趙麗媛，曹佳佳，楊丹琦，肖情情，王亞男，孫　鑫，陳宏博，蘭　玲，張秀鳳

(華北理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，河北　唐山　063009)

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人血清白蛋白對(duì)菁染料超分子聚集體的調(diào)控研究*

趙麗媛，曹佳佳，楊丹琦，肖情情，王亞男，孫鑫，陳宏博，蘭玲，張秀鳳

(華北理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，河北唐山063009)

采用紫外吸收光譜和熒光光譜研究了菁染料MTC超分子聚集體與人血清白蛋白(HSA)之間的相互作用。研究表明在pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液中，MTC主要以J-聚集體的形式存在而非單體。當(dāng)HSA存在時(shí)，J-聚集體部分分解轉(zhuǎn)變?yōu)镠-聚集體。同時(shí)，MTC對(duì)HSA的內(nèi)源熒光有較強(qiáng)猝滅作用，猝滅機(jī)制屬于生成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅，二者結(jié)合常數(shù)為6.86×105M-1，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1。MTC的存在導(dǎo)致了色氨酸所處微環(huán)境極性增大，疏水性降低，肽鏈變得更加伸展。

人血清白蛋白；菁染料；聚集體；熒光猝滅

蛋白質(zhì)存在于所有的生物細(xì)胞中，是構(gòu)成生物體最基本的結(jié)構(gòu)和功能物質(zhì)，它參與了幾乎所有的生命過(guò)程。人血清白蛋白(Human Serum Album, HSA)是由585個(gè)氨基酸殘基組成的單肽鏈心形蛋白質(zhì)，分子量約66500，其中約67%的HSA為 α-螺旋結(jié)構(gòu)[1]。HSA主要存在于血漿和組織液中，其濃度達(dá)到了40 mg/mL。HSA可以儲(chǔ)存和運(yùn)輸許多內(nèi)源和外源物質(zhì)(小分子物質(zhì))，如膽紅素、脂肪酸、激素、陰陽(yáng)離子、藥物、染料、量子點(diǎn)和配合物等[2-3]。進(jìn)入生物體內(nèi)的藥物要通過(guò)血漿的儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)到達(dá)受體部位發(fā)揮藥效，所以從分子水平研究藥物小分子與蛋白質(zhì)的相互作用不僅有助于了解藥物的儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過(guò)程，也為高活性藥物小分子的設(shè)計(jì)和開發(fā)提供了有價(jià)值的信息。

菁染料作為一類熒光染料分子，由于其具有光譜范圍寬、摩爾消光系數(shù)高、高熒光量子產(chǎn)率等優(yōu)點(diǎn)[4]，因此它不僅在傳統(tǒng)的感光、光電領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，在生物醫(yī)學(xué)以及腫瘤治療方面也體現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。在溶液和一些基質(zhì)中，菁染料分子由于分子骨架及取代基的不同，通過(guò)分子間范德華力可以自發(fā)的形成多種狀態(tài)的超分子聚集體，能夠以單體、二聚體、H-聚集體和J-聚集體等多種形式存在。菁染料可以以蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子為模板進(jìn)行超分子組裝和調(diào)控，用菁染料聚集體設(shè)計(jì)成探針實(shí)現(xiàn)了對(duì)HSA可視化和熒光的雙重檢測(cè)。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1儀器和試劑

TU-1901型紫外可見吸收光譜儀，北京普析公司；F-7000型熒光光譜儀，上海葉拓儀器儀表有限公司。

菁染料MTC[3，3’-二(3-磺丙基)-4,5,4’,5’-二苯并-9-甲基-噻碳菁染料三乙胺鹽(C38H45N3O6S4)]按Hamer[5]和Ficken[6]建議的方法合成，使用前經(jīng)甲醇重結(jié)晶，質(zhì)量通過(guò)核磁共振、質(zhì)譜、紅外光譜和元素分析鑒定，結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1　MTC的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖

人血清白蛋白(HSA),生物試劑 Sigma公司；鹽酸(HCl,分析純),天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris),上海晶純生化科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)所用水均為超純水。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品的制備

實(shí)驗(yàn)所用Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.4，每升溶液中含有1.211 g Tris)。稱量一定量的菁染料MTC用少量甲醇溶解，再用Tris-HCl緩沖溶液稀釋到所需體積及濃度得到染料母液。準(zhǔn)確稱量一定量的HSA樣品直接用緩沖溶液稀釋成HSA母液，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱內(nèi)。將一定體積的人血清白蛋白母液和菁染料MTC溶液混合后用Tris-HCl緩沖溶液定容配制一系列不同濃度比的MTC和HSA混合溶液并搖勻，避光靜置2 h后進(jìn)行光譜試驗(yàn)。

1.2.2光譜實(shí)驗(yàn)測(cè)定

紫外可見吸收光譜：掃描波長(zhǎng)范圍為400～800 nm，掃描間隔為1 nm。

熒光光譜：實(shí)驗(yàn)中采用的激發(fā)光源為氘燈，激發(fā)波長(zhǎng)分別為280 nm和295 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為300～500 nm，掃描速度2400 nm/min，激發(fā)光與發(fā)射光的狹縫寬度均設(shè)為5 nm，電壓為400 V。

2　結(jié)果與討論

2.1MTC-HSA紫外吸收光譜分析

圖2　不同濃度的HSA對(duì)菁染料MTC的紫外可見吸收光譜

在濃度為10 mM的Tris-HCl緩沖溶液中，MTC主要以幾個(gè)或者多個(gè)染料分子中的疏水平面堆積在一起形成的J-聚集體形式存在。由圖2可知，將HSA加入到MTC自組裝形成的J-聚集體中，J-聚集體的吸收值逐漸降低，說(shuō)明J-聚集體逐漸分解，并以HSA 為模板組裝形成了H-聚集體。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)即使在高濃度HSA溶液體系中, J-聚集體的吸收峰值雖然較低，但并沒有完全消失，說(shuō)明J-聚集體也不能完全地轉(zhuǎn)化為H-聚集體。一般來(lái)說(shuō)，相鄰的菁染料單體分子間在范德華作用力下自組裝形成J-聚集體，同HSA相互作用時(shí)，由于靜電力和疏水作用力而被部分分解，然后以HSA為模板組裝成單體或H-聚集體。

2.2MTC對(duì)HSA的熒光猝滅

2.2.1熒光猝滅光譜

熒光光譜法是研究小分子配體與蛋白質(zhì)的相互作用的方法之一。通過(guò)熒光光譜研究，可以獲得蛋白質(zhì)與小分子之間結(jié)合作用的信息，如結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合常數(shù)、構(gòu)象變換及作用力類型等。HSA中因含有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸 (Phe) 三種芳香族氨基酸而屬于內(nèi)源性熒光物質(zhì)[7]。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm 時(shí)，熒光主要源自Trp和 Tyr殘基。而當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm時(shí)，蛋白質(zhì)熒光主要源自于Trp殘基。

由圖3可知，在溫度293 K，pH=7.4的條件下，隨著MTC濃度增大，用280 nm和295 nm波長(zhǎng)激發(fā)的HSA的熒光強(qiáng)度都逐漸降低，表明MTC和HSA發(fā)生了相互作用。同時(shí)，在295 nm激發(fā)狀態(tài)下，最大發(fā)射波長(zhǎng)明顯紅移，表明MTC與HSA發(fā)生了相互作用并且使色氨酸所處環(huán)境極性增大，疏水性降低，肽鏈的伸展程度變大，HSA分子構(gòu)象發(fā)生改變，MTC形成的J-聚集體是在HSA的疏水腔中進(jìn)行了聚集狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。

圖3　不同濃度的菁染料MTC對(duì)HSA(5 μM)的熒光發(fā)射光譜

2.2.2熒光猝滅機(jī)制

熒光猝滅是指熒光物質(zhì)與猝滅劑之間所發(fā)生的導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低的物理或化學(xué)作用。基于蛋白質(zhì)與小分子之間相互作用的熒光猝滅過(guò)程，可分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅兩種機(jī)制。靜態(tài)猝滅是指熒光體與猝滅劑通過(guò)疏水作用、靜電作用和氫鍵等弱作用力結(jié)合生成無(wú)熒光或熒光強(qiáng)度較低的復(fù)合物而導(dǎo)致熒光猝滅的過(guò)程。動(dòng)態(tài)猝滅是指猝滅劑和熒光體物質(zhì)間通過(guò)碰撞而使得熒光猝滅的過(guò)程。為證實(shí)MTC與HSA作用的熒光猝滅過(guò)程，將此過(guò)程按動(dòng)態(tài)過(guò)程處理，根據(jù)Stern-Volmer方程[8]：

(1)

式中：F0，F(xiàn)分別為單獨(dú)HSA和存在不同濃度MTC下熒光發(fā)射峰強(qiáng)度；Kq為生物大分子的熒光猝滅速率常數(shù)；τ0為無(wú)猝滅劑存在的情況下蛋白質(zhì)的熒光壽命(τ0=10-8s)[9]；[Q]為猝滅劑的濃度；Ksv為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)。

以F0/F對(duì)[Q]做線性回歸，可得到MTC與HSA作用的Stern-Volmer曲線(圖4)。根據(jù)猝滅曲線的斜率可得熒光猝滅常數(shù)Ksv和猝滅速率常數(shù)Kq分別為5.07×104M-1和5.07×1012M-1s-1，猝滅速率常數(shù)遠(yuǎn)大于熒光分子最大擴(kuò)散控制的碰撞猝滅速率常數(shù)2×1010M-1s-1，由此可知，菁染料MTC對(duì)HSA熒光猝滅過(guò)程不是因分子間碰撞而引起的動(dòng)態(tài)猝滅，而是非熒光復(fù)合物形成而產(chǎn)生的靜態(tài)猝滅過(guò)程。

圖4　MTC-HSA體系的Stern-Volmer方程擬合圖

2.2.3結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)的計(jì)算

由于MTC對(duì)人血清白蛋白的熒光猝滅是一個(gè)靜態(tài)猝滅過(guò)程，小分子與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n可由以下公式獲得:

(2)

式中，Ka為結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。以lg[(F0-F)/F]對(duì)lg[Q]進(jìn)行線性擬合，得到熒光猝滅的對(duì)數(shù)曲線(圖5)。由對(duì)數(shù)曲線的截距和斜率分別可得菁染料MTC與HSA作用的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n值分別為6.86×105M-1和1.24，表明菁染料HSA對(duì)MTC具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，n值近似等于1，說(shuō)明MTC與HSA形成1:1的復(fù)合物，MTC在人血清白蛋白上主要有一個(gè)特異性的結(jié)合位點(diǎn)。

圖5　不同濃度MTC對(duì)HSA熒光猝滅的對(duì)數(shù)曲線

3　結(jié)　論

采用紫外吸收光譜研究了HSA對(duì)MTC聚集體的調(diào)控作用，表明隨著HSA濃度的增大，MTC形成的J-聚集體逐漸分解并以HSA為模板組裝為H-聚集體。通過(guò)熒光光譜研究發(fā)現(xiàn)HSA對(duì)MTC有較高的親和力，MTC對(duì)HSA的熒光猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅過(guò)程。MTC在HSA上主要存在一個(gè)特異性結(jié)合位點(diǎn)，形成1:1的復(fù)合物。同時(shí)，MTC的加入導(dǎo)致了色氨酸所處微環(huán)境極性增大，疏水性降低，肽鏈的伸展程度變大，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更加疏松。

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Investigation on the Supramolecular Regulation of Cyanine Dyes by Human Serum Albumin*

ZHAOLi-yuan,CAOJia-jia,YANGDan-qi,XIAOQing-qing,WANGYa-nan,SUNXin,CHENHong-bo,LANLing,ZHANGXiu-feng

(College of Chemical Engineering, North China University of Science and Technology, Hebei Tangshan 063009, China)

The interaction of human serum albumin (HSA) and aggregation of cyanine dye MTC was studied using UV absorption and fluorescence spectroscopy. The research showed that MTC existed not as isolated monomer but rather in the formation of J-aggregation in the pH 7.4 Tris-HCl buffer system. In the presence of HSA, the J-aggregation was partially transformed into H-aggregation. Meanwhile, there was a strong fluorescence quenching of HSA by MTC. The quenching mechanism was a static quenching by forming the HSA-MTC complex. The binding constant Kaand the number of binding site were 6.86×105M-1and 1, respectively. The presence of MTC led to the hydrophobic nature around tryptophan residue of HSA become smaller, polarity would increase and the peptides became more stretched.

human serum albumin; cyanine dye; aggregation; fluorescence quenching

華北理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(2015HG03)。

趙麗媛(1994-)。女。

張秀鳳(1978-)，女，博士，華北理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院教授，研究方向?yàn)檩d藥體系研究。

O657.3

A

1001-9677(2016)012-0087-03