錢(qián)麗紅

(無(wú)錫積大制藥有限公司，江蘇　無(wú)錫　214445)

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HPLC法測(cè)定利培酮中2-氨基吡啶殘留

錢(qián)麗紅

(無(wú)錫積大制藥有限公司，江蘇無(wú)錫214445)

采用HPLC法測(cè)定利培酮原料藥中2-氨基吡啶(具有潛在遺傳毒性)的殘留量。采用ODS-BP(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相為甲醇:醋酸鹽=40:60,梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm。利培酮及其基因毒性物質(zhì)2-氨基吡啶的線性范圍分別為0.08～1.5 μg/mL，平均回收率分別為97.8%。本法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠、適合于利培酮原料藥中2-氨基吡啶(具有潛在遺傳毒性)的殘留量的測(cè)定。

利培酮;HPLC法;基因毒性;殘留量

利培酮用于治療急性和慢性精神分裂癥，特別是對(duì)情感性抑郁癥有較好的療效[1-2]。2-氨基吡啶被認(rèn)為是具有潛在的遺傳毒性的物質(zhì)，而遺傳毒性雜質(zhì)的毒理學(xué)評(píng)估和藥物原料中此類(lèi)雜質(zhì)的可接受限度確定是難題，現(xiàn)有ICH Q3X指南中未充分說(shuō)明。常用遺傳毒性雜質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)差異很大，而數(shù)據(jù)庫(kù)是決定 (dictates)可接受限度評(píng)估所用方法的主要因素。當(dāng)運(yùn)用已建立風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法所需資料缺乏時(shí)，包括致癌性長(zhǎng)期試驗(yàn)資料或提供遺傳毒性閾值機(jī)制證據(jù)的資料等，采用毒理學(xué)擔(dān)憂(yōu)閾值(TTC)所定義的普遍適用方法。根據(jù)EMEA人用藥品委員會(huì)(CHMP)《遺傳毒性雜質(zhì)限度指導(dǎo)原則》[3]，對(duì)大部分藥物(Pharmaceuticals)，認(rèn)為T(mén)TC值為遺傳毒性雜質(zhì)攝入量1.5 μg/天時(shí)相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)可接受 (一生中額外的癌癥風(fēng)險(xiǎn)1/100000)。根據(jù)該閾值，藥物原料中2-氨基吡啶的允許水平可根據(jù)預(yù)計(jì)每日劑量計(jì)算得到，利培酮的日劑量為1.6 mg/天，計(jì)算的限度為93.75 ppm，為嚴(yán)格控制產(chǎn)品質(zhì)量，2-氨基吡啶所定的限度為90 ppm，于是本文建立了HPLC法測(cè)定利培酮中2-氨基吡啶殘留量的方法，方法簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確，靈敏。

1　儀器與試藥

高效液相色譜儀，色譜柱ODS-BP(4.6 mm×250 mm，5 μm),美國(guó)Agilent公司。

2-氨基吡啶對(duì)照品，無(wú)錫積大制藥有限公司(批號(hào)：130301)；甲醇(色譜純)，德國(guó)默克；水為密理博制備的超純水；其他試劑均為國(guó)藥分析純;利培酮(批號(hào)：130211)，無(wú)錫積大制藥有限公司。

2　方法與結(jié)果[4-5]

2.1溶液制備

2.1.1對(duì)照品溶液的制備

稱(chēng)取適量2-氨基吡啶對(duì)照品，精密稱(chēng)定，用甲醇溶解后定容，混勻，使成濃度為0.9 μg/mL的溶液。

2.1.2系統(tǒng)適用性溶液

稱(chēng)取適量利培酮樣品，精密稱(chēng)定，加入適量2-氨基吡啶對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，加甲醇配成2-氨基吡啶濃度0.9 μg /mL,利培酮濃度10 mg/mL的混合溶液。

2.1.3供試品溶液

稱(chēng)取適量利培酮供試品，精密稱(chēng)定，用甲醇溶解后定容，混勻，使成濃度10 mg/mL的溶液。

2.2色譜條件及系統(tǒng)適用性

采用ODS-BP(4.6 mm×250 mm，5 μm)液相色譜柱，流動(dòng)相組成為甲醇:醋酸鹽=40:60；梯度洗脫；進(jìn)樣體積：20 μL；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為UV290 nm；柱溫為35 ℃；運(yùn)行時(shí)間為30 min；稀釋液為甲醇。在本條件下，系統(tǒng)適用性溶液中2-甲基吡啶與相鄰峰之間分離度大于1.5，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖1　對(duì)照品儲(chǔ)備溶液圖譜

圖2　供試品溶液圖譜

圖3　系統(tǒng)適用性圖譜

2.3線性關(guān)系的考察

2-氨基吡啶貯備液：稱(chēng)取2-氨基吡啶對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，用甲醇溶解后定容，混勻，使成1.8 μg /mL的溶液。

線性溶液配制：分別精密量取2-氨基吡啶貯備液0.4 mL、0.5 mL、2.5 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.5 mL分別至10 mL 量瓶中，用甲醇溶解后定容，混勻，即為線性系列溶液。

分別精密吸取20 μL上述線性系列溶液注入液相色譜儀，記錄各線性系列溶液的峰面積， 以Y(峰面積)為縱坐標(biāo)，濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，線性回歸方程為y=49.908X-0.3249。

結(jié)果表明2-氨基吡啶濃度在0.07～1.5 μg/mL的線性范圍內(nèi)，峰面積與溶液的濃度呈線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.999。

2.4專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取本品，分別精密稱(chēng)定樣品100 mg利培酮置10 mL量瓶中分別加入0.5 M氫氧化鈉溶液1 mL、0.5 M鹽酸溶液2 mL、雙氧水(30%)各0.5 mL,分別放置1 h、2 h、0.5 h后，調(diào)節(jié)pH值至中性后，加入甲醇定容至10 mL，混勻，即為堿破壞、酸破壞和氧化破壞后的溶液，同時(shí)做空白試驗(yàn)。分別把1 g利培酮樣品放置于4500 LUX光照、高溫60 ℃和RH95%高濕的條件下，10天后，精密稱(chēng)定各破壞條件下的樣品100 mg利培酮，加甲醇定容至10 mL，混勻，即得強(qiáng)光、高溫和高濕破壞條件下的溶液。分別把上述6個(gè)破壞溶液各進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。結(jié)果2-氨基吡啶均未檢出,且各峰之間均達(dá)到基線分離,分離度均大于1.5。

取本品，分別精密稱(chēng)定樣品100 mg利培酮置10 mL量瓶中分別加入0.5 M氫氧化鈉溶液1 mL、0.5 M鹽酸溶液2 mL、雙氧水(30%)各0.5 mL,分別放置 h、2 h、0.5 h后，調(diào)節(jié)pH值至中性后，再分別加入2-氨基吡啶對(duì)照品溶液(0.09 mg/mL)0.1 mL后加甲醇定容至10 mL，混勻，即得堿破壞、酸破壞和氧化破壞后與2-氨基吡啶的分離度溶液，同時(shí)做空白試驗(yàn)。分別把1 g利培酮樣品放置于4500LUX光照、高溫60 ℃和RH95%高濕的條件下，10天后，精密稱(chēng)定各破壞條件下的樣品100 mg利培酮，再分別加入2-氨基吡啶對(duì)照品溶液(0.09 mg/mL)0.1 mL后加甲醇定容至10 mL，混勻，即得強(qiáng)光、高溫和高濕破壞條件下與2-氨基吡啶的分離度溶液。分別把上述6個(gè)破壞溶液各進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。結(jié)果2-氨基吡啶與破壞溶液中的各峰之間的分離度均大于1.5，均達(dá)到基線分離，結(jié)果表明本法專(zhuān)屬性良好。

2.5檢測(cè)限和定量限

取2.3“線性關(guān)系的考察”項(xiàng)下的線性系列對(duì)照品溶液，取最低濃度為0.7 μg/mL的對(duì)照品溶液，逐步稀釋?zhuān)⌒旁氡?S/N)為3的對(duì)照品圖譜作為檢測(cè)限圖譜，計(jì)算得出的檢測(cè)限為0.03 μg/mL; 取信噪比(S/N)為10的對(duì)照品圖譜作為定量限圖譜，連續(xù)進(jìn)樣6針，計(jì)算得出的定量限為0.07 μg/mL，峰面積RSD為2.6%。

圖4　檢測(cè)限圖譜

圖5　定量限圖譜

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取利培酮(批號(hào)：130211)的供試品溶液，于(0、4、8、12、24 h)分別進(jìn)樣20 μL，得到各時(shí)間點(diǎn)的色譜圖，分別記錄峰面積，計(jì)算5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的峰面積的RSD，結(jié)果利培酮峰面積的RSD為0.7%，且無(wú)生成新雜質(zhì)，表明利培酮供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

取2-氨基吡啶(批號(hào)：130301)的對(duì)照溶液，于(0、4、8、12、24 h)分別進(jìn)樣20 μL，得到各時(shí)間點(diǎn)的色譜圖，分別記錄峰面積，計(jì)算5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的峰面積的RSD，結(jié)果2-氨基吡啶峰面積的RSD為2.2%，且無(wú)生成新雜質(zhì)，表明對(duì)照溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7精密度試驗(yàn)

(1) 分別配制對(duì)照溶液和供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣對(duì)照品溶液和供試品溶液各6針，分別記錄對(duì)照溶液和供試品溶液的峰面積，計(jì)算對(duì)照溶液和供試品溶液峰面積的RSD，分別為1.2%、0.5%。

(2) 同一批利培酮樣品(批號(hào)：130211)進(jìn)行了不同人、不同儀器、不同天的測(cè)試，結(jié)果2-氨基吡啶的殘留均未檢出，RSD均為0。

精密度結(jié)果的RSD可接受標(biāo)準(zhǔn)為不得過(guò)10%，進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)后，結(jié)果均小于10%，表明本法精密度良好。

2.8準(zhǔn)確度(回收率)試驗(yàn)

配制供試品溶液9份，分別加入雜質(zhì)對(duì)照品貯備液配成含雜質(zhì)0.7 μg/mL(3份)、0.9 μg/mL(3份)、1.1 μg/mL(3份)的準(zhǔn)確度測(cè)試溶液，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度結(jié)果表明本法測(cè)試2-氨基吡啶的回收率良好。

3　討　論

(1)檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇:配制對(duì)照品溶液，使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，掃描顯示2-氨基吡啶的最大吸收波長(zhǎng)為290 nm，所以選取290 nm 作為檢測(cè)2-氨基吡啶的波長(zhǎng)。

(2)流動(dòng)相的選擇:進(jìn)行利培酮的溶解度測(cè)試后，結(jié)果表明利培酮在甲醇中溶解度較好，采用3種反向色譜條件進(jìn)行分離，流動(dòng)相分別為甲醇:醋酸鹽=40:60；甲醇:磷酸鹽=40:60；甲醇:水=40:60，3種反向色譜條件分別進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果第一種流動(dòng)相條件(甲醇:醋酸鹽=40:60)的分離度符合要求。

(3)取2.4“專(zhuān)屬性試驗(yàn)”項(xiàng)下的利培酮破壞性溶液進(jìn)行主峰峰純度檢查，使用二極管陣列檢測(cè)器在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，各破壞性溶液中的主峰峰純度均滿(mǎn)足檢測(cè)要求，結(jié)果表明本法能有效分離降解產(chǎn)物，不影響測(cè)定，可有效控制雜質(zhì)含量。

[1]中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所.化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)-藥品數(shù)據(jù)庫(kù)[S].

[2]陳新謙,金有豫,湯光.新編藥物學(xué).17版[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社,2003:261.

[3]Guideline CHMP/QWP/251344/2006.

[4]中國(guó)藥典2015附錄9101 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[S].

[5]ICH Q2.R1.Validation.Analytical.Procedures.

Determination of 2-aminopyridine Quantitative Determination of Risperidone by HPLC

QIANLi-hong

(Wuxi Jida Pharmaceutical Co., Ltd., Jiangsu Wuxi 214445, China)

An HPLC method for 2-aminopyridine(potential genotoxic)quantitative determination of riseperidone was established. The analytical column was HPLC ODS-BP(4.6 mm×250 mm,5 μm)column. The mobile phase was composed of methanol and acetate salt(40:60)at a flow rate of 1.0 mL/min. The wavelength of UV detector was 290 nm. The linear ranges of 2-aminopyridine was 0.08～1.5 μg/mL, the average recovery of riperidone was 97.8%. This method is rapid, accurate and reliable to determine the 2-aminopyridine content of risperidone.

risepridone; HPLC method; potential genotoxic; residue quantity

錢(qián)麗紅(1975-)，女，主要從事藥物開(kāi)發(fā)和分析。

R917

B

1001-9677(2016)012-0122-03