劉夢(mèng)姣，袁帶秀 ，聶　紅，黃　蓮，李翠琴

(吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南　吉首　416000)

?

杜仲總黃酮對(duì)鉛中毒小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響*

劉夢(mèng)姣，袁帶秀 ，聶紅，黃蓮，李翠琴

(吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南吉首416000)

研究了杜仲總黃酮對(duì)鉛中毒小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用，并探討其可能的作用機(jī)制。建立鉛中毒模型，用小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力；檢測(cè)脾臟和胸腺指數(shù)；生物化學(xué)法檢測(cè)腦組織中總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶(GSH-Px)、總體抗氧化酶(T-AOC)的活力和丙二醛(MDA)的含量。結(jié)果表明：杜仲總黃酮能改善鉛中毒小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；提高鉛中毒小鼠的脾臟和胸腺指數(shù)；提高腦組織中T-SOD、GSH-Px、T-AOC活力和降低MDA的含量。杜仲總黃酮對(duì)鉛中毒小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙有明顯的改善作用，其作用機(jī)制可能與杜仲總黃酮能提高機(jī)體的免疫能力和抗氧化能力有關(guān)。

杜仲總黃酮；鉛中毒；學(xué)習(xí)記憶；臟器指數(shù)；抗氧化

鉛是廣泛存在于自然界中的一種有毒重金屬，其在神經(jīng)系統(tǒng)蓄積后，可干擾腦細(xì)胞活動(dòng)，破壞神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，影響神經(jīng)系統(tǒng)的多種功能，特別是學(xué)習(xí)記憶功能[1]。鉛暴露能使細(xì)胞活性氧增加，破壞機(jī)體氧化/抗氧化動(dòng)態(tài)平衡，改變抗氧化酶活性及脂質(zhì)過(guò)氧化水平，從而導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷[2]。

杜仲又名木棉、思仙、思仲、思錦樹，為單科單屬落葉橋木，是第三世紀(jì)冰川運(yùn)動(dòng)遺留下來(lái)的“活化石”。杜仲中所含的化學(xué)成分按其結(jié)構(gòu)可分為木脂素類、環(huán)烯醚萜類、黃酮類、萜類、多糖類等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃酮類化合物具有良好的抗氧化活性，主要機(jī)理包括：一是作為自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)阻斷劑，二是作為金屬離子螯合劑[3]。而有關(guān)杜仲總黃酮對(duì)鉛中毒所導(dǎo)致的小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙有否改善作用，目前還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用鉛染毒模型，觀察杜仲總黃酮對(duì)鉛所致學(xué)習(xí)記憶損壞的改善作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，為臨床應(yīng)用杜仲總黃酮防治鉛中毒提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑

杜仲總黃酮(含黃酮83.61%)自制，臨用時(shí)用生理鹽水溶解；依地酸鈣鈉注射液，天津金耀藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；醋酸鉛(分析純)，天津博迪化工股份有限公司。

總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶(GSH-Px)、總體抗氧化酶(T-AOC)、丙二醛(MDA)、蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程公司。

1.2主要儀器

SDT-8M型跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司；邁瑞B(yǎng)C-300全自動(dòng)生化分析儀，武漢市百瑞醫(yī)療器械有限公司；TD5A臺(tái)式低速離心機(jī)，湖南凱達(dá)。

1.3動(dòng)物分組與給藥

健康的昆明種小鼠50只，雄性，體重18～22 g，清潔級(jí)，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。將小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為空白對(duì)照組；鉛染毒組(模型組)；CaEDTA組(陽(yáng)性對(duì)照組)；杜仲總黃酮治療組(高、低劑量分別為200、50 mg/kg)。模型制備：模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和杜仲總黃酮治療組每天腹腔注射70 mg/kg的Pb(AC)2溶液(10 mL/kg)，連續(xù)給藥8 d，復(fù)制鉛中毒模型；空白對(duì)照組每天腹腔注射等量的生理鹽水。模型復(fù)制完成后恢復(fù)3 d給藥：杜仲總黃酮治療組腹腔注射相應(yīng)劑量的杜仲總黃酮(10 mL/kg)；空白對(duì)照組與模型組腹腔注射10 mL/kg的生理鹽水；每天1次，連續(xù)給藥14 d；陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注80 mg/kg CaEDTA溶液(10 mL/kg)，每天1次，連續(xù)給藥10 d，第11 d開始每天腹腔注射等量的生理鹽水，連續(xù)給藥4 d。

1.4小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后1 h，對(duì)小鼠進(jìn)行跳臺(tái)訓(xùn)練，通過(guò)小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶功能。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將小鼠放在銅柵欄上，當(dāng)銅柵通電時(shí)，小鼠受到電擊而跳上平臺(tái)。如此訓(xùn)練5 min，并記錄每只鼠受到電擊的次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))，以此為學(xué)習(xí)成績(jī)。24 h后重新測(cè)驗(yàn)，此次測(cè)驗(yàn)時(shí)，先將鼠放在跳臺(tái)上，記錄第一次跳下的時(shí)間(潛伏期)，受電擊5 min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)，以此反映記憶保持情況。動(dòng)物每隔1天測(cè)試1次，每次5 min，共3次，記錄最后1次小鼠的潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)。

1.5小鼠免疫器官臟器指數(shù)檢測(cè)

跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)測(cè)試完后，將小鼠頸椎拉斷處死，摘取完整胸腺，并分離脾臟，去掉筋膜及脂肪組織，稱重(mg)，分別除以小鼠體重(g)，再乘以10，得到胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。計(jì)算公式如下：

胸腺指數(shù)或脾臟指數(shù)=( 胸腺或脾臟重量/小鼠體重)×10

1.6小鼠腦組織T-SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA含量的測(cè)定

小鼠頸椎拉斷處死后，迅速取出腦組織，以冰浴冷卻生理鹽水漂洗，除去血液，用濾紙擦干，取組織塊0.4 g，置于組織勻漿器中，加入冰浴冷卻的生理鹽水3.6 mL研磨成10%的組織勻漿液，迅速放入冷凍離心機(jī)，3000 r/min離心15 min，取上清液，依據(jù)試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)腦組織T-SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA含量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以±S表示，利用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，單因素方差分析，組間比較采用q比較。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

杜仲總黃酮對(duì)鉛染毒小鼠跳臺(tái)潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)的影響見(jiàn)表1。由表1可知，連續(xù)8d腹腔注射70 mg/kg醋酸鉛，可以導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，模型組與空白對(duì)照組相比較，小鼠在平臺(tái)上停留直至銅柵上的潛伏期縮短，差異極顯著(P<0.01)，錯(cuò)誤次數(shù)增加，但差異不顯著(P>0.05)；杜仲總黃酮治療組(200、50 mg/kg)可對(duì)抗鉛染毒所致小鼠記憶障礙，各治療組均可使小鼠在平臺(tái)上停留直至銅柵上的潛伏期延長(zhǎng)，與模型組相比差異具有顯著性(P<0.01)，而錯(cuò)誤次數(shù)具有減少的趨勢(shì)。

組別劑量/(mg·kg-1)潛伏期/s錯(cuò)誤次數(shù)空白對(duì)照組294.8±4.15b0.6±0.24模型組7032.40±6.94a3.2±1.93陽(yáng)性對(duì)照組80282.4±8.95b0.8±0.2杜仲總黃酮治療組200185.8±1.82ab1.4±0.2450106.4±7.24ab1.60±0.4

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

2.2杜仲總黃酮對(duì)鉛染毒小鼠免疫器官臟器指數(shù)的影響

與空白對(duì)照組比較，鉛染毒組即模型組脾臟、胸腺指數(shù)均降低，呈顯著性差異，說(shuō)明鉛染毒模型組小鼠免疫功能低下。與鉛染毒模型組相比，杜仲總黃酮各治療組脾臟、胸腺指數(shù)均升高，且差異顯著。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　杜仲總黃酮對(duì)鉛染毒小鼠免疫器官指數(shù)的影響

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.01，cP<0.05；與模型組比較，bP<0.01。

2.3杜仲總黃酮對(duì)鉛染毒小鼠腦T-SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA含量的影響

結(jié)果顯示，連續(xù)腹腔注射70 mg/kg醋酸鉛8 d，可以導(dǎo)致小鼠腦組織內(nèi)T-SOD、GSH-Px和T-AOC活性降低，而MDA含量增加；連續(xù)腹腔注射杜仲總黃酮治療14 d后，與模型組相比，杜仲總黃酮各治療組可升高T-SOD、GSH-Px和T-AOC活性，降低MDA含量(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3　杜仲總黃酮對(duì)鉛染毒小鼠腦T-SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA含量的影響

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

3　討　論

鉛是一種神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的有害物，它對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的正常發(fā)育以及神經(jīng)遞質(zhì)的正常分泌產(chǎn)生影響和損害，因而進(jìn)一步影響學(xué)習(xí)和記憶能力。從小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可知，小鼠經(jīng)過(guò)連續(xù)8 d腹腔注射70 mg/kg醋酸鉛，使得模型組的潛伏期縮短，錯(cuò)誤次數(shù)增加，學(xué)習(xí)記憶能力發(fā)生障礙，這與任振華等[1]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明建模成功。當(dāng)通過(guò)杜仲總黃酮治療后，小鼠的潛伏期延長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)減少，學(xué)習(xí)記憶能力提高。由此說(shuō)明，適當(dāng)劑量的杜仲總黃酮可以改善實(shí)驗(yàn)性鉛中毒小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

免疫器官的臟器指數(shù)是衡量機(jī)體免疫功能的初步指標(biāo)。脾臟和胸腺是機(jī)體主要的免疫器官，其臟器指數(shù)的高低能較為客觀地反映機(jī)體非特異性免疫能力。本試驗(yàn)通過(guò)連續(xù)給小鼠8 d腹腔注射70 mg/kg醋酸鉛，造成鉛中毒，發(fā)現(xiàn)小鼠的脾臟和胸腺指數(shù)均下降；經(jīng)過(guò)14 d的杜仲總黃酮治療后，各治療組的脾臟和胸腺指數(shù)均明顯升高。表明杜仲總黃酮對(duì)動(dòng)物免疫功能的增強(qiáng)作用可通過(guò)增加免疫器官質(zhì)量來(lái)體現(xiàn)。

SOD是機(jī)體直接清除自由基的抗氧化酶，可以分解過(guò)氧化氫和脂質(zhì)過(guò)氧化物，阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受損傷[4]。模型組小鼠中的鉛降低了質(zhì)膜對(duì)自由基的防御能力，消弱了細(xì)胞的抗氧化防御能力，導(dǎo)致了SOD活性降低[5]。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)杜仲總黃酮可以提高血清的SOD活性[6]，所以經(jīng)過(guò)杜仲總黃酮治療后，可能通過(guò)減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)達(dá)到抗氧化作用，直接或間接清除了鉛引起的自由基對(duì)腦組織造成的損傷，進(jìn)而學(xué)習(xí)記憶能力得到一定程度的恢復(fù)。GSH-Px是H2O2防御系統(tǒng)成員，可以清除活細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物，在保護(hù)細(xì)胞免受自由基損傷的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[7]。T-AOC代表體內(nèi)酶類和非酶類抗氧化物質(zhì)的總和，是反映機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)，其強(qiáng)弱與健康狀況和疾病狀態(tài)之間存在著密切的聯(lián)系，當(dāng)其降低時(shí)，會(huì)引起炎性反應(yīng)、腫瘤和免疫系統(tǒng)疾病等[8]。MDA是不飽和脂肪酸過(guò)氧化產(chǎn)物之一，其含量的高低常常反映機(jī)體組織內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。生物膜中的不飽和脂肪酸易被自由基攻擊而發(fā)生過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化，使得細(xì)胞的抗氧化能力下降。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)8 d腹腔注射70 mg/kg醋酸鉛，可使小鼠腦組織內(nèi)MDA含量顯著升高，GSH-Px、T-AOC活力顯著降低，而經(jīng)過(guò)杜仲總黃酮治療14 d后，小鼠腦組織內(nèi)MDA含量明顯降低，GSH-Px、T-AOC活力明顯升高，表明鉛可能通過(guò)損傷抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮毒性作用，杜仲總黃酮?jiǎng)t通過(guò)提高動(dòng)物體內(nèi)各種脂質(zhì)過(guò)氧化物酶的活性，達(dá)到解除鉛對(duì)抗氧化系統(tǒng)損傷的作用，從而達(dá)到拮抗鉛毒性作用。

總之，試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了鉛可以降低小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了杜仲總黃酮對(duì)鉛導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙有一定的改善作用，其機(jī)制可能與杜仲總黃酮能提高機(jī)體的免疫能力和和抗氧化能力有關(guān)。

[1]任振華,李光武.鉛對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶及自主活動(dòng)的影響[J].環(huán)境與健康雜志，2006，23(3):237.

[2]劉會(huì)芳,韓璇,郝俊生,等.川芎嗪注射液對(duì)鉛中毒小鼠學(xué)習(xí)記憶功能及抗氧化能力的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013,24(2):328-329.

[3]夏道宗,金相國(guó),陸超,等.高良姜總黃酮對(duì)鉛中毒致小鼠腦、腎氧化應(yīng)激的保護(hù)作用研究[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,37(8):1018-1021.

[4]方中允.自由基生物學(xué)的理論與應(yīng)用[M].北京：科學(xué)出版社，2002:133.

[5]Flerov MA，Shalyapina VG.Free-radical lipid oxidation in the brains of active and passive Rats during the development of post-stress depression[J].Neurosci Behau Physiol，2009,39(5):471-474.

[6]袁帶秀,舒麗霞,黃榮.杜仲總黃酮對(duì)荷瘤小鼠的抗腫瘤作用[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2014,19(12):1332-1335.

[7]帥學(xué)宏,胡庭俊,陳炅然,等.鬼臼多糖對(duì)小鼠免疫功能和抗氧化能力的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39(7):1000-1004.

[8]易金娥,屠迪,鄔靜,等.樺木酸對(duì)小鼠免疫器官抗氧化能力的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2012,24(4):786-789.

Effects of Total Flavonoids of Eucommia Ulmoides on Learning Memory Impairment Induced by Lead in Mice*

LIU Meng-jiao， YUAN Dai-xiu， NIE Hong， HUANG Lian， LI Cui-qin

(College of Medicine, Jishou University, Hunan Jishou 416000, China)

The effects of total flavonoids of Eucommia ulmoides on memory impairment in mice induced by lead acetate were investigated and its possible mechanisms were discussed. Mouse model of lead poisoning was established, the learning and memory ability was evaluated by jumping platform experiment, spleen and thymus index were detected, besides the content of T-SOD, GSH-Px, T-AOC and MDA in brain tissue was assayed. Results showed that the total flavonoids of Eucommia ulmoides could improve the learning memory ability and viscera index in mice induced by lead acetate, and it could also increase the activities of T-SOD, GSH-Px, T-AOC and reduce the content of MDA of mouse brain. The total flavonoids of Eucommia ulmoides had the function of improving learning and memory impairment obviously in mice induced by lead acetate. The effects may be due to increasing the immune function and anti-oxydation of lead poisoning mice.

total flavonoids of Eucommia ulmoides; lead poison; learning and memory; viscera index; anti-oxydation

吉首大學(xué)大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(2015)；2015年醫(yī)學(xué)類專業(yè)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(JDYXCX201514)；2015年吉首大學(xué)校級(jí)科研項(xiàng)目(15JDX016)。

劉夢(mèng)姣(1996-)，女，14級(jí)臨床本科生。

袁帶秀(1975-)，女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事民族藥物藥理活性研究。

R285

A

1001-9677(2016)01-0075-03