嚴偉彤，孫海峰，崔　毅，閆佳駒，閆　萍

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱 150040；2.黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

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金絲草總黃酮的水提醇沉工藝優(yōu)化

嚴偉彤1，孫海峰1，崔毅2，閆佳駒1，閆萍1

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱 150040；2.黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

采用正交試驗法考察水提醇沉法中提取水倍數(shù)、提取次數(shù)、藥液濃縮比例和醇沉濃度4 個因素對金絲草總黃酮提取率的影響。以蘆丁為對照，通過可見分光光度計進行總黃酮含量測定。結(jié)果表明：4種因素對總黃酮提取率雖然無顯著影響，但最佳提取工藝為10 倍水量提取3次，醇沉濃度為50%，藥液濃縮比例為1∶ 1，總黃酮提取率為4.894%。該提取工藝安全穩(wěn)定，簡便可行，為工業(yè)生產(chǎn)提供參考，也為金絲草黃酮類化合物的深入研究和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

金絲草; 總黃酮; 水提醇沉法; 提取工藝

金絲草(Pogonatherum crinitum)異名落蘇、貓尾草、黃毛草等，為禾本科金絲草屬植物金絲草的全草。根據(jù)中藥大辭典記載金絲草性寒，具有清熱涼血、利濕解毒，利尿之功效，民間常用來治療糖尿病，黃疸型肝炎，尿路感染等?？梢娊鸾z草具有廣泛的藥用價值。金絲草資源十分豐富，廣泛分布于浙江，福建，臺灣，云南等地。近年來對金絲草的研究發(fā)現(xiàn)，其中主要的活性成分為黃酮類化合物。而黃酮類化合物具有多種生物活性如具有心血管系統(tǒng)活性，抗菌及抗病毒、抗腫瘤、抗氧化自由基活性等[1]。但是目前對金絲草總黃酮的研究甚少，水提醇沉法是工業(yè)上提取黃酮類化合物的重要方法，目前未見利用該方法對金絲草中總黃酮類提取工藝的研究報道。

本研究以金絲草干燥全草為原料，利用正交設計試驗對水提醇沉法提取金絲草中總黃酮的工藝進行優(yōu)化，為金絲草資源的綜合開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與藥品

金絲草干燥全草，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學孫海峰教授鑒定，粉碎成粗粉備用; 蘆丁標準品購自中國藥品生物制劑品檢定所。亞硝酸鈉，氫氧化鈉，硝酸鋁，95%乙醇，以上試劑均為分析純。

1.2儀器

恒溫水浴箱：江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠。

721A型分光光度計：四川儀表九廠。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞容生化儀器廠。

電子分析天平：梅特勒-托利多上海有限公司。

其他：圓底燒瓶、冷凝管、燒杯、玻璃棒、量筒、布氏漏斗。

1.3方法

1.3.1正交設計

在金絲草水提醇沉過程中，影響水提醇沉工藝的因素主要是加水倍數(shù)(A)、提取次數(shù)(B)、藥液醇沉濃度(C),濃縮比例(D)。

為優(yōu)化各因素最佳工藝水平，設計正交試驗，以總黃酮提取率為評價指標[2]。采用L9(34)正交表安排試驗方案，因素水平見表1，平行重復3次(n=3)

表1　水提醇沉正交試驗的因素及水平

1.3.2試驗方法

總黃酮的提?。悍Q取藥材10 g，按表1方案進行加水，浸泡12h后，再進行加熱回流提取，每次回流提取2 h，趁熱抽濾合并濾液; 按表1方案加乙醇進行醇沉，靜置24 h，濾取醇上清液，減壓并濃縮回收乙醇，定容至100 mL，搖勻，得1～9 號樣品，待測。

1.3.3標準曲線測定

標準溶液制備及標準曲線繪制[3]。

對照品制備：精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁對照品5mg置50mL容量瓶中，加70%乙醇適量，置水浴上微熱使溶解，放冷，并加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得(每1mL中含蘆丁0.1mg)。

標準曲線的繪制：取蘆丁對照品溶液1、2、3、4、5mL，分別置10mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置6min，加氫氧化鈉試液4mL，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15min后于510nm處測吸光度。

以濃度C為縱坐標，吸光度值A為橫坐標進行先行回歸，得方程Y=1.197X+0.0075，R2=0.9974，表明被測溶液濃度在0.1～0.5mg/mL線性關(guān)系良好。

1.3.4樣品溶液制備和黃酮含量的測定

將以上樣品溶液用乙醇稀釋(用當前醇沉濃度)成濃度為0.1mg/mL，然后重復操作標準蘆丁樣品吸光度的測定步驟，得樣品的吸光值。將其代入標準曲線方程計算，得樣品總黃酮的提取率。

1.3.5驗證性試驗

考慮試驗誤差因素，按正交試驗確定的最佳工藝進行驗證試驗。實驗重復3 次。

2　結(jié)果與分析

如上法得到總黃酮水提醇沉正交試驗結(jié)果(表2)。為進一步確定各因素對結(jié)果的影響，用Excel2013和正交助手軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析(表3) 。

由數(shù)據(jù)可知，各因素對總黃酮提取率的影響大小依次為C> A> B> D，D 因素在考察范圍內(nèi)影響最小。雖然各因素對提取率的影響水平不顯著，但從操作簡便，經(jīng)濟及生產(chǎn)實際出發(fā)，擬定最佳工藝條件為醇沉濃度為50%，提取3 次，加水量為10 倍量，藥液濃縮比例為1∶1 。最佳工藝條件的重復性試驗結(jié)果如表4 所示，總黃酮提取率為4.894%，均高于正交試驗的其他各組數(shù)據(jù)，結(jié)果數(shù)據(jù)顯示優(yōu)選的工藝條件比較穩(wěn)定，實際操作也簡便可行。

表2　水提醇沉正交試驗

表3　方差分析

注：F 臨界值=19

表4　重復試驗

3　小結(jié)與討論

試驗采用正交試驗的方法來對金絲草總黃酮水提醇沉的提取工藝進行了優(yōu)化。

結(jié)果顯示，最佳工藝條件為10 倍水量加熱回流提取3 次，乙醇醇沉濃度為50%，藥液濃縮比例為1∶1。經(jīng)過重復試驗該工藝提取總黃酮提取率達到4.894%。

在本實驗中，乙醇醇沉這個因素對提取效率影響最大，所以在工業(yè)生產(chǎn)中對乙醇濃度應嚴格控制。本工藝作為金絲草總黃酮提取的新工藝，可能會在工業(yè)生產(chǎn)上有良好的應用前景。

[1] 曹緯國，劉志勤.黃酮類化合物藥理作用的研究進展[J].西北植物學報，2003,23(12):2241-2247.

[2] 宋棋芬，高廣春.南湖菱殼總黃酮的水提醇沉工藝[J].浙江農(nóng)業(yè)科學，2013(8):1029-1031.

[3] 孫海峰，楊婷.翻白草降血糖活性部位提取工藝的優(yōu)化研究[J].中醫(yī)藥學報，2009,3(3):49-51.

2016-02-04

嚴偉彤(1990-)，女，黑龍江克山人，在讀碩士，研究方向：金絲草化學成分的研究。

孫海峰(1964-)，男，教授，中藥學博士，研究方向：中藥資源與開發(fā)研究。

S853.7

A文章編號：2095-9737(2016)04-0010-02