趙曉娟，張其美,2，曾景娣，白衛(wèi)東，陳海光

(1 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東　廣州　510225；2 廣州酒家集團(tuán)利口福食品有限公司，廣東　廣州　511442)

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特稿

氨芐青霉素鈉分子印跡傳感器的研制與應(yīng)用*

趙曉娟1，張其美1,2，曾景娣1，白衛(wèi)東1，陳海光1

(1 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州510225；2 廣州酒家集團(tuán)利口福食品有限公司，廣東廣州511442)

以氨芐青霉素鈉為模板分子，鄰苯二胺為功能單體，利用電聚合法在金電極表面形成聚鄰苯二胺膜，經(jīng)0.5 mol/L NaOH-乙醇混合溶液(VNaOH:V乙醇=4:1)將模板分子洗脫，制得氨芐青霉素鈉分子印跡傳感器。以K3Fe(CN)6為探針，建立了氨芐青霉素鈉的間接測(cè)定方法，并利用循環(huán)伏安法和方波伏安法對(duì)傳感器的電化學(xué)性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。該傳感器的方波伏安峰電流變化值與氨芐青霉素鈉濃度在1.0×10-6～9.0×10-6mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為6.4×10-7mol/L。

分子印跡；電化學(xué)傳感器；電聚合；氨芐青霉素鈉；聚鄰苯二胺

氨芐青霉素鈉(Ampicillin sodium，AMP)，又稱氨芐西林鈉，是一種廣譜半合成的β-內(nèi)酰胺類抗生素，具有較強(qiáng)的抗感染能力，廣泛用于治療敏感菌引起的奶牛感染性疾病。人們長(zhǎng)期食用含AMP殘留的牛奶及乳制品會(huì)產(chǎn)生耐藥性和過敏反應(yīng)。因此，檢測(cè)牛奶等食品中AMP的含量具有重要意義。

目前測(cè)定AMP的方法主要有光譜法[1-2]、色譜及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[3-4]、免疫分析法[5-6]和化學(xué)與生物傳感器法[7-8]等。其中，傳感器法由于具有靈敏快速、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。分子印跡聚合物(MIP)是一種具有良好選擇性的高分子仿生材料，近年來已被廣泛應(yīng)用于制備不同藥物殘留的分子印跡傳感器[9-10]，但目前關(guān)于AMP分子印跡傳感器的研究報(bào)道較少[11]。

本文以AMP為模板分子，鄰苯二胺(o-PD)為功能單體，在金電極(AuE)表面通過循環(huán)伏安法電聚合形成聚鄰苯二胺膜(PPD)，除去模板分子后得到AMP分子印跡膜電極(AMP-MIP/AuE)。以K3Fe(CN)6為探針，建立AMP的間接測(cè)定方法，并對(duì)市售牛奶樣品進(jìn)行分析。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1儀器與試劑

CHI 1030B型電化學(xué)分析儀，三電極系統(tǒng)：工作電極為AuE或AMP-MIP/AuE，參比電極為Ag/AgCl(飽和KCl溶液)電極，輔助電極為鉑絲電極，上海辰華儀器公司。

氨芐青霉素鈉和鹽酸金霉素，生工生物工程(上海)股份有限公司；頭孢氨芐，上海源葉生物科技有限公司；青霉素鉀和鹽酸強(qiáng)力霉素，廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；鄰苯二胺，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；鐵氰化鉀和乙酸，天津福晨化學(xué)試劑廠。所用試劑均為分析純。

所有溶液均用超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)配制。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1AMP分子印跡膜的制備

將金電極分別用粒徑為1.0、0.3、0.05 μm的α-Al2O3在專用絨毛墊上拋光，用超純水洗凈后，依次在1:1硝酸、無水乙醇和超純水中超聲清洗。將三電極體系置于含10 mmol/L o-PD、5 mmol/L AMP的0.20 mol/L HAc-NaAc(pH 5.2)緩沖溶液中，在0～0.8 V范圍內(nèi)循環(huán)伏安掃描20圈，在AuE表面形成包覆了AMP的聚鄰苯二胺膜(AMP-PPD/AuE)。將AMP-PPD/AuE置于0.5 mol/L NaOH-乙醇混合溶液(VNaOH:V乙醇=4:1)中浸洗15 min，得到AMP分子印跡膜電極(AMP-MIP/AuE)。除不加AMP外，非印跡膜電極(nMIP/AuE)與印跡膜電極的制備步驟完全相同。

1.2.2 檢測(cè)方法

循環(huán)伏安法(CV)測(cè)定條件：在含5.0 mmol/L K3Fe(CN)6的0.20 mol/L PBS(pH 7.0)中，于-0.2～0.6 V范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。掃描速率為100 mV/s。

方波伏安法(SWV)測(cè)定條件：將電極置于含5.0 mmol/L K3Fe(CN)6和一定濃度AMP的0.20 mol/L PBS(pH 7.0)中富集一定時(shí)間后，于-0.2～0.6 V范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。電位增量為4 mV，方波振幅為25 mV，方波頻率為15 Hz。

2　結(jié)果與分析

2.1分子印跡膜的電聚合

圖1　不含AMP(A)和含AMP(B)時(shí)o-PD的電聚合曲線

圖1A為o-PD在AuE表面的電聚合曲線，圖1B為含有AMP時(shí)o-PD的電聚合曲線。第一圈掃描時(shí)在0.4～0.5 V間出現(xiàn)了1個(gè)不可逆的氧化峰。隨掃描圈數(shù)的增加，該氧化峰的峰電流逐漸減小直至消失，表明在AuE表面逐漸形成不導(dǎo)電的PPD膜。比較圖1A和B可知，當(dāng)AMP存在時(shí)，o-PD的電聚合曲線沒有明顯變化，表明在AMP分子印跡膜形成過程中，聚合液中AMP的存在不會(huì)影響o-PD的電聚合。

2.2分子印跡膜制備條件優(yōu)化

2.2.1單體和模板分子的濃度及配比

AMP濃度為5 mmol/L時(shí)，按照o-PD與AMP的摩爾濃度比為1:1、2:1和3:1的配比制備印跡膜電極，研究不同配比時(shí)制備的AMP-MIP/AuE對(duì)K3Fe(CN)6的響應(yīng)電流值大小。結(jié)果表明，o-PD與AMP的摩爾濃度分別為10 mmol/L和5 mmol/L，即o-PD與AMP的摩爾濃度比為2:1時(shí)得到的AMP-MIP/AuE具有最高的響應(yīng)靈敏度，因此選擇單體與模板分子的摩爾濃度比為2:1。

2.2.2聚合圈數(shù)

印跡膜的厚度可通過電聚合時(shí)的掃描圈數(shù)(即聚合圈數(shù))進(jìn)行控制，而膜厚直接影響傳感器的電化學(xué)性能。對(duì)聚合15、20、25和30圈時(shí)制備的AMP-PPD/AuE中模板分子的洗脫時(shí)間和傳感器的響應(yīng)靈敏度進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聚合15圈時(shí)所得傳感器的測(cè)試重現(xiàn)性較差，主要原因是膜厚較小且穩(wěn)定性差；隨圈數(shù)的增加，傳感器的響應(yīng)電流增加，但同時(shí)膜厚增加，導(dǎo)致模板分子的洗脫時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)，因此選擇聚合圈數(shù)為20圈。

2.2.3模板分子的洗脫方法

將AMP-PPD/AuE和非印跡電極分別置于10%稀酸(硫酸、硝酸、鹽酸、乙酸)、0.5 mol/L NaOH和0.5 mol/L NaOH-乙醇混合溶液(VNaOH:V乙醇=4:1)中浸洗15 min。通過比較洗脫AMP后得到的AMP-MIP/AuE在K3Fe(CN)6溶液中的響應(yīng)峰型和峰電流的大小判斷洗脫效果，并通過非印跡電極的對(duì)照測(cè)試考察上述洗脫液對(duì)PPD膜結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，0.5 mol/L NaOH-乙醇混合溶液(VNaOH:V乙醇=4:1)對(duì)PPD膜的結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性無明顯影響，且對(duì)模板分子的洗脫效果較好。因此，選擇0.5 mol/L NaOH-乙醇混合溶液(VNaOH:V乙醇=4:1)作為洗脫溶液。

2.2.4模板分子的洗脫時(shí)間

考察洗脫不同時(shí)間時(shí)印跡電極對(duì)K3Fe(CN)6溶液的響應(yīng)情況。AMP-PPD/AuE在K3Fe(CN)6溶液中沒有出現(xiàn)明顯的氧化峰。隨洗脫時(shí)間的延長(zhǎng)，PPD膜中的AMP分子被逐漸洗脫下來，聚合膜中的特異性印跡孔穴的數(shù)量增加，K3Fe(CN)6在0.2 V處的氧化峰電流逐漸增大，洗脫10 min后電流值趨于穩(wěn)定，為保證模板分子洗脫完全，選擇15 min作為洗脫時(shí)間。

2.3分子印跡膜的表征

AuE、AMP-PPD/AuE和AMP-MIP/AuE在K3Fe(CN)6溶液中的循環(huán)伏安響應(yīng)如圖2A所示。K3Fe(CN)6在AuE上有一對(duì)可逆的氧化還原峰。當(dāng)在AuE表面電聚合形成AMP-PPD膜時(shí)，由于聚合膜自身的電惰性，K3Fe(CN)6分子不能到達(dá)電極表面，因此AMP-PPD/AuE無明顯的氧化還原峰。洗脫模板分子后，聚合膜中形成了與AMP分子結(jié)構(gòu)相匹配的印跡孔穴，這些孔穴可以作為傳質(zhì)通道使K3Fe(CN)6分子到達(dá)電極表面發(fā)生反應(yīng)，于是在AMP-MIP/AuE上出現(xiàn)了K3Fe(CN)6的氧化還原峰。

AMP-PPD/AuE、AMP-MIP/AuE和nMIP/AuE在K3Fe(CN)6溶液中的方波伏安響應(yīng)如圖2B所示。AMP-MIP/AuE在0.2 V處有1個(gè)明顯的K3Fe(CN)6氧化峰，而nMIP/AuE和AMP-PPD/AuE均沒有出現(xiàn)氧化峰，表明在電聚合過程中，AMP分子嵌入了PPD膜中，當(dāng)模板分子被洗脫后，聚合膜中形成了AMP的印跡孔穴，K3Fe(CN)6分子可以到達(dá)電極表面發(fā)生反應(yīng)，從而產(chǎn)生特征響應(yīng)峰。

圖2　不同電極在5.0 mmol/L K3Fe(CN)6溶液中的CV(A)和SWV(B)圖

2.4分子印跡膜的分析特性

2.4.1富集時(shí)間

研究了AMP-MIP/AuE在0.1 mmol/L AMP溶液中的富集時(shí)間對(duì)其在K3Fe(CN)6溶液中響應(yīng)電流的影響。隨富集時(shí)間的增加，K3Fe(CN)6的氧化峰電流逐漸減小，當(dāng)富集90 s時(shí)，峰電流趨于穩(wěn)定，表明AMP-MIP/AuE對(duì)AMP分子的吸附量達(dá)到穩(wěn)定，因此，AMP-MIP/AuE在AMP溶液中的最佳富集時(shí)間為90 s。

2.4.2選擇性

以3.0×10-6mol/L AMP溶液為對(duì)照，考察10倍濃度的頭孢氨芐、鹽酸金霉素、青霉素鉀和鹽酸強(qiáng)力霉素對(duì)測(cè)定AMP的干擾情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AMP-MIP/AuE在上述干擾物質(zhì)溶液中富集后，K3Fe(CN)6的特征峰電流沒有明顯變化，表明AMP-MIP/AuE對(duì)AMP具有良好的選擇性。

2.4.3重現(xiàn)性

用同一支AMP-MIP/AuE對(duì)3.0×10-6mol/L AMP溶液測(cè)定10次，測(cè)得K3Fe(CN)6氧化峰電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.1%。用5支金電極，按相同方法制備AMP-MIP/AuE，測(cè)定其對(duì)AMP溶液的響應(yīng)情況，K3Fe(CN)6氧化峰電流的RSD為3.4%。結(jié)果表明該印跡膜電極具有良好的測(cè)試重現(xiàn)性和制作重現(xiàn)性。

2.4.4穩(wěn)定性

將AMP-MIP/AuE浸入超純水中，于室溫放置保存，每隔一天對(duì)3.0×10-6mol/L AMP溶液測(cè)試一次，六天后響應(yīng)電流降至初始電流的90.7%，表明該印跡膜電極具有良好的穩(wěn)定性。

2.4.5線性范圍與檢出限

將AMP-MIP/AuE浸入不同濃度的AMP溶液中進(jìn)行富集，考察富集后K3Fe(CN)6的氧化峰電流與AMP濃度之間的關(guān)系(圖3)。隨AMP濃度的的增加，K3Fe(CN)6的氧化峰電流逐漸減小。以空白溶液為對(duì)照，氧化峰電流的變化值與AMP濃度在1.0×10-6～9.0×10-6mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：-ΔI=90.65 c+0.866(r=0.993)?；?倍的信噪比(S/N=3)，得到AMP的檢出限為6.4×10-7mol/L。

圖3　K3Fe(CN)6氧化峰電流變化值與AMP濃度的關(guān)系曲線(插圖為AMP-MIP/AuE測(cè)定不同濃度AMP溶液的SWV圖)

2.5實(shí)際樣品的測(cè)定

取購(gòu)自超市的新鮮脫脂牛奶2種，按照文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行前處理后，使用AMP-MIP/AuE進(jìn)行方波伏安法測(cè)試，結(jié)果均未檢測(cè)出AMP。對(duì)其中1種牛奶樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，測(cè)得加標(biāo)回收率為90.5%～108.3%，RSD小于5.2%，表明該檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際牛奶樣品中AMP含量的測(cè)定。

3　結(jié)　論

本研究以氨芐青霉素鈉為模板分子，采用電聚合鄰苯二胺的方法在金電極表面修飾氨芐青霉素鈉分子印跡膜，對(duì)分子印跡膜的制備條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)牛奶樣品中氨芐青霉素鈉殘留進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該分子印跡傳感器對(duì)氨芐青霉素鈉具有良好的選擇性，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，檢測(cè)速度快，適用于牛奶樣品中氨芐青霉素鈉的測(cè)定。

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Development and Application of Ampicillin Sodium Molecularly Imprinted Sensor*

ZHAOXiao-juan1,ZHANGQi-mei1,2,ZENGJing-di1,BAIWei-dong1,CHENHai-guang1

(1 College of Light Industry and Food Science, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangdong Guangzhou 510225; 2 Guangzhou Restaurant Group Likofu Food Co., Ltd., Guangdong Guangzhou 511442, China)

Ampicillin sodium was used as template molecule, o-phenylenediamine was used as functional monomer, poly(o-phenylenediamine) film was electropolymerized on the surface of a gold electrode. The ampicillin sodium molecularly imprinted sensor was obtained by eluting template molecules using the mixed solution of 0.5 mol/L NaOH and alcohol (4:1,VNaOH:Valcohol). Ampicillin sodium was determined indirectly based on potassium ferricyanide as electroactive probe. The electrochemical properties of the sensor were investigated using cyclic voltammetry and square wave voltammetry. The peak current changes in SWV had good linear relationship with the concentration of ampicillin sodium in the range of 1.0×10-6～9.0×10-6mol/L. The detection limit was 6.4×10-7mol/L.

molecularly imprinted; electrochemical sensor; electropolymerization; ampicillin sodium; poly(o-phenylenediamine)

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No: 21005091)；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No: S2013010013416)；廣東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計(jì)劃資助項(xiàng)目(No: Yq2013097)。

趙曉娟(1980-)，女，博士，副教授，主要從事電化學(xué)分析與食品安全檢測(cè)。

白衛(wèi)東(1967-)，男，碩士，教授，主要從事食品化學(xué)與食品添加劑。

O657.1

A

1001-9677(2016)012-0001-04