guān)系來獲得。圖5(A)探究了在修飾電極上掃描速度對(duì)槲皮素的峰電流的影響，在0.02～0.16 V·s-1的掃描速度范圍內(nèi)，槲皮素的氧化峰電流和還原峰電流均呈明顯增大趨勢(shì)，與掃描速度成正比，并呈良好線性關(guān)系，線性方程為：Ipa=-0.68+184.71V(R2=0.9979)，Ipc=-2.29-180.9V(R2=0.9941)，如圖5(B)所示。這表明，在低掃描速度下，槲皮素在SWNTs/GCE修飾電極上的電化學(xué)過程是受吸附控制的。當(dāng)電子轉(zhuǎn)移受吸附控制時(shí)，富集能提高修飾電極的靈敏度。

2.6富集電位和富集時(shí)間的影響

采用DPV對(duì)0.5 mmol·L-1的槲皮素溶液的富集電位和富集時(shí)間的影響進(jìn)行了考察。如圖6所示，調(diào)整富集電位，從-0.3～0.2 V，槲皮素的氧化峰電流與在開路富集時(shí)的峰電流基本一致，幾乎沒有改變，這說明富集電位對(duì)槲皮素在修飾電極上的富集程度基本沒有影響；在開路富集的條件下，槲皮素在GR/GCE上的峰電流隨著富集時(shí)間的增加而增大，富集時(shí)間150 s時(shí)，其峰電流達(dá)到最大值，隨后增長緩慢，如圖7所示，這表明電極表面吸附了一定量的槲皮素，幾乎飽和，所以，本實(shí)驗(yàn)采用開路富集150 s作為最佳的富集條件。

圖6　富集電位對(duì)槲皮素氧化峰電流的影響；

圖7　富集時(shí)間對(duì)槲皮素氧化峰電流的影響

2.7微分脈沖伏安法測(cè)定槲皮素

配制一系列不同濃度的槲皮素溶液，并采用微分脈沖伏安法，進(jìn)行-0.1～0.4 V電位之間槲皮素的含量的測(cè)定，其結(jié)果如圖8所示。槲皮素的氧化峰電流與其的濃度在1.5×10-6～1.75×10-5mol·L-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。其線性方程為：Ip(μA)=-0.5242-1.018c(μmol·L-1)(R2=0.9995)，檢出限為5.0×10-7mol·L-1。它的高靈敏度主要是由于SWNTs材料提供了較大的有效活性面積，增加了槲皮素在電極表面的電子轉(zhuǎn)移速率和吸附量。

圖8　不同濃度的槲皮素在SWNTs/GCE上的DPV圖(A)和濃度與氧化峰電流的線性關(guān)系(B)

2.8樣品的測(cè)定

按照文獻(xiàn)[25]所用的方法對(duì)蘆丁進(jìn)行水解，并對(duì)水解產(chǎn)物槲皮素進(jìn)行測(cè)定。稱取30.00 mg蘆丁于燒杯中，加入10 mL 95%的乙醇和25 mL 6%的鹽酸，用沸水浴加熱1 h，冷卻后乙醇定容100 mL。從中取5 mL，用緩沖溶液定容50 mL，此時(shí)的濃度為45.1 μmol·L-1。取適量進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，平行測(cè)定5次，結(jié)果如表8所示。由表1可知，回收率在95.0%～101.0%之間，說明該修飾電極具有較高的準(zhǔn)確性。

表8　蘆丁水解產(chǎn)物中槲皮素的含量測(cè)定

2.9電極的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和確保檢測(cè)的精密度，我們對(duì)修飾電極的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)試。用同一根修飾電極平行測(cè)定5.0×10-4mol·L-1的槲皮素溶液8次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其峰形幾乎沒有改變，峰電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.572%。完成上述實(shí)驗(yàn)后，將這根修飾電極放置于冰箱中密封保存5天，5天后通過微分脈沖伏安法測(cè)定其氧化峰電流，與初始電極相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)槲皮素的氧化峰電流的響應(yīng)為原來的96.43%。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：多壁碳納米管修飾電極有著較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，其檢測(cè)結(jié)果是可靠的，所以該修飾電極可以用于對(duì)槲皮素的測(cè)定。

2.10干擾實(shí)驗(yàn)

3　結(jié)　論

本實(shí)驗(yàn)將純化的單壁碳納米管修飾玻碳電極用來檢測(cè)蘆丁中的槲皮素。通過電鏡表征SWNT形貌，借助交流阻抗法和循環(huán)伏安法表征其修飾在電極上的導(dǎo)電性能，并通過微分脈沖伏安法對(duì)槲皮素的含量進(jìn)行測(cè)定。其線性方程為：Ip(μA)=-0.5242-1.018c(μmol·L-1)(R2=0.9995)，檢出限為5.0×10-7mol·L-1，回收率在95.0%～101.0%。通過條件優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)，確定了最佳的實(shí)驗(yàn)條件。在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，槲皮素能被修飾電極檢測(cè)出來。由于該電化學(xué)傳感器制備簡單，響應(yīng)速度快，靈敏度高，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較好，所以SWNTs/GCE可被用來測(cè)定槲皮素。

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A Single Walled Carbon Nanotubes Modified Glassy Carbon Electrode for Direct Detection of Quercetin in Plants*

ZHANG Cui-zhong， LIAN Huan， ZHANG Zhen-fa， LIU Lu, PENG Jin-yun

(Guangxi Normal University for Nationalities, Guangxi Chongzuo 532200, China)

A direct electrochemical detection of quercetin based on Single Walled Carbon Nanotubes (SWNTs)modified glassy carbon electrode was demonstrated. SWNTs electrode showed a well-defined voltammetric response to catalyze the oxidation of quercetin to quinone without the need of an enzyme. Under optimum conditions, the determination range for quercetin was from 1.5×10-6～1.3×10-5mol·L-1with a low detection limit of 5.0×10-7mol·L-1(S/N=3). Moreover, this modified electrode also displayed excellent sensitivity, fine reproducibility, stability and easy preparation. To further study the practical applicability of real samples was carried out with satisfactory recoveries.

Single Walled Carbon Nanotubes(SWNTs); quercetin; Differential Pulse Voltammetry(DPV)

廣西民族師范學(xué)院校級(jí)項(xiàng)目(編號(hào):2012XYYB003)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.21465004)。

張翠忠(1981-)，女，講師，研究方向：光電化學(xué)。

O657.1

A

1001-9677(2016)01-0112-05