王敬華，張立芳，施國新，楊海燕

(1:南京師范大學生命科學學院, 南京 210023)(2:江蘇省中國科學院植物研究所，江蘇省生物多樣性與生物技術(shù)重點實驗室，南京 210023)

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鎳添加對水鱉(Hydrocharis dubia)葉片鎳和營養(yǎng)元素含量以及氧化脅迫和抗氧化系統(tǒng)的影響*

王敬華1，張立芳1，施國新1，楊海燕2

(1:南京師范大學生命科學學院, 南京 210023)(2:江蘇省中國科學院植物研究所，江蘇省生物多樣性與生物技術(shù)重點實驗室，南京 210023)

鎳；營養(yǎng)元素；氧化應(yīng)激；抗氧化系統(tǒng)；水鱉

隨著工業(yè)的迅速發(fā)展，大量磷肥的使用、鎳(Ni)礦的開采及電子材料的制造等，使進入水環(huán)境中的Ni呈逐年上升之勢，并且已成為污染水體的主要重金屬之一[1]. 水體中的重金屬不像有機化合物那樣可自然降解或被生物降解. 近年來，大多利用水生植物如香蒲 (TyphaorientalisPresl)[2]、水鱉(Hydrocarbonsdubia)[3]、鳳眼蓮(Eichhorniacrassipes)[4]、水生狐尾藻(Myriophyllumverticillatum)[5]等來吸收或吸附重金屬，但水體中達到一定濃度的重金屬會對植物產(chǎn)生毒害作用，影響植物的生理特性和光合作用. Ni近年來被確認為植物生長所必需的微量元素，它是某些酶(如脲酶、固氮酶、脫氫酶等)的組成成分[6]，這些酶都影響植物的生長發(fā)育，參與細胞的氧化還原過程. 天然淡水中Ni濃度約為0.5μg/L，海水中的濃度為0.66 μg/L. 不同工業(yè)廢水中Ni濃度差別很大，如鍍Ni工業(yè)廢水為2～900 mg/L，機器制造業(yè)廢水為5～35 mg/L，金屬加工業(yè)廢水為17～51 mg/L[7]. 低濃度的Ni可促進植物的生長，但過量的Ni會導致植物代謝紊亂，破壞光合作用，影響活性氧水平和抗氧化系統(tǒng)[8]. 盡管目前Ni 污染不如Cd、Hg、Pb 等元素嚴重，但由于Ni在環(huán)境中難遷移，一旦污染就很難改良、消除，加之Ni在植物體內(nèi)極易遷移的特殊性更加重了其危害性[9].

水鱉屬于單子葉綱水鱉科植物，生長在靜水池沼中，分布廣泛，江蘇省各地常見. 本文以水鱉為研究材料，探究添加不同濃度Ni對水鱉葉片中Ni元素及營養(yǎng)元素的吸收、光合色素含量、活性氧水平、抗氧化酶(SOD、CAT、POD)活性以及抗氧化物質(zhì)(維生素E、黃酮、谷胱甘肽(GSH)、非蛋白巰基(NP-SH)和非蛋白巰基(PCs))含量的影響，以期為進一步闡明Ni對高等水生植物毒害的生理機制提供參考依據(jù).

1　材料和方法

1.1實驗材料

水鱉于2014年9月中旬(溫度為18～25℃)采自南京江心洲(32°1′N，118°42′E)，周圍無污染源，選取長勢良好(根系粗壯、葉片鮮綠)的植株置于無底泥水缸用自來水馴化培養(yǎng)5天.

1.2實驗方法

1.2.1水鱉的實驗處理選取大小相似(植株長約15 cm)、生長狀況一致(無花、果的成熟植株)的水鱉，將這些植株分為5組，其中1組為對照(CK)組：用1/10 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)；其余4組為處理組，分別用含NiCl2濃度為0.05、0.10、0.15、0.20 mmol/L(預實驗表明此濃度梯度下，水鱉受害差異明顯)的1/10 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng). 材料處理期間，每2天更換一次營養(yǎng)液，培養(yǎng)室中，光暗周期比為16 h∶8 h，光照強度為240～300 μmol/(m2·s)，光照溫度為25℃∶18℃(L∶D). 實驗設(shè)置3次重復. 6 d后，用去離子水洗凈、揩干，取倒數(shù)第3葉(成熟葉片)進行各項生理指標的測定.

1.2.2Ni積累及營養(yǎng)元素含量的測定用10 mmol/L EDTA 清洗殘留在葉片表面的金屬離子. 將清洗干凈的葉片1.0 g用3∶1 HNO3/HClO4在 95℃下消化，直到消化液清澈為止. 消化后的殘留物在最小體積的7%鹽酸中溶解，用蒸餾水稀釋. 分解的樣品用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法分析Ni和營養(yǎng)元素(Ca、Mg、K、Fe、Mn)的含量.

1.2.3葉綠素和類胡蘿卜素含量的測定稱取0.2g葉片，用80%的丙酮冰浴研磨、離心，用分光光度計測定470、647和663 nm處的吸收度值，按Lichtenthaler[17]的公式計算光合色素含量.

1.2.5SOD、POD和CAT活性的測定稱取葉片0.5g，加入50 mmol/L磷酸緩沖液(pH值為7.8)，研磨，10000轉(zhuǎn)/min，4℃離心20 min，將上清液定容至5 ml，取部分上清液經(jīng)適當稀釋后用于酶活性測定. SOD活性測定采用NBT光化還原法[20]，以抑制NBT光還原50%所需的酶量為1個酶活性單位(U)；POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚方法[21]，以每分鐘OD470的變化為1個酶活性單位(U)；CAT活性測定采用鉬酸鹽方法[22]，以每分鐘分解1 μmol H2O2所需的酶量為一個酶活性單位(U).

1.2.6維生素E和黃酮含量的測定維生素E含量由中國南京建成生物工程研究所購買的試劑盒(貨號：A008)測定，單位為μg/g.

黃酮含量測定：參照韓國君等[23]的方法.(1)標準曲線制作：精確稱取蘆丁標品20 mg，加70%乙醇定容至100 ml，得到0.2mg/ml的標品溶液. 準確吸取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0 ml標準溶液， 分別放入50 ml容量瓶中，加入少量水， 再加入5%的NaNO21.4ml，搖勻，5 min后再加入0.3mol/L的AlCl31.4ml，搖勻，5 min后加入1 mol/L NaOH 4 ml，加水至刻度，搖勻，同時做空白對照. 在510 nm處測定吸光度；(2)水鱉黃酮含量的測定：將水鱉葉片冷凍干燥24 h，研磨成細粉，準確稱量0.1g，置于50 ml試管中，加入20 ml 70%乙醇，微沸至乙醇溶液蒸干，再加入20 ml 70%乙醇溶液，超聲提取1 h，過濾，獲得待測溶液. 準確吸取待測溶液1 ml、水1.4ml、5% NaNO30.4ml，搖勻，5 min后加入10% Al(NO3)30.4ml，搖勻，5 min后加入4.3% NaOH 4 ml、水2.8ml，放置15 min顯色，在510 nm處測分光光度值.

1.2.7GSH、NP-SH 和 PCs的測定(1)GSH含量采用Anderson[24]的方法測定.(2)NP-SH和PCs含量按照Ellman[25]的方法測定.(3)NP-SH與GSH含量之差即為PCs含量.

1.2.8總抗氧化能力(T-AOC )的測定T-AOC用從南京建成生物工程研究所購買的試劑盒(貨號：A015)測定，單位為U/g.

1.3統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果為3次實驗結(jié)果的平均值±標準差的形式，用Excel和SPSS 19.0 軟件完成原始數(shù)據(jù)處理和制圖. 各指標不同處理間進行單因素方差分析，P≥0.05 表示無顯著差異；P<0.05 表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著. 圖表中不同字母表示數(shù)值之間差異顯著(P<0.05)，相同字母之間表示差異不顯著. 用相關(guān)系數(shù)r表示相關(guān)性統(tǒng)計分析，其中P≥ 0.05為無顯著相關(guān)；P<0.05為顯著相關(guān)；P<0.01為極顯著相關(guān).

2　結(jié)果與分析

2.1Ni積累及營養(yǎng)元素含量變化

隨著Ni濃度的不斷增加，發(fā)現(xiàn)Ni含量在水鱉葉片中呈濃度依賴性地增加(表1). 相關(guān)性分析表明，水鱉葉片中Ni積累量與外界溶液中Ni濃度呈極顯著正相關(guān) (r=0.92，P<0.01) . 在0.20 mmol/L Ni處理時，水鱉葉片中Ni含量竟高達201.0 μg/g FW. 水鱉葉片中Ca、Mg含量受Ni濃度影響極顯著(rCa=0.96，P<0.01；rMg=0.95，P<0.01)，即隨著Ni濃度的提高，水鱉葉片中Ca、Mg含量逐步上升. 水鱉葉片中K含量隨Ni濃度增加有所上升，在0.15 mmol/L Ni處理時，K含量最高. 水鱉葉片中Fe含量與Ni濃度呈顯著負相關(guān)(rFe=-0.58，P<0.05)，即Fe含量隨Ni濃度增加而明顯下降. 水鱉葉片中Mn含量在低濃度時隨Ni濃度增加而上升，在0.15 mmol/L時達到最高，而在較高Ni濃度處理時Mn含量下降，但仍高于對照組.

2.2光合色素含量變化

Ni對葉綠素a(Chl.a)、葉綠素b(Chl.b)和類胡蘿卜素(Car)的抑制作用也隨Ni濃度的增加而增加 (圖1) . 光合色素含量和Ni濃度之間呈極顯著負相關(guān)(rChl.a=-0.98，P<0.01；rChl.b=-0.98，P<0.01；rCar=-0.97，P<0.01).

表1　不同Ni濃度添加處理對水鱉葉片Ni的積累和營養(yǎng)元素的影響

圖1 不同Ni濃度添加處理中水鱉葉片的光合色素含量Fig.1　The photosynthetic pigment content in Hydrocharis dubia leaves under different Ni treatments

受Ni濃度的影響，可溶性蛋白含量隨著濃度的上升顯著降低，呈極顯著負相關(guān)(r=-0.99，P<0.01 )(圖2d).

圖2 不同Ni濃度添加處理中水鱉葉片產(chǎn)生速率(a)、H2O2含量(b)、MDA含量(c)和可溶性蛋白含量(d)Fig.and soluble protein content(d) in Hydrocharis dubia leaves under different Ni treatments

2.4抗氧化酶活性變化

POD活性隨Ni濃度增加而逐漸增強，在0.20 mmol/L時達到最高，為對照組的1.52倍(圖3a). CAT活性隨Ni處理濃度增加而下降，呈顯著負相關(guān)(r=-0.95，P<0.05)(圖3b). 在0.05 mmol/L Ni處理時，SOD活性增加，是對照組的1.17倍；其后，SOD活性隨Ni濃度增加而下降(圖3c).

圖3 不同Ni濃度添加處理中水鱉葉片的抗氧化酶活性(a：POD活性；b：CAT活性；c：SOD活性) Fig.3　The activities of antioxidant enzymes in Hydrocharis dubia leaves under different Ni treatments(a: POD activity; b: CAT activity; c: SOD activity)

2.5維生素E和黃酮含量變化

維生素E含量隨Ni處理濃度增加而緩慢增加，呈顯著正相關(guān)(r=0.79，P<0.05)(圖4a). 黃酮含量隨Ni濃度升高而升高，在0.20 mmol/L Ni處理時有所下降，但仍高于對照組，是其1.26倍(圖4b).

圖4 不同Ni濃度添加處理中水鱉葉片的維生素E(a)和黃酮含量(b)Fig.4　The vitamin E(a) and flavonoid contents(b) in Hydrocharis dubia leaves under different Ni treatments

2.6GSH、NP-SH和PCs含量變化

水鱉葉片的GSH含量不受Ni處理的影響，變化不明顯 (圖5a). 而NP-SH含量隨Ni處理濃度增加而先升后降，在0.10 mmol/L Ni處理時達到最高值，為對照組的1.21倍(圖5b). PCs含量變化趨勢與NP-SH含量變化一致，同樣在0.10 mmol/L Ni處理時達到峰值，是對照組的1.33倍(圖5c).

圖5 不同Ni濃度添加處理中水鱉葉片的GSH(a)、NP-SH(b)和PCs(c)含量Fig.5　The GSH(a), NP-SH(b) and PCs(c) contents of Hydrocharis dubia leaves under different Ni treatments

2.7T-AOC變化

T-AOC隨Ni處理濃度先上升后下降，與Ni處理濃度呈顯著負相關(guān)(r=-0.83，P<0.05). 在0.05 mmol/L Ni處理時最大，為對照組的1.16倍. 在0.20 mmol/L Ni處理時最小，為對照組的77.5%(圖6 ).

圖6 不同Ni濃度添加處理中水鱉葉片的T-AOCFig.6　The T-AOC in Hydrocharis dubia leaves under different Ni concentrations treatments

3　討論

當水生植物從水體中吸收重金屬后，會在體內(nèi)積累，并通過食物鏈對高營養(yǎng)級的生物甚至人類造成危害. 在本研究中，Ni的累積呈濃度依賴性(表1)，說明水鱉植株內(nèi)Ni累積多少與水體中Ni濃度高低具有一致性，即水體中Ni濃度越高，水鱉植株體內(nèi)Ni累積得越多. 同時，Ni在水鱉植株內(nèi)的大量累積導致葉片中營養(yǎng)元素含量的變化，破壞植株內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的平衡，使活性氧大量積累，植株生長受阻，葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，嚴重者產(chǎn)生枯斑.

Ca、Mg、K等作為植物所必需的營養(yǎng)元素，在植物體內(nèi)對于滲透壓的調(diào)節(jié)、代謝平衡的維持、物質(zhì)的合成都有著不可或缺的作用，而重金屬的脅迫作用常會導致它們參與代謝過程的紊亂和功能的失調(diào). 較高濃度的重金屬能夠抑制植物體對Ca、Mg等礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收和轉(zhuǎn)運，但某些重金屬的處理也能提高植物體內(nèi)Ca、Mg等礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量[26]. 本實驗中Ca、Mg含量隨Ni處理濃度增加而上升，Ca、Mg礦質(zhì)營養(yǎng)的充足供應(yīng)有利于緩解重金屬的毒害作用，這種緩解作用可能是由于Ca離子以及其他鹽離子與重金屬離子競爭吸收運輸位點，導致重金屬離子吸收的減少所致[27-28]；另外，Ca、Mg離子的存在也有利于根系細胞維持正常的滲透系統(tǒng)，保證礦質(zhì)營養(yǎng)較少受到重金屬的脅迫作用. 因此，Ca、Mg含量的增加可能是水鱉對抗Ni脅迫的一種機制[15]. K在維持液泡滲透壓和細胞膨壓中起著重要作用. 以往研究表明，高濃度Ni處理導致K含量降低[29-30]，而本實驗中水鱉葉片中K含量隨Ni處理濃度增加而增加，與以往研究不同，可能與植物通過對K的吸收來提高細胞內(nèi)陽離子的有效濃度、在一定程度上緩解Ni毒性有關(guān)[31]. Fe是植物體必需的微量元素之一，存在于氧化還原中心蛋白中，對光合作用和細胞呼吸必不可少[32]. 重金屬脅迫能夠降低根系Fe還原酶的活性[33]，由于二價鐵是植物根系吸收的主要形態(tài)，根系還原酶活性的降低也就減少了植物根系對Fe的吸收. 本實驗中隨著Ni處理濃度的增加，水鱉葉片中Fe含量急劇減少，說明Ni處理降低了根系還原酶的活性[15]，同時，水鱉葉片中Mg含量增加、Fe含量下降，說明本研究中水鱉葉片失綠是由Fe元素的缺乏造成的. 本實驗中Mn含量先升高再降低，但始終高于對照組，與馬建軍等[29]用Ni處理小麥的研究結(jié)果相同，原因可能與Fe含量減少有關(guān)[34]. 此外，Mn本身就是重金屬，其含量增加可能會對植物產(chǎn)生一定的不良影響[35].

葉綠素是植物吸收太陽能、進行光合作用的重要物質(zhì)，其含量的高低在一定程度上反映了植株利用光能及制造有機物的能力. 葉綠素含量降低是重金屬對植物毒害的普遍現(xiàn)象. 本研究中水鱉葉片中葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量隨Ni濃度升高呈減少趨勢，且均與Ni濃度呈負相關(guān)，原因有兩點：一是Ni能取代葉綠素中心的Mg原子，破壞葉綠體結(jié)構(gòu)和功能，使葉綠素分解[36]；二是Ni脅迫條件下植株體內(nèi)ROS增多，葉綠體是ROS產(chǎn)生和攻擊的主要部位，從而引起葉綠素含量的減少. 葉綠素是植物進行光合作用所必需的，葉綠素含量減少必然導致植物光合作用降低，生長受阻，發(fā)育延遲.

通常，維生素E主要存在于綠色植物組織中，具有抗氧化劑和光合保護的功能，維生素E含量的增加代表了膜水平上植物為應(yīng)對ROS的大量產(chǎn)生而采取的一種保護反應(yīng)[46]. 黃酮是一種很強的抗氧化劑，其抗氧化機制是通過酚羥基與自由基反應(yīng)生成較穩(wěn)定的半醌式自由基，終止其鏈式反應(yīng)，從而有效清除體內(nèi)的活性氧自由基. 本試驗中，隨著Ni處理濃度的增加，維生素E和黃酮含量均有所增加，說明在水鱉中維生素E和黃酮對氧化脅迫產(chǎn)生應(yīng)激保護作用，這可能是水鱉對抗氧化酶活性下降的一種補償機制[47-48].

植物在受到重金屬脅迫時會產(chǎn)生低分子量、與有毒金屬親和性高的硫醇[49]，其中最重要的低分子量生物硫醇是GSH、NP-SH和PCs[50]. GSH可作為一種重要的巰基化合物結(jié)合細胞內(nèi)的重金屬，減輕重金屬對植物的毒害[51]. NP-SH代表含有S的氨基酸、谷胱甘肽和植物螯合肽等游離-SH基團，它的含量增加是重金屬解毒機制中一個重要的組分[52]. PCs是指植物體內(nèi)合成的一級結(jié)構(gòu)相似的一系列小分子多肽，對重金屬離子的螯合能力較強，因而在植物體內(nèi)對重金屬的累積和解毒過程發(fā)揮重要作用. 本實驗中，GSH含量并未隨Ni處理濃度的增加而發(fā)生顯著變化，與Tatyana等的研究結(jié)果相同[53]，說明GSH在減輕Ni添加引起的氧化傷害方面未起到積極作用. 處理組NP-SH的含量始終高于對照組，這與Cd和Hg處理的結(jié)果相同[54-55]，這可能是由于Ni處理促進了硫酸鹽還原途徑中的APS還原酶和絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性. PCs含量與對照組相比顯著增加，與Cr脅迫的結(jié)果一致，可能是水鱉受到Ni脅迫啟動了PCs合成機制，并在水鱉細胞中形成區(qū)室化，以減輕Ni對水鱉的毒害作用[56].

T-AOC是機體內(nèi)所有抗氧化物質(zhì)抗氧化能力的總和[57]. 本實驗中，T-AOC隨Ni處理濃度的增加而先上升后下降，表明水鱉在受到低濃度Ni脅迫時抗氧化保護系統(tǒng)中某些組分活性或含量出現(xiàn)應(yīng)激性上升，但當Ni處理濃度為0.10 mmol/L時，T-AOC下降，表明其細胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)被破壞，防御功能隨之喪失[58].

綜上所述，Ni脅迫引起水鱉體內(nèi)出現(xiàn)了氧化應(yīng)激反應(yīng)，導致活性氧大量積累、MDA含量明顯增加，光合色素和可溶性蛋白質(zhì)的含量顯著下降. 同時，水鱉體內(nèi)的抗氧化機制也受到Ni脅迫的干擾，只有抗氧化酶POD以及抗氧化物質(zhì)維生素E、黃酮、NP-SH和PCs含量上升，說明它們在水鱉的抗Ni脅迫過程中發(fā)揮著積極的作用. 水鱉的T-AOC在受到高濃度Ni脅迫時下降，說明Ni產(chǎn)生的毒害較強，破壞了水鱉正常的生理代謝.

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Effects of different Ni concentrations on the accumulation of Ni and nutrient elements, oxidative stress and antioxidant system in Hydrocharis dubia leaves

WANG Jinghua1, ZHANG Lifang1, SHI Guoxin1& YANG Haiyan2

(1:CollegeofLifeScience,NanjingNormalUniversity,Nanjing210023,P.R.China)(2:JiangsuKeyLabofBiodiversityandBiotechnology,JiangsuProvinceInstituteofBotany,ChineseAcademyofSciences,Nanjing210023，P.R.China)

Ni; nutrient elements; oxidative stress; antioxidant system;Hydrocharisdubia

J.LakeSci.(湖泊科學)， 2016， 28(3)： 599-608

10.18307/2016.0316

?2016 byJournalofLakeSciences

*江蘇高校優(yōu)秀學科建設(shè)工程項目(164320H106)資助．2015-05-20收稿；2015-09-27收修改稿.王敬華(1990～)，女，碩士研究生；E-mail: 502193302@qq.com.