嚴(yán)偉彤，孫海峰，崔　毅，閆佳駒，閆　萍

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040；2.黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

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金絲草總黃酮的水提醇沉工藝優(yōu)化

嚴(yán)偉彤1，孫海峰1，崔毅2，閆佳駒1，閆萍1

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040；2.黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

采用正交試驗(yàn)法考察水提醇沉法中提取水倍數(shù)、提取次數(shù)、藥液濃縮比例和醇沉濃度4 個(gè)因素對(duì)金絲草總黃酮提取率的影響。以蘆丁為對(duì)照，通過可見分光光度計(jì)進(jìn)行總黃酮含量測定。結(jié)果表明：4種因素對(duì)總黃酮提取率雖然無顯著影響，但最佳提取工藝為10 倍水量提取3次，醇沉濃度為50%，藥液濃縮比例為1∶ 1，總黃酮提取率為4.894%。該提取工藝安全穩(wěn)定，簡便可行，為工業(yè)生產(chǎn)提供參考，也為金絲草黃酮類化合物的深入研究和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

金絲草; 總黃酮; 水提醇沉法; 提取工藝

金絲草(Pogonatherum crinitum)異名落蘇、貓尾草、黃毛草等，為禾本科金絲草屬植物金絲草的全草。根據(jù)中藥大辭典記載金絲草性寒，具有清熱涼血、利濕解毒，利尿之功效，民間常用來治療糖尿病，黃疸型肝炎，尿路感染等?？梢娊鸾z草具有廣泛的藥用價(jià)值。金絲草資源十分豐富，廣泛分布于浙江，福建，臺(tái)灣，云南等地。近年來對(duì)金絲草的研究發(fā)現(xiàn)，其中主要的活性成分為黃酮類化合物。而黃酮類化合物具有多種生物活性如具有心血管系統(tǒng)活性，抗菌及抗病毒、抗腫瘤、抗氧化自由基活性等[1]。但是目前對(duì)金絲草總黃酮的研究甚少，水提醇沉法是工業(yè)上提取黃酮類化合物的重要方法，目前未見利用該方法對(duì)金絲草中總黃酮類提取工藝的研究報(bào)道。

本研究以金絲草干燥全草為原料，利用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)水提醇沉法提取金絲草中總黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化，為金絲草資源的綜合開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與藥品

金絲草干燥全草，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)孫海峰教授鑒定，粉碎成粗粉備用; 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制劑品檢定所。亞硝酸鈉，氫氧化鈉，硝酸鋁，95%乙醇，以上試劑均為分析純。

1.2儀器

恒溫水浴箱：江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠。

721A型分光光度計(jì)：四川儀表九廠。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞容生化儀器廠。

電子分析天平：梅特勒-托利多上海有限公司。

其他：圓底燒瓶、冷凝管、燒杯、玻璃棒、量筒、布氏漏斗。

1.3方法

1.3.1正交設(shè)計(jì)

在金絲草水提醇沉過程中，影響水提醇沉工藝的因素主要是加水倍數(shù)(A)、提取次數(shù)(B)、藥液醇沉濃度(C),濃縮比例(D)。

為優(yōu)化各因素最佳工藝水平，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)[2]。采用L9(34)正交表安排試驗(yàn)方案，因素水平見表1，平行重復(fù)3次(n=3)

表1　水提醇沉正交試驗(yàn)的因素及水平

1.3.2試驗(yàn)方法

總黃酮的提?。悍Q取藥材10 g，按表1方案進(jìn)行加水，浸泡12h后，再進(jìn)行加熱回流提取，每次回流提取2 h，趁熱抽濾合并濾液; 按表1方案加乙醇進(jìn)行醇沉，靜置24 h，濾取醇上清液，減壓并濃縮回收乙醇，定容至100 mL，搖勻，得1～9 號(hào)樣品，待測。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

標(biāo)準(zhǔn)溶液制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[3]。

對(duì)照品制備：精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品5mg置50mL容量瓶中，加70%乙醇適量，置水浴上微熱使溶解，放冷，并加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得(每1mL中含蘆丁0.1mg)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取蘆丁對(duì)照品溶液1、2、3、4、5mL，分別置10mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置6min，加氫氧化鈉試液4mL，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15min后于510nm處測吸光度。

以濃度C為縱坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為橫坐標(biāo)進(jìn)行先行回歸，得方程Y=1.197X+0.0075，R2=0.9974，表明被測溶液濃度在0.1～0.5mg/mL線性關(guān)系良好。

1.3.4樣品溶液制備和黃酮含量的測定

將以上樣品溶液用乙醇稀釋(用當(dāng)前醇沉濃度)成濃度為0.1mg/mL，然后重復(fù)操作標(biāo)準(zhǔn)蘆丁樣品吸光度的測定步驟，得樣品的吸光值。將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算，得樣品總黃酮的提取率。

1.3.5驗(yàn)證性試驗(yàn)

考慮試驗(yàn)誤差因素，按正交試驗(yàn)確定的最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2　結(jié)果與分析

如上法得到總黃酮水提醇沉正交試驗(yàn)結(jié)果(表2)。為進(jìn)一步確定各因素對(duì)結(jié)果的影響，用Excel2013和正交助手軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表3) 。

由數(shù)據(jù)可知，各因素對(duì)總黃酮提取率的影響大小依次為C> A> B> D，D 因素在考察范圍內(nèi)影響最小。雖然各因素對(duì)提取率的影響水平不顯著，但從操作簡便，經(jīng)濟(jì)及生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，擬定最佳工藝條件為醇沉濃度為50%，提取3 次，加水量為10 倍量，藥液濃縮比例為1∶1 。最佳工藝條件的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果如表4 所示，總黃酮提取率為4.894%，均高于正交試驗(yàn)的其他各組數(shù)據(jù)，結(jié)果數(shù)據(jù)顯示優(yōu)選的工藝條件比較穩(wěn)定，實(shí)際操作也簡便可行。

表2　水提醇沉正交試驗(yàn)

表3　方差分析

注：F 臨界值=19

表4　重復(fù)試驗(yàn)

3　小結(jié)與討論

試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)的方法來對(duì)金絲草總黃酮水提醇沉的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

結(jié)果顯示，最佳工藝條件為10 倍水量加熱回流提取3 次，乙醇醇沉濃度為50%，藥液濃縮比例為1∶1。經(jīng)過重復(fù)試驗(yàn)該工藝提取總黃酮提取率達(dá)到4.894%。

在本實(shí)驗(yàn)中，乙醇醇沉這個(gè)因素對(duì)提取效率影響最大，所以在工業(yè)生產(chǎn)中對(duì)乙醇濃度應(yīng)嚴(yán)格控制。本工藝作為金絲草總黃酮提取的新工藝，可能會(huì)在工業(yè)生產(chǎn)上有良好的應(yīng)用前景。

[1] 曹緯國，劉志勤.黃酮類化合物藥理作用的研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào)，2003,23(12):2241-2247.

[2] 宋棋芬，高廣春.南湖菱殼總黃酮的水提醇沉工藝[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013(8):1029-1031.

[3] 孫海峰，楊婷.翻白草降血糖活性部位提取工藝的優(yōu)化研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2009,3(3):49-51.

2016-02-04

嚴(yán)偉彤(1990-)，女，黑龍江克山人，在讀碩士，研究方向：金絲草化學(xué)成分的研究。

孫海峰(1964-)，男，教授，中藥學(xué)博士，研究方向：中藥資源與開發(fā)研究。

S853.7

A文章編號(hào)：2095-9737(2016)04-0010-02